6-芐氨基嘌呤對(duì)大鼠小腸缺血再灌注損傷的影響

劉玉梅 張自強(qiáng) 朱雪敏 位 蘭 石 珂 潘 麗

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽471023)

6-芐氨基嘌呤對(duì)大鼠小腸缺血再灌注損傷的影響

劉玉梅 張自強(qiáng) 朱雪敏 位 蘭 石 珂 潘 麗

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，洛陽471023)

本試驗(yàn)旨在研究6-芐氨基嘌呤(6-BA)對(duì)大鼠小腸缺血再灌注(I/R)損傷的保護(hù)作用。選取80只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組、I/R模型組和低、高劑量6-BA組。低、高劑量6-BA組于術(shù)前3周分別連續(xù)灌胃10、20 mg/kg的6-BA，對(duì)照組和I/R模型組灌胃同體積的生理鹽水，每天1次。對(duì)照組在暴露腸系膜上動(dòng)脈后不做阻斷；I/R模型組和低、高劑量6-BA組阻斷腸系膜血管30 min后再灌注60 min。隨后取大鼠空腸組織分別進(jìn)行總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量檢測(cè)；采用單細(xì)胞凝膠電泳法檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷程度，采用免疫組化法檢測(cè)半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3(Caspase-3)表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與I/R模型組相比，補(bǔ)充10、20 mg/kg的6-BA后，T-SOD、GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)；小腸細(xì)胞DNA的拖尾現(xiàn)象好轉(zhuǎn)，尾部DNA含量和拖尾率都顯著低于I/R模型組(P<0.05)；Caspase-3陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)。由此可見，10、20 mg/kg的6-BA能有效防護(hù)I/R對(duì)小腸的損傷，且20 mg/kg的6-BA作用效果尤為明顯。

6-芐氨基嘌呤；缺血再灌注；氧化損傷；凋亡

在眾多內(nèi)臟器官中，小腸對(duì)局部缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷最為敏感[1]。研究發(fā)現(xiàn)，小腸細(xì)胞極易受到局部缺血的影響，再灌注后會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致黏膜受損[2]。在急性腸系膜缺血，出血性、外傷性、感染性休克或者嚴(yán)重?zé)齻约耙恍┦中g(shù)操作如小腸移植術(shù)、腹主動(dòng)脈術(shù)等過程中常伴有I/R發(fā)生[3-4]。I/R不僅能夠?qū)е滦∧c本身的損傷，而且由于腸黏膜屏障的損壞也會(huì)引發(fā)全身性感染和多器官功能障礙[4-5]。由此小腸I/R損傷逐漸引起了研究者的關(guān)注。6-芐氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)是植物生長調(diào)節(jié)劑中細(xì)胞分裂素的一種，不僅被廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)、果實(shí)生長及蔬菜保鮮等[6]，而且能夠有效防御植物組織的氧化應(yīng)激。另外，本課題組前期研究證實(shí)6-BA對(duì)小鼠腦和肝臟組織氧化損傷具有一定的保護(hù)作用[7-8]。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)進(jìn)一步從氧化應(yīng)激、DNA損傷和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)等多角度考察6-BA對(duì)大鼠小腸I/R損傷的保護(hù)作用，以期為有效預(yù)防腸I/R損傷及動(dòng)物飼料中抗氧化劑的篩選提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑

6-BA由美國Sanland公司生產(chǎn)，用0.06 mol/L的鹽酸配制成1 000、2 000 mg/L的儲(chǔ)備液；丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性檢測(cè)試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性檢測(cè)試劑盒和考馬斯亮蘭試劑盒均由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。低熔點(diǎn)瓊脂糖購自美國Sigma公司；兔抗大鼠半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3(Caspase-3)單克隆抗體購自美國Abcam公司；免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物

選取80只雄性SD大鼠，購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)環(huán)境7 d后，隨機(jī)分為4組，每組20只。對(duì)照組、I/R模型組和低、高劑量的6-BA保護(hù)組。6-BA保護(hù)組于術(shù)前3周分別連續(xù)灌胃給予10、20 mg/kg的6-BA，每天1次；對(duì)照組和I/R模型組灌胃同體積的生理鹽水灌胃。動(dòng)物術(shù)前12 h禁食、不禁水。以3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)腹腔注射麻醉，固定后取腹正中切口，對(duì)照組在開腹暴露腸系膜上動(dòng)脈后不做阻斷；I/R模型組和6-BA保護(hù)組則用無創(chuàng)動(dòng)脈夾阻斷其系膜血管30 min后再灌注60 min。結(jié)束后，立即剪取空腸組織樣品待用。

1.3儀器

生物組織切片機(jī)(RM-2235，德國Leica)、分光光度計(jì)(UV-6300，上海美譜達(dá)儀器有限公司)、熒光顯微鏡(BX41TF，日本Olympus)、電泳儀(DYY-11，北京六一儀器廠)、電泳槽(DYCP-33A，北京六一儀器廠)。

1.4T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量測(cè)定

制作10%小腸組織勻漿，用生理鹽水稀釋成1%組織勻漿液后參照試劑盒說明，用紫外/可見分光光度計(jì)在550 nm處比色，測(cè)定吸光度值，計(jì)算T-SOD活性。取10%小腸組織勻漿用生理鹽水稀釋成0.8%的勻漿液后，參照試劑盒說明，用紫外/可見分光光度計(jì)在412 nm處比色，測(cè)定吸光度值，計(jì)算GSH-Px活性。取10%小腸組織勻漿用生理鹽水稀釋成5%勻漿液后通過硫代巴比妥酸(TBA)法參照試劑盒說明，用紫外/可見分光光度計(jì)在532 nm處比色，測(cè)定吸光度值，計(jì)算MDA含量。

1.5單細(xì)胞凝膠電泳法檢測(cè)大鼠小腸細(xì)胞DNA損傷

制作小腸單細(xì)胞懸液，保存?zhèn)溆谩?0 ℃、0.75%的正常熔點(diǎn)的瓊脂糖溶液100 μL鋪于全磨砂載玻片上放入37 ℃烘箱過夜烘干后作為底層膠；再取上述瓊脂糖溶液110 μL加在底膠上，水平放于4 ℃冰箱中保存20 min至凝固作為第2層膠；吸取70 μL制備好的單細(xì)胞懸液和140 μL在37 ℃水浴中保溫的0.65%的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液混勻，吸取混勻液110 μL滴加在第2層膠上，水平放于4 ℃冰箱中保存20 min至凝固作為第3層膠。將制備好的膠板浸入細(xì)胞裂解液，4 ℃裂解1 h，然后置于電泳槽中加入電泳液，4 ℃解旋25 min，電泳20 min(20 V，200 mA)。電泳結(jié)束后加入中和液中和15 min，然后滴加10 mg/L的溴化乙錠(EB)溶液40 μL，染色10 min。在暗室中用熒光顯微鏡觀察并拍照。每組隨機(jī)選取3張膠片，每張?jiān)?00倍下隨機(jī)選取8個(gè)視野，將彗星尾長>35 μm視為拖尾，采用CASP軟件測(cè)量各組細(xì)胞彗星尾部DNA含量、彗星尾長并統(tǒng)計(jì)拖尾率。

1.6免疫組化法檢測(cè)大鼠小腸凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3表達(dá)

采用免疫組化法檢測(cè)大鼠小腸組織切片中Caspase-3表達(dá)情況。參照免疫組化試劑盒，嚴(yán)格按照步驟進(jìn)行。一抗4 ℃過夜，以磷酸鹽緩沖液做陰性對(duì)照。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥。光學(xué)顯微鏡下觀察到組織細(xì)胞中出現(xiàn)黃色顆粒為陽性。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間差異顯著性采用Duncan氏法進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.16-BA對(duì)大鼠小腸I/R損傷后T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

6-BA對(duì)大鼠小腸I/R損傷后T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響見表1，與對(duì)照組相比，I/R模型組大鼠小腸T-SOD、GSH-Px的活性顯著降低(P<0.05)，小腸MDA含量顯著升高(P<0.05)，證實(shí)I/R模型構(gòu)建成功。低、高劑量6-BA組大鼠小腸T-SOD和GSH-Px活性顯著高于I/R模型組(P<0.05)，小腸MDA含量顯著低于I/R模型組(P<0.05)。高劑量6-BA組小腸MDA含量與對(duì)照組間無顯著差異(P>0.05)。

2.26-BA對(duì)大鼠小腸I/R損傷后細(xì)胞DNA損傷的影響

大鼠小腸I/R損傷后細(xì)胞DNA損傷程度見圖1，對(duì)照組細(xì)胞核大小比較均一，為圓形熒光團(tuán)，熒光強(qiáng)度均勻，邊緣光滑，未出現(xiàn)彗星狀拖尾；I/R模型組小腸細(xì)胞DNA損傷嚴(yán)重、彗星頭部較其他組變小，出現(xiàn)彗星狀尾巴；低、高劑量6-BA組小腸細(xì)胞DNA拖尾減輕，尾長減小。各組細(xì)胞尾部DNA含量和拖尾率見表2，與對(duì)照組相比，I/R模型組小腸細(xì)胞尾部DNA含量和拖尾率顯著升高(P<0.05)。與I/R模型組相比，低、高劑量6-BA組顯著降低尾部DNA含量和拖尾率(P<0.05)。

表1 6-BA對(duì)大鼠小腸I/R損傷后T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

Values in the same column with difference letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

A:對(duì)照組 control group；B:I/R模型組 I/R model group；C:低劑量6-BA組 low dose 6-BA group；D:高劑量6-BA組 high dose 6-BA group。

圖16-BA對(duì)大鼠小腸I/R損傷后細(xì)胞DNA損傷的影響

Fig.1 Effects of 6-BA on cell DNA damage of small intestine of rats after I/R injury (200×)

2.36-BA對(duì)大鼠小腸I/R損傷后Caspase-3表達(dá)的影響

6-BA對(duì)大鼠小腸I/R損傷后Caspase-3表達(dá)的影響見圖2。與對(duì)照組相比，I/R模型組大鼠小腸I/R損傷后小腸Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多；而低、高劑量6-BA組小腸Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)量少于I/R模型組，證實(shí)6-BA改善了小腸I/R誘發(fā)的損傷。

3 討 論

當(dāng)組織器官血液供應(yīng)不足時(shí)，常導(dǎo)致細(xì)胞機(jī)能障礙甚至發(fā)生壞死，然而血流的迅速恢復(fù)會(huì)進(jìn)一步加重器官的損傷程度，稱為I/R損傷。腸是機(jī)體內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素的最大儲(chǔ)存庫，當(dāng)I/R損傷引發(fā)腸屏障功能破壞后會(huì)引起一系列疾病的發(fā)生，如膿毒癥、全身炎癥反應(yīng)綜合征、大量器官機(jī)能障礙(肝臟、肺臟、腎臟等)，因此腸被認(rèn)為是引發(fā)機(jī)體器官系統(tǒng)異常的“馬達(dá)”[9]。盡管小腸I/R發(fā)生的詳細(xì)機(jī)制目前仍不明確，但是I/R能夠引發(fā)自由基形成、DNA損傷、線粒體膜電位去極化最終導(dǎo)致小腸細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死已得到了充分肯定[10]。半胱-天冬氨酸蛋白酶(Caspase)又稱為死亡蛋白酶，是細(xì)胞凋亡中最重要的蛋白酶，它直接水解激活與DNA斷裂等凋亡特征改變有關(guān)的蛋白，導(dǎo)致凋亡。其中，Caspase-3是參與凋亡的Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終效應(yīng)子，是細(xì)胞凋亡蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路[11]。因此，本試驗(yàn)通過檢測(cè)小腸中抗氧化酶活性、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量以及DNA損傷程度和Caspase-3蛋白表達(dá)來確定6-BA對(duì)小腸I/R損傷的預(yù)防作用。

表2 6-BA對(duì)大鼠小腸I/R損傷后細(xì)胞尾部DNA含量和拖尾率的影響

A:對(duì)照組 control group；B:I/R模型組 I/R model group；C:低劑量6-BA組 low dose 6-BA group；D:高劑量6-BA組 high dose 6-BA group。

圖26-BA對(duì)大鼠小腸I/R損傷后Caspase-3表達(dá)的影響

Fig.2 Effects of 6-BA on Caspase-3 expression of small intestine of rats after I/R injury (400×)

本試驗(yàn)通過阻斷腸系膜血管30 min再灌注60 min構(gòu)建小腸I/R模型，發(fā)現(xiàn)其DNA損傷嚴(yán)重，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量顯著增加，證實(shí)了小腸對(duì)I/R的高度敏感性。再通過抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物含量的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)小腸I/R損傷與自由基有關(guān)。6-BA能夠抑制植物葉內(nèi)葉綠素、核酸、蛋白質(zhì)的分解，保綠防老；能將氨基酸、生長素、無機(jī)鹽等向處理部位調(diào)運(yùn)，具有穩(wěn)定、廉價(jià)和易于使用等特點(diǎn)，且是一種對(duì)人、畜安全的植物生長調(diào)節(jié)劑，因此廣泛用在農(nóng)業(yè)、果樹和園藝作物從發(fā)芽到收獲的各個(gè)階段。資料表明，許多植物生長調(diào)節(jié)劑不但能夠促進(jìn)植物的生長而且還能預(yù)防動(dòng)物組織的氧化損傷和抵抗衰老。如，6-糠氨基嘌呤能夠抑制動(dòng)物肝臟[12]和卵巢[13]等組織器官的氧化應(yīng)激，甚至能夠提高衰老大鼠的免疫功能[14]。而6-BA化學(xué)結(jié)構(gòu)與6-糠氨基嘌呤十分相似，且其在植物方面的抗氧化損傷和抗衰老的作用非常顯著，是否6-BA也對(duì)動(dòng)物組織具有抗氧化能力，目前未見報(bào)道。由此本實(shí)驗(yàn)室前期通過給小鼠腹腔注射四氯化碳(CCl4)制作小鼠肝臟氧化損傷模型，并預(yù)先采用6-BA進(jìn)行保護(hù)，結(jié)果證實(shí)6-BA能夠有效抑制CCl4誘發(fā)的小鼠肝臟抗氧化酶活性降低和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的積累[8]。鑒于腸I/R損傷與氧化應(yīng)激的關(guān)系，本試驗(yàn)又進(jìn)一步檢測(cè)了6-BA對(duì)小腸I/R損傷的保護(hù)作用。結(jié)果證實(shí)，6-BA能夠有效抑制大鼠I/R發(fā)生過程中出現(xiàn)的抗氧化酶活性降低、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物積聚、DNA損傷和小腸細(xì)胞形態(tài)病變。這些結(jié)果提示，一定劑量的6-BA對(duì)大鼠小腸I/R損傷具有一定的保護(hù)作用。這為研發(fā)抗小腸I/R損傷的活性物質(zhì)提供了新思路，但詳細(xì)機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

① 10、20 mg/kg的6-BA可有效降低小腸I/R誘發(fā)的過氧化應(yīng)激損傷。

② 10、20 mg/kg的6-BA可有效降低小腸I/R誘發(fā)的細(xì)胞DNA損傷。

③ 10、20 mg/kg的6-BA可有效降低小腸I/R誘發(fā)的凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量的升高。

④ 10、20 mg/kg的6-BA能有效防護(hù)I/R對(duì)小腸的損傷，其中20 mg/kg的6-BA作用效果尤為明顯。

[1] HE X H,YAN X T,WANG Y L,et al.Transduced PEP-1-heme oxygenase-1 fusion protein protects against intestinal ischemia/reperfusion injury[J].Journal of Surgical Research,2014,187(1):77-84.

[2] YANG X K,BAI H,CAI W X,et al.Lyciumbarbarumpolysaccharides reduce intestinal ischemia/reperfusion injuries in rats[J].Chemico-Biological Interactions,2013,204(3):166-172.

[3] INAN M,UZ Y H,KIZILAY G,et al.Protective effect of sildenafil on liver injury induced by intestinal ischemia/reperfusion[J].Journal of Pediatric Surgery,2013,48(8):1707-1715.

[4] LI Y S,WANG Z X,LI C,et al.Proteomics of ischemia/reperfusion injury in rat intestine with and without ischemic postconditioning[J].Journal of Surgical Research,2010,164(1):e173-e180.

[5] 陳建雷,孫慶林.白藜蘆醇對(duì)大鼠腸缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中華小兒外科雜志,2011,32(2):139-142.

[6] 李杰,況勝利,房曉敏,等.6-芐氨基嘌呤的合成研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(15):6841-6842.

[7] 張自強(qiáng),劉玉梅,位蘭,等.6-芐胺基嘌呤對(duì)D-半乳糖致小鼠腦組織氧化損傷的保護(hù)作用[J].中國臨床藥理學(xué)雜志,2015,31(14):1422-1425.

[8] 張自強(qiáng),劉玉梅,朱雪敏,等.6-芐氨基嘌呤對(duì)四氯化碳致小鼠肝臟氧化損傷的保護(hù)作用[J].中國臨床藥理學(xué)雜志,2015,31(11):928-931.

[9] ZHANG R,HE G Z,WANG Y K,et al.Omega-3 polyunsaturated fatty acids inhibit the increase in cytokines and chemotactic factors inducedinvitroby lymph fluid from an intestinal ischemia-reperfusion injury model[J].Nutrition,2015,31(3):508-514.

[10] CHEN H,SUN Y P,HU P F,et al.The effects of hydrogen-rich saline on the contractile and structural changes of intestine induced by ischemia-reperfusion in rats[J].Journal of Surgical Research,2011,167(2):316-322.

[11] 樊永梅,王如蜜,張長杰,等.高頻電療對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后caspase-3和海馬神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2017,42(1):21-25.

[12] 茹琴,歐陽五慶,張黎.激動(dòng)素對(duì)小鼠急性四氯化碳肝損傷的保護(hù)作用[J].中國新藥與臨床雜志,2007,26(4):263-267.

[13] 孫江宏,劉玉梅,曹統(tǒng),等.激動(dòng)素對(duì)D-半乳糖致衰雌性小鼠卵巢和子宮的影響[J].生理學(xué)報(bào),2013,65(4):389-394.

[14] 李夢(mèng)云,歐陽五慶,吳小利,等.激動(dòng)素對(duì)衰老大鼠免疫功能及其脾淋巴細(xì)胞體外增殖的影響[J].生理學(xué)報(bào),2014,66(5):605-611.

Author, LIU Yumei, associate professor, E-mail: lymzq@126.com

(責(zé)任編輯 王智航)

Effects of 6-Benzylaminopurine on Ischemia/Reperfusion Injury of Small Intestine of Rats

LIU Yumei ZHANG Ziqiang ZHU Xuemin WEI Lan SHI Ke PAN Li

(College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China)

To explore the protective effects of 6-benzylaminopurine (6-BA) on ischemia/reperfusion (I/R) injury of small intestine of rats, eighty male SD rats were selected and randomly divided into four groups named control group, I/R model group, low and high dose 6-BA groups, respectively. Rats in low and high dose 6-BA groups were treated with 10, 20 mg/kg 6-BA by gavage once daily for 3 weeks, and rats in control group and I/R model group were treated with the same volume physiologic saline. Superior mesenteric artery of rats in control group was not blocked after exposed， while it was blocked in I/R model group and low and high dose 6-BA groups for 30 min, and then the blood vessel was reperfused for 60 min. Then the activities of total superoxide dismutase (T-SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px), and MDA content in jejunum tissue of rats were measured. Cell DNA damage was observed by single cell gel electrophoresis method, and the expression of cysteinyl aspartate specific proteinase 3 (Caspase-3) was determined by immunity histochemistry method. The results showed as follows: compared with I/R model group, the supplementation of 10 and 20 mg/kg 6-BA significantly increased the activities of T-SOD and GSH-Px (P<0.05), and significantly decreased MDA content (P<0.05); broom shaped tails were less, and DNA content of tails and percentage of broom shaped tails were significantly decreased (P<0.05); Caspase-3 positively expressed cell count was significantly decreased (P<0.05). These results reveal that 6-BA has protective effects against injury of I/R in small intestine, and the effect of 20 mg/kg 6-BA is better.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(9)：3153-3158]

6-benzylaminopurine; ischemia/reperfusion; oxidative damage; apoptosis

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.09.017

2017-03-13

國家自然科學(xué)基金(U1504325)

劉玉梅(1979—)，女，內(nèi)蒙古通遼人，副教授，博士，主要從事成體干細(xì)胞的定向分化機(jī)理和臨床應(yīng)用研究。E-mail： lymzq@126.com

S816

：A

：1006-267X(2017)09-3153-06