利用“移樹養(yǎng)苗”策略挖掘粵藍(lán)鏈霉菌隱性活性次級代謝產(chǎn)物

林海州陳洲琴王燕郭俊朱紅惠鄧名榮

（1. 中國科學(xué)院南海海洋研究所，廣州 510301；2. 廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣州 510070；3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4. 廣東省科技圖書館，廣州 510070）

利用“移樹養(yǎng)苗”策略挖掘粵藍(lán)鏈霉菌隱性活性次級代謝產(chǎn)物

林海州1，2，3陳洲琴2王燕4郭俊2朱紅惠2鄧名榮2

（1. 中國科學(xué)院南海海洋研究所，廣州 510301；2. 廣東省微生物研究所 省部共建華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室，廣州 510070；3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；4. 廣東省科技圖書館，廣州 510070）

利用適當(dāng)?shù)牟呗约せ罨浰{(lán)鏈霉菌中潛在的隱性次級代謝途徑，以期獲得新的活性物質(zhì)。以粵藍(lán)鏈霉菌突變株DMR1為研究對象，該突變株的主導(dǎo)產(chǎn)物榴菌素的關(guān)鍵生物合成基因gra-orf1-3被敲除，不能產(chǎn)生榴菌素。通過改變營養(yǎng)條件、添加誘導(dǎo)物和熱激等方法處理菌株，利用瓊脂糖擴散法及TLC-生物顯影等方法檢測發(fā)酵粗提物的抑菌活性。結(jié)果顯示，突變株DMR1的高氏一號和ISP3培養(yǎng)基發(fā)酵粗提物對枯草芽孢桿菌ATCC6633、金黃色葡萄球菌ATCC6538以及耐藥的金黃色葡萄球菌ATCC43300和206具有顯著抑菌活性；添加3% DMSO誘導(dǎo)后，高氏一號和ISP3培養(yǎng)基的發(fā)酵粗提物不僅對上述菌株的抑制活性增強，還具有抑制大腸桿菌ATCC8739、白色念珠菌ATCC10231以及多株耐藥菌大腸桿菌和沙門氏菌的活性?；浰{(lán)鏈霉菌中新發(fā)現(xiàn)的活性物質(zhì)對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及酵母菌具有廣泛的抗菌活性，且部分發(fā)酵粗提物對所有測試的耐藥菌均具有顯著活性，有可能是新型的抗生素。結(jié)果也表明“移樹養(yǎng)苗”策略能夠提高隱性活性次級代謝產(chǎn)物的挖掘效率。

隱性次級代謝產(chǎn)物；“移樹養(yǎng)苗”策略；激活；多重耐藥菌；粵藍(lán)鏈霉菌

多重耐藥菌的廣泛傳播以及超級耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)，使“無藥可用”的隱憂從學(xué)界蔓延到普通大眾。世界經(jīng)濟論壇就在《全球風(fēng)險報告2013》中發(fā)出預(yù)警：“由于細(xì)菌的耐藥，在不久的將來抗生素可能不再唾手可得，我們有回到前抗生素時代的危險，輕微的擦傷都可能致命”。天然產(chǎn)物在現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)和發(fā)展過程中扮演著極其重要的角色［1］，是藥物創(chuàng)新的重要途徑和來源［2］。放線菌是重要的活性天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌，但在歷經(jīng)數(shù)十年的挖掘之后，高頻率的重復(fù)發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重影響了活性天然產(chǎn)物的篩選效率。利用傳統(tǒng)方法從放線菌等藥源微生物中篩選新的活性天然產(chǎn)物，特別是作用機制新穎的活性天然產(chǎn)物變得越來越困難，國際制藥公司于20世紀(jì)末紛紛放棄傳統(tǒng)天然產(chǎn)物的篩選工作［3］。而隨著天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）A3（2）［4］等代表性菌株基因組測序的完成，人們發(fā)現(xiàn)鏈霉菌基因組中存在眾多的次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，潛在的次級代謝產(chǎn)物遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于目前已發(fā)現(xiàn)的數(shù)量，這意味著放線菌中仍有許多新的活性次級代謝產(chǎn)物有待被發(fā)現(xiàn)，為人們進一步從中挖掘新的活性天然產(chǎn)物提供了理論依據(jù)。在常規(guī)實驗室培養(yǎng)條件下，不表達(dá)或表達(dá)活性極低的生物合成基因簇被稱為隱性或沉默生物合成基因簇。新一代測序技術(shù)的出現(xiàn)使基因組測序在技術(shù)、費用、時間等方面的門檻大大降低［5］，大量隱性生物合成基因簇的累積，為天然產(chǎn)物的挖掘開啟了第二次黃金時代［6］。

目前激活隱性生物合成基因簇的主要方法包括“一菌多素”（One strain-many compounds，OSMAC）［7］、共培養(yǎng)［8］、核糖體工程［9］、生物信息學(xué)預(yù)測以及基于遺傳修飾的異源表達(dá)、啟動子改造等，國際國內(nèi)已有多篇綜述總結(jié)和梳理了相關(guān)方法［10-12］。盡管方法多樣，但總體上，如何高效激活這些大量的隱性生物合成基因簇仍是當(dāng)前面臨的重要挑戰(zhàn)。另一方面，放線菌特別是鏈霉菌在常規(guī)實驗室培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的一至數(shù)種主要次級代謝產(chǎn)物容易掩蓋潛在的新產(chǎn)物，在一定程度上阻礙了潛在新活性產(chǎn)物的檢出。利用適當(dāng)?shù)牟呗?，避免或減少主要次級代謝產(chǎn)物的干擾，同時對現(xiàn)有激活方法進行組合，可能能夠提高新活性次級代謝產(chǎn)物的挖掘效率。例如，天藍(lán)色鏈霉菌所產(chǎn)天藍(lán)霉素（Coelimycin）P1，就是通過失活放線紫紅素（Actinorhodin）、十一烷基靈菌紅素（Metacycloprodigiosin）和CDA（Calcium-Dependent Antibiotic）等主要產(chǎn)物的基因簇后，對突變株進一步實施核糖體工程后獲得高產(chǎn)突變株，從而鑒定其結(jié)構(gòu)的［13］。本文對該策略進行了系統(tǒng)地闡述，并稱之為“移樹養(yǎng)苗”（Tree-removal）策略。

粵藍(lán)鏈霉菌（Streptomyces vietnamensis）是本課題組分離得到的一株鏈霉菌新種［14］。前期研究表明，其主導(dǎo)次級代謝產(chǎn)物是榴菌素（Granaticin）［15］。全基因組測序分析發(fā)現(xiàn)［16］，除榴菌素基因簇外，還存在至少28個潛在的次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，其中包括與Kinamycin生物合成基因簇等存在較高相似性的基因簇，值得進一步挖掘。由于主導(dǎo)產(chǎn)物榴菌素存在抗菌和抗腫瘤活性，在活性篩選時對其它可能的活性代謝產(chǎn)物的檢出造成干擾。本研究利用“移樹養(yǎng)苗”策略挖掘粵藍(lán)鏈霉菌隱性活性次級代謝產(chǎn)物的初步結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 粵藍(lán)鏈霉菌DMR1（Δgra-orf1-3：：aac（3）-IV）為本實驗室前期構(gòu)建的突變株，不能產(chǎn)生該菌主要次級代謝產(chǎn)物榴菌素（Granaticin）［17］?？咕鷮嶒灅?biāo)準(zhǔn)菌株大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC8739、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ATCC6633、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538、白色念珠菌（Candida albicans）ATCC10231和耐藥金黃色葡萄球菌ATCC43300（耐甲氧西林、苯唑西林）均來源于廣東省微生物菌種保藏中心。其它耐藥菌：大腸桿菌460（耐環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢西丁、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素等11種抗生素）、大腸桿菌480（耐藥性同大腸桿菌460）、金黃色葡萄球菌206（耐環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、四環(huán)素、氯霉素、頭孢曲松、青霉素、苯唑西林、紅霉素、替卡西林、磺胺甲惡唑、阿米卡星等13種抗生素）、沙門氏菌（Salmonella sp.）31（耐恩諾沙星、萘啶酮酸、氯霉素、氟苯尼考、乙酰甲喹等5 種抗生素）和沙門氏菌47（耐藥譜同沙門氏菌31），由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蔣紅霞教授惠贈。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）YEME培養(yǎng)基：酵母提取物3 g、蛋白胨5 g、麥芽提取物3 g、葡萄糖10 g，補水至1 L，pH7.2，滅菌后加入2.5 mol/L MgCl22 mL；（2）高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g、KNO31 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO40.01 g，補水至1 L，pH7.2；（3）YD培養(yǎng)基：酵母提取物4 g、麥芽提取物10 g、葡萄糖4 g、MgCl22 g、CaCl21.5 g，補水至1 L，pH7.2；（4）氯化鈣培養(yǎng)基（CL）：CaCl245 g、酵母提取物40 g、葡萄糖5 g，補水至1 L，pH7.8；（5）蔗糖察氏培養(yǎng)基：NaNO32 g、K2HPO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、蔗糖30 g，補水至1 L，pH7.2；（6）馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，去皮，切成小塊，放于鍋中加水煮沸0.5 h，用雙層紗布過濾，取其濾液加葡萄糖20 g，補水至1 L；（7）燕麥培養(yǎng)基（ISP3）：燕麥20 g，研磨，煮沸0.5 h，用雙層紗布過濾，取其濾液加微量元素溶液1 mL，補水至1 L，pH7.2，（微量元素溶液：FeSO4·7H2O 0.1 g、MnCl2·4H2O 0.1 g、ZnSO4·7H2O 0.1 g溶于100 mL ddH2O中）；（8）營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NA）：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g，補水至1 L，pH7.0-7.2。（9）麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽提取物130 g，補水至1 L，pH5.6±0.2。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵和提取 將不產(chǎn)榴菌素的粵藍(lán)鏈霉菌突變株DMR1甘油保存種劃線于YEME平板上，30℃培養(yǎng)36 h，挑取單菌落接種于YEME培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)36 h，即為種子液。按5%接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min，振動培養(yǎng)7 d，發(fā)酵液經(jīng)離心（6 000×g、20 min）或用4層紗布過濾，使菌液分離。發(fā)酵上清液用等體積的乙酸乙酯萃取4次，40℃減壓濃縮成粗提物，用甲醇溶解定容至1 mL。每個處理重復(fù)3次。

1.2.2 抗菌活性測定 采用瓊脂糖擴散法［18］。冷卻至45℃的培養(yǎng)基，加入終濃度約0.5-3×106cfu/mL的菌體，混勻后倒入預(yù)先放牛津杯培養(yǎng)皿中，凝固后取出牛津杯，在孔內(nèi)加入待測樣品。細(xì)菌用NA培養(yǎng)基，白色念珠菌用麥芽汁培養(yǎng)基，各自適合的培養(yǎng)溫度37℃或28℃培養(yǎng)24-48 h，測定抑菌圈的直徑。每個處理重復(fù)3次。

1.2.3 TLC-生物顯影 取粗提物溶解在甲醇中，毛細(xì)管上樣，在氯仿/甲醇（10∶1）中展開，展層完畢的TLC板，與含有枯草芽孢桿菌（約2×106CFU/mL）的NA平板接觸一段時間后，移除TLC板，含菌平板于37℃培養(yǎng)24 h，進行生物自顯影。

1.2.4 熱激及添加誘導(dǎo)物 將突變菌株DMR1種子液接種于100 mL高氏一號，接種量5%，30℃、180 r/min培養(yǎng)6 h后，轉(zhuǎn)入42℃培養(yǎng)1 h，或添加DMSO至終濃度3%，于30℃繼續(xù)培養(yǎng)至7 d。

1.2.5 粗提物HPLC分析 HPLC儀為島津LC-20A，色譜柱為Welch AQ-C18柱（3.9×150 mm，5 μm）。粗提物用適量甲醇溶解，0.22 μm濾膜過濾后上樣，進樣量5 μL，流速1 mL/min，柱溫為室溫，流動相為甲醇/水，使用梯度洗脫，甲醇濃度隨時間的變化為：0-30 min：5%→25%，30-60 min：25%→50%，60-80 min：50%→80%，80-100 min：80%→100%，100-110 min：100%。

2 結(jié)果

2.1 “移樹養(yǎng)苗”（Tree-removal）策略

在常規(guī)培養(yǎng)條件下，以鏈霉菌為代表的放線菌通常能產(chǎn)一至數(shù)種主要的次級代謝產(chǎn)物，而其它次級代謝產(chǎn)物生物合成途徑處于沉默狀態(tài)。在這種情形下，沉默途徑即使被特定條件在一定程度上激活，也可能會被原主要次級代謝產(chǎn)物所掩蓋，而在生物活性檢測或化學(xué)分析時不易被檢出。通過失活主要次級代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇，簡化次級代謝產(chǎn)物背景，可能能夠提高新活性次級代謝產(chǎn)物的挖掘效率。我們將這種策略稱為“移樹養(yǎng)苗”（Treeremoval）策略：即將菌株的主要次級代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇失活，獲得不產(chǎn)相應(yīng)主導(dǎo)產(chǎn)物的突變株，然后通過OSMAC、核糖體工程和共培養(yǎng)等非特異性激活方法，使原本不表達(dá)或低量表達(dá)的產(chǎn)物產(chǎn)量得到一定程度的提高，在目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及其生物合成基因簇鑒定后，通過定向或理性遺傳改造等方法，使其產(chǎn)量進一步提高而成為新的主導(dǎo)產(chǎn)物，依次循環(huán)直至發(fā)現(xiàn)若干新產(chǎn)物。該策略的核心是失活主要次級代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇，最重要的作用就是排除已知的主要次級代謝產(chǎn)物的干擾，簡化產(chǎn)物背景，利于新產(chǎn)物的檢出。在實際應(yīng)用時，目標(biāo)菌主要次級代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇失活后，可根據(jù)具體情況靈活選擇一種或多種激活方法的組合。

2.2 利用“移樹養(yǎng)苗”策略挖掘粵藍(lán)鏈霉菌隱性次級代謝產(chǎn)物

2.2.1 改變培養(yǎng)基成分 改變培養(yǎng)基成分也是OSMAC最常用的手段。首先考察高氏一號等6種不同培養(yǎng)基對粵藍(lán)鏈霉菌突變株DMR1次級代謝的影響。抑菌活性測試發(fā)現(xiàn)，高氏一號、PDA和ISP3培養(yǎng)基發(fā)酵粗提物對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌活性，其余培養(yǎng)基發(fā)酵粗提物對所試菌株無明顯活性（表1）。TLC分析發(fā)現(xiàn)，其余不同培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)物存在一定的差別，表現(xiàn)出抑菌活性的3種培養(yǎng)基較為類似，其中高氏一號發(fā)酵產(chǎn)物最為豐富。進一步對高氏一號、PDA和ISP3發(fā)酵粗提物進行TLC-生物顯影，發(fā)現(xiàn)3種發(fā)酵粗提物均在含菌平板上相近的區(qū)域出現(xiàn)了抑菌透明圈，對應(yīng)TLC的Rf值約為0.7（圖1）。由于高氏一號和PDA在產(chǎn)物類型上更為接近，因此，選擇高氏一號和ISP3進行后續(xù)研究。

表1 粵藍(lán)鏈霉菌突變株DMR1不同培養(yǎng)基發(fā)酵粗提物抑菌活性

圖1 粵藍(lán)鏈霉菌突變株DMR1不同培養(yǎng)基發(fā)酵粗提物生物顯影

2.2.2 熱激及添加誘導(dǎo)物 微生物對不同的脅迫條件有特定的應(yīng)激機制，從而可能觸發(fā)特定隱性基因簇的表達(dá)。結(jié)果（表2）顯示，42℃熱激1 h處理與對照相比，高氏一號和ISP3發(fā)酵粗提物的抑菌活性無顯著變化；而添加3% DMSO后，高氏一號和ISP3發(fā)酵粗提物不僅對枯草芽孢桿菌ATCC6633和金黃色葡萄球菌ATCC6538的抑菌活性顯著增強，而且對大腸桿菌ATCC8739和白色念珠菌ATCC10231也出現(xiàn)了較好抑制作用。將各粗提物進行HPLC，發(fā)現(xiàn)在高氏一號和ISP3兩種培養(yǎng)基中，熱激處理與未誘導(dǎo)對照的次級代謝產(chǎn)物特征幾乎相同，而DMSO誘導(dǎo)后，兩種培養(yǎng)基的次級代謝產(chǎn)物特征與對照相比存在少量的差異峰（圖2），這與活性測試的結(jié)果相吻合。以枯草芽孢桿菌作為指示菌，利用微孔板進一步追蹤抑菌活性部位，發(fā)現(xiàn)高氏一號和ISP3兩種培養(yǎng)基活性部位的保留時間均在58-62 min之間（圖2，微孔板抑菌活性測試結(jié)果未顯示）。

表2 熱激及添加誘導(dǎo)物對粵藍(lán)鏈霉菌突變株DMR1發(fā)酵粗提物抑菌活性的影響

圖2 粵藍(lán)鏈霉菌突變株DMR1熱激和DMSO誘導(dǎo)后發(fā)酵粗提物HPLC分析

2.3 發(fā)酵粗提物對耐藥菌的活性分析

進一步對發(fā)酵粗提物對耐藥菌的抑菌活性進行分析發(fā)現(xiàn)，高氏一號、ISP3的對照組和熱激組發(fā)酵粗提物對耐藥菌金黃色葡萄球菌206和金黃色葡萄球菌ATCC43300有顯著的抑制活性；而3% DMSO處理組粗提物對所有受試大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的耐藥菌株均有顯著的抑制活性（表3），提示該活性物質(zhì)具有廣譜抗耐藥菌的活性。圖4展示了ISP3發(fā)酵粗提物對各耐藥菌所形成的抑菌圈。

表3 發(fā)酵粗提物對耐藥菌的抑制活性

圖4 突變株DMR1的ISP3發(fā)酵粗提物對耐藥菌形成的抑菌圈

3 討論

當(dāng)前，放線菌天然產(chǎn)物研究面臨的一大挑戰(zhàn)是：高頻率重復(fù)發(fā)現(xiàn)的同時，缺乏挖掘隱性次級代謝產(chǎn)物的高效、普適的手段。這主要是由于現(xiàn)有實驗室培養(yǎng)方法的模式化和缺乏對產(chǎn)生菌的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的深入認(rèn)識。以鏈霉菌為例，該類菌有著復(fù)雜的形態(tài)發(fā)育分化和豐富的次級代謝，且二者之間具有密切的聯(lián)系，而所有這些過程都被細(xì)微和精確的調(diào)控系統(tǒng)所控制。相應(yīng)地，其基因組上存在至多可達(dá)約12%的調(diào)控基因（超過1 000個）［19］，這些基因共同組成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使人們難以在短期內(nèi)從總體上認(rèn)識和把握該網(wǎng)絡(luò)的作用機制。在打開這一“暗箱”以前，我們必須通過各種方法和策略來提高隱性次級代謝產(chǎn)物的挖掘效率?！耙茦漯B(yǎng)苗”策略，將產(chǎn)生菌主導(dǎo)產(chǎn)物的生物合成基因簇失活，使產(chǎn)生菌不再產(chǎn)生原主導(dǎo)產(chǎn)物后，再對突變株進行深度挖掘，其有益效果在于：（1）可改變產(chǎn)生菌代謝通路的流向，使前體物質(zhì)能夠流向處于弱勢的次級代謝途徑；（2）代謝產(chǎn)物背景更為簡單，排除了原主導(dǎo)產(chǎn)物的干擾，使隱性次級代謝產(chǎn)物更容易被生物活性測試、化學(xué)分析等方法檢出。

“移樹養(yǎng)苗”策略的有效性此前已被證實。前文提到的天藍(lán)霉素（Coelimycin）P1，雖然最初是通過敲除調(diào)控基因scbR2后發(fā)現(xiàn)天藍(lán)色鏈霉菌能夠在部分培養(yǎng)基中產(chǎn)生一種黃色色素［20］，但最終確認(rèn)和解析其結(jié)構(gòu)時就利用了該策略［13］。本文的研究對象粵藍(lán)鏈霉菌的主導(dǎo)產(chǎn)物是榴菌素。由于榴菌素存在抗菌和抗腫瘤活性，在活性篩選時對其它可能的活性代謝產(chǎn)物的檢出造成干擾。本研究利用“移樹養(yǎng)苗”策略，對榴菌素基因簇失活后的突變株利用“一菌多素”的方法進行進一步挖掘，新發(fā)現(xiàn)了該菌能產(chǎn)生具有廣譜和抗多種耐藥菌活性的次級代謝產(chǎn)物，也表明該策略能夠提高隱性活性次級代謝產(chǎn)物的挖掘效率。

熱激是常用的激活方法，它可能通過微生物應(yīng)激機制而影響細(xì)胞的生理代謝過程。然而在本研究中，從抗菌活性和HPLC分析結(jié)果來看，42℃熱激1 h并未對粵藍(lán)鏈霉菌產(chǎn)生顯著的影響，表明熱激對不同菌株的效果存在差異。添加DMSO后，粵藍(lán)鏈霉菌高氏一號培養(yǎng)基的活性部位（保留時間58-62 min）在280 nm下的吸收峰增加不明顯，而在520 nm下有一定程度增強；ISP3培養(yǎng)基則相反，甚至DMSO誘導(dǎo)后在520 nm下幾乎檢測不到任何峰，這提示高氏一號和ISP3培養(yǎng)基所產(chǎn)生的活性物質(zhì)可能為不同物質(zhì)，也說明同一誘導(dǎo)物對同一菌株在不同培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)效應(yīng)也可能存在差別。

耐藥菌已成為嚴(yán)重和日益增長的威脅，挖掘和發(fā)現(xiàn)新型抗生素對人類的健康極為關(guān)鍵［21］。放線菌作為傳統(tǒng)重要的藥源微生物，雖受重復(fù)發(fā)現(xiàn)等問題的困擾，但仍是重要新型抗生素的來源。只要采取一些適當(dāng)方法和策略，仍可不斷從中發(fā)現(xiàn)新的抗生素，如Lassomycin［22］，天賜霉素（Tiancimycin）［23］等。由于除榴菌素外，粵藍(lán)鏈霉菌基因組中其它潛在的次級代謝產(chǎn)物生物合成基因簇均與已知的抗生素基因簇不同，因此，本研究所發(fā)現(xiàn)的廣譜抗耐藥菌活性次級代謝產(chǎn)物，很可能是一種新型的抗生素。目前，我們已進行了發(fā)酵條件的優(yōu)化，進一步提高了活性產(chǎn)物的產(chǎn)率，分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定正在進行中。

4 結(jié)論

本研究系統(tǒng)總結(jié)概況了“移樹養(yǎng)苗”策略，并將之應(yīng)用于粵藍(lán)鏈霉菌隱性活性次級代謝產(chǎn)物的挖掘，從中新發(fā)現(xiàn)了具有廣譜抗耐藥菌的活性物質(zhì)，證明了該策略能夠提高隱性活性次級代謝產(chǎn)物的挖掘效率。

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（責(zé)任編輯 朱琳峰）

Mining the Cryptic Bioactive Secondary Metabolites from Streptomyces vietnamensis Using a‘Tree-Removal’Strategy

LIN Hai-zhou1，2，3CHEN Zhou-qin2WANG Yan4GUO Jun2ZHU Hong-hui2DENG Ming-rong2
（1. South China Sea Institute of Oceanology，the Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510301；2. State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China，Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application，Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology，Guangdong Institute of Microbiology，Guangzhou 510070；3. University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049；4. Guangdong Science and Technology Library，Guangzhou 510070）

This study aims to discover novel bioactive substances by activating the cryptic biosynthetic gene clusters of secondary metabolites from Streptomyces vietnamensis with appropriate strategies. The study was carried out in a S. vietnamensis mutant DMR1. In this mutant，the key biosynthetic genes，gra-orf1-3，of the dominant product were knocked out，resulting in deficiency in granaticin production. The strain was subject to nutrient condition changing，inducer adding and heat shocking. The antimicrobial activities of the fermentation crude extracts were tested using agarose diffusion method and TLC-bioautography. Results showed that the fermentation crude extracts of Gause No.1 and ISP3 presented significant inhibitory effects against Bacillus subtilis ATCC6633，Staphylococcus aureus ATCC6538 as well as multidrug resistant Staphylococcus aureus strains ATCC43300 and 206. With adding 3% DMSO to the media，not only did the activities of the fermentation crude extracts of Gause No.1 and ISP3 against the afore said strains increase，but also the spectrum broadened into against Escherichia coli ATCC8739，Candida albicans ATCC10231 and multidrug resistant E. coli and Salmonella sp. strains. The newly discoveredbioactive substances from S. vietnamensis showed extensive activities against both gram-positive and gram-negative bacteria as well as yeast. More importantly，some of the crude extracts were significantly active against all the tested drug-resistant strains. These results indicate a possibility of a novel type of antibiotic. The results presented in this paper illustrate that the so-called ‘tree-removal’ strategy can improve the mining efficiency of the cryptic bioactive secondary metabolites.

cryptic secondary metabolites；‘tree-removal’ strategy；activation；multidrug resistant bacterium；Streptomyces vietnamensis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0276

2017-04-07

國家自然科學(xué)基金項目（31470188），廣東省科技計劃項目（2013B010102017，2015A020211022，2016A010105013），廣州市科技計劃項目（201504010035），廣東省科學(xué)院科研平臺環(huán)境與能力建設(shè)專項資金項目（2016GDASPT-0302）

林海州，男，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)；E-mail：linhaizhou2016@163.com

朱紅惠，女，博士，研究員，研究方向：微生物資源與利用；E-mail：zhuhh@gdim.cn鄧名榮，男，博士，副研究員，研究方向：微生物資源與利用；E-mail：dengmr@gdim.cn