一種快速提取南瓜大群體基因組DNA的方法

李 委 戴祖云 夏偉偉 王雯雯

（1安徽江淮園藝種業(yè)股份有限公司，安徽合肥230031；2安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，安徽合肥230061）

一種快速提取南瓜大群體基因組DNA的方法

李 委1，2戴祖云1夏偉偉1王雯雯1

（1安徽江淮園藝種業(yè)股份有限公司，安徽合肥230031；2安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，安徽合肥230061）

基因型鑒定是作物分子標(biāo)記輔助育種和基因功能遺傳分析中十分重要的環(huán)節(jié)，此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用正日漸頻繁，因而迫切需要一種高通量篩選的方法。本試驗(yàn)以南瓜中篩選到的互補(bǔ)型SSR引物為驗(yàn)證手段，在種子階段比較了鉆孔法和萌芽法采用堿煮法提取DNA的效果，并且在成熟植株階段驗(yàn)證了各組織部位采用堿煮法提取DNA的效果。結(jié)果表明：使用萌芽的南瓜種子根尖以堿煮法提取DNA是可用于種子純度測定的快速方法；成熟植株各部位采用堿煮法提取DNA均可用于植株基因型篩選。

南瓜；基因型鑒定；分子育種；堿煮法

南瓜（Cucurbita moschata Duch. ex Poir.）作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，近年來受到越來越多研究者的重視。早在2009年國際葫蘆科遺傳學(xué)會(huì)年報(bào)上就發(fā)表了南瓜中的136個(gè)性狀或生化控制基因，以及部分性狀的連鎖分子標(biāo)記的研究結(jié)果（Paris & Kabelka，2009）。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，南瓜作物上有越來越多的分子標(biāo)記被開發(fā)出來，研究者試圖通過分子生物學(xué)手段來完成南瓜的種質(zhì)親緣關(guān)系確立、雜交種純度測定、遺傳圖譜構(gòu)建等工作（Paris et al.，2003；朱海生 等，2015）。而以上種種技術(shù)均依賴于DNA的大批量提取，傳統(tǒng)的CTAB提取法耗時(shí)耗力且會(huì)使用到有毒試劑（趙茜和徐麗珍，2011；王迎兒 等，2015）。近年來堿煮法被廣泛應(yīng)用于玉米、小麥、大豆等作物的DNA提?。ㄍ鮽ネ?等，2008；鄭淑波 等，2015），同時(shí)還有研究者嘗試將種子鉆孔法和堿煮法結(jié)合起來，建立一種無損提取DNA的方法（程文 等，2016）。

目前在南瓜上進(jìn)行的分子標(biāo)記工作眾多，但大多采用傳統(tǒng)提取方法（李鶴 等，2014；朱海生 等，2015），尚未有堿煮法提取的報(bào)道。本試驗(yàn)分別在種子和成熟植株兩個(gè)階段驗(yàn)證了堿煮法所提DNA用于SSR-PCR的效果，嘗試解決南瓜植株的高通量篩選問題，以期為分子育種技術(shù)的優(yōu)化提供 參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為安徽江淮園藝種業(yè)股份有限公司提供的南瓜品種江蜜8號(hào)及其父本L-817、母本玉-041，種子于2016年10月采集自安徽合肥長豐縣吳山鎮(zhèn)江淮園藝農(nóng)業(yè)示范園區(qū)。

試驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 DNA提取

CTAB法提取DNA參照王瑞等（2011）的方法。堿煮法參照鄭淑波等（2015）、程文等（2016）的方法，稍有改動(dòng)。鉆孔法：采用微型電鉆在南瓜種子上打孔，鉆取出來的子葉粉末落在紙上后，小心移入96孔PCR板中，鉆孔后的種子留存?zhèn)溆?；使?5%乙醇清潔鉆頭，以吸水紙擦拭干凈，然而處理下一個(gè)樣品；待收集完后，每孔加入0.2 mol·L-1NaOH溶液30 μL，置入PCR儀中，99 ℃處理10 min，然后每孔再加入1 mol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH=6.0）30 μL，輕輕混勻后2 500×g離心30 s，吸取上清作為模板進(jìn)行后續(xù)PCR檢測。萌芽法：在種子生出芽根后，截取根尖約1 cm長的組織，放入96孔PCR板中，每孔加入0.2 mol·L-1NaOH溶液80 μL，置入PCR儀中，99 ℃處理30 min，然后每孔再加入1 mol·L-1Tris-HCl緩沖液（pH=6.0）80 μL，輕輕混勻后2 500×g離心30 s，吸取上清作為模板進(jìn)行后續(xù)PCR檢測。

1.3 PCR檢測

PCR反應(yīng)體系（20 μL）：1×PCR Buffer 1 μL，200 μmol·L–1dNTPs 1 μL，0.5 μmol·L–1引物2 μL，1 U Taq DNA Polymerase（康為世紀(jì)公司）0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物中加入上樣緩沖液2 μL，于3%瓊脂糖凝膠中電泳。引物序列為CMTm224F：GTGGGTCGCTCCTTAAA，CMTm224R：ATAGCGGATAAAGTGGACTG；引物由Invitrogen公司合成。篩選所用的引物庫為Gong等（2008）公布的200對(duì)SSR引物。

1.4 發(fā)芽試驗(yàn)

隨機(jī)取鉆孔后的種子和完整種子各100粒，浸種4 h后置于30 ℃催芽箱內(nèi)，3 d后統(tǒng)計(jì)出芽率；3次重復(fù)。同時(shí)，取根長約3 cm的種子播于基質(zhì) 〔每立方米基質(zhì)含草炭0.75 m3，蛭石0.13 m3，珍珠巖0.12 m3，石灰石3.0 kg，過磷酸鈣（20% P2O5）1.0 kg，三元復(fù)合肥（N∶P∶K=15∶15∶1）1.5 kg，消毒干雞糞10 kg〕中，出苗10 d后測定株高，每處理隨機(jī)測定20株，取平均值；3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及序列比對(duì)

以江蜜8號(hào)及其父母本為試材，首先采用傳統(tǒng)CTAB法提取DNA為模板，經(jīng)過篩選，確定CMTm224為雙親互補(bǔ)型引物對(duì)。如圖1所示，CMTm224引物對(duì)在父本中可擴(kuò)增出1條141 bp大小的條帶；在母本中可擴(kuò)增出1條123 bp大小的條帶；在一代雜種中可擴(kuò)增出2條條帶，大小分別為141 bp和123 bp。經(jīng)過測序比對(duì)（圖2），父、母本在該位點(diǎn)的重復(fù)基序均為CT（n），且除重復(fù)基序的長度不同外，其余序列十分相似。經(jīng)NCBI網(wǎng)站比對(duì)，父、母本序列的相似度為96%。

圖1 江蜜8號(hào)及其父母本PCR檢測結(jié)果

圖2 江蜜8號(hào)父、母本序列比對(duì)結(jié)果

2.2 兩種取材方法的比較

參照程文等（2016）的方法，從單粒南瓜種子上以鉆孔法獲取組織材料；另外，從萌芽的南瓜種子上取根尖材料。采用堿煮法提取DNA，以CMTm224為引物進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果如圖3所 示，采用鉆孔法提取DNA，父本和母本均可擴(kuò)增出清晰的條帶，而一代雜種的條帶較模糊；采用萌芽法提取DNA，父母本與一代雜種均可擴(kuò)增出清晰的條帶。

圖3 鉆孔法與萌芽法提取DNA的PCR檢測結(jié)果

從表1可以看出，不同取材方法對(duì)南瓜種子的發(fā)芽率無顯著影響，但株高和簡易活力指數(shù)兩處理間差異達(dá)顯著水平。

表1 不同取材方法對(duì)南瓜種子活力的影響

2.3 不同體積Tris-HCl緩沖液對(duì)DNA提取的影響

為驗(yàn)證堿煮法中所加Tris-HCl緩沖液的作用，設(shè)加入80、40、4 μL Tris-HCl緩沖液3個(gè)處理，分別提取DNA作為模板進(jìn)行PCR檢測。如圖4所示，80 μL 和40 μL Tris-HCl緩沖液處理的DNA模板均擴(kuò)增出清晰條帶，而4 μL Tris-HCl緩沖液處理的DNA模板未能擴(kuò)增出條帶。由表2可知，這3組DNA的濃度分別為479、711、886 ng·μL-1；OD260/OD280的比值從1.60遞減至1.51，OD260/OD230的比值處于0.7～0.8區(qū)間內(nèi)，表明隨著加入Tris-HCl緩沖液體積的減少，所得DNA中的蛋白質(zhì)、糖類及鹽類等雜質(zhì)逐漸增多；pH值的變化最為明顯，80 μL Tris-HCl緩沖液處理和40 μL Tris-HCl緩沖液處理的pH值分別為7.0和7.4，而4 μL Tris-HCl緩沖液處理則達(dá)到了9.8。

圖4 不同體積Tris-HCl緩沖液提取DNA的PCR檢測結(jié)果

表2 不同體積Tris-HCl緩沖液對(duì)提取DNA質(zhì)量的影響

2.4 成熟植株各組織部位所提DNA的PCR檢測結(jié)果

為驗(yàn)證成熟植株各組織部位對(duì)于堿煮法提取DNA的適應(yīng)性，分別切取江蜜8號(hào)及其父母本植株根、莖、葉、花瓣、花蕊、果實(shí)，采用堿煮法提取DNA，以CMTm224為引物進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果如圖5所示，南瓜成熟植株各組織部位所提DNA均可擴(kuò)增出清晰條帶?？梢娫诔墒熘仓甑幕蛐丸b定中亦可選取易于得到的組織部位，使用堿煮法完成DNA提取。

圖5 成熟植株各組織部位所提DNA的PCR檢測結(jié)果

2.5 南瓜幼苗SSR-PCR鑒定結(jié)果

為驗(yàn)證堿煮法在批量鑒定中的應(yīng)用情況，從田間隨機(jī)選取100株江蜜8號(hào)植株進(jìn)行順序編號(hào)，采用堿煮法提取DNA，進(jìn)行SSR-PCR檢測。結(jié)果如圖6所示，21號(hào)、27號(hào)和77號(hào)均被鑒定為母本植株。經(jīng)田間表型觀察，21號(hào)、27號(hào)和77號(hào)這3株植株葉型小、始終短蔓簇生，為母本植株的表型性狀；除這3株外，其余植株葉型偏大、近根處為短蔓簇生、5節(jié)左右以后變?yōu)殚L蔓，為一代雜種的表型性狀。由此可以驗(yàn)證堿煮法適用于大批量的成熟植株基因型篩選。

圖6 南瓜幼苗SSR-PCR鑒定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

近年來，以南瓜為研究對(duì)象，采用集團(tuán)分離分析法、近等基因系法與SSR、ISSR等標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，篩選出了一系列與功能性狀相連鎖的分子標(biāo)記（王瑞 等，2011；王冬杰 等，2014）。其中王瑞等（2011）報(bào)道了1個(gè)AFLP標(biāo)記，該標(biāo)記與南瓜短蔓基因之間存在連鎖關(guān)系。而本試驗(yàn)中所用江蜜8號(hào)的母本即為短蔓，至于采用的CMTm224標(biāo)記是否也與短蔓基因存在連鎖關(guān)系，尚需更深入的研究。另外，進(jìn)一步擴(kuò)大引物的篩選范圍，或者使用更高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行篩選，均是下一步可能的工作計(jì)劃。

近年來，關(guān)于從南瓜中提取DNA進(jìn)行后續(xù)研究的報(bào)道很多，但多為使用傳統(tǒng)CTAB或SDS方法，其弊端為使用到氯仿等有毒試劑或是操作步驟較繁瑣，難以應(yīng)對(duì)大批量篩選。與此同時(shí)，一種快速有效的堿裂解法正被越來越多的應(yīng)用到花生、玉米、小麥和水稻等作物的轉(zhuǎn)基因植株鑒定和分子標(biāo)記輔助育種上（Xu et al.，2005；Collard et al.，2007）。采用堿裂解法提取的DNA含有蛋白質(zhì)、糖類等雜質(zhì)，且有可能造成長片段斷裂等問題；但是由于SSR等分子標(biāo)記技術(shù)所涉及到的片段一般很小，大多在200 bp左右，且對(duì)于PCR模板的質(zhì)量要求也不嚴(yán)苛，因此反而適宜使用快捷的堿煮法。本試驗(yàn)以萌發(fā)種子的根尖和成熟植株的各組織器官作為材料，進(jìn)行了堿煮法提取DNA效果的對(duì)比測試，證實(shí)了使用各部位的植物材料，配以堿煮法進(jìn)行提取，所得到的DNA完全能夠滿足分子標(biāo)記的擴(kuò)增要求，同時(shí)整個(gè)操作的成功率高、效 率好。

另外，在堿煮法的基礎(chǔ)上，近年來許多研究者嘗試建立各種植物種子的無損基因型鑒定技術(shù)（鄭淑波 等，2015；程文 等，2016）。本試驗(yàn)證實(shí)，通過鉆孔小心獲取子葉的少量材料，所提取的父母本DNA可通過后續(xù)PCR產(chǎn)生清晰條帶，但一代雜種所產(chǎn)生的條帶稍顯模糊，推測這可能與操作中材料污染有關(guān)。同時(shí)鉆孔后種子的萌發(fā)率與未鉆孔相比，沒有顯著差異，因而總體上可以認(rèn)為鉆孔法基本能滿足基因型鑒定和種子后續(xù)萌發(fā)的雙重需求。試驗(yàn)過程中南瓜種子在被鉆取后進(jìn)行催芽，有一部分出現(xiàn)了發(fā)霉的現(xiàn)象。鄭淑波等（2015）曾對(duì)切除胚乳的玉米種子進(jìn)行包衣以提高其活力，取得了成功，因此這一問題也許可以通過對(duì)種子進(jìn)行包衣得到解決。

但是，上述方法也存在無法應(yīng)用高通量篩選的問題，譬如獲取子葉材料的過程中，由于種皮來源于母體，故需先用砂紙磨掉一塊種皮后再鉆孔取樣，以防母體DNA的污染。再加上每取完一粒種子后鉆頭需徹底清潔掉其上的粉末，否則也極易污染其他樣品，因此該方法在速度上無法得到提升，并不適用于大批量鑒定的情況。因此建議在測定種子純度時(shí)，使用萌芽法取根尖組織以堿煮法提取DNA后配合SSR-PCR來進(jìn)行純度測定。而在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株篩選的時(shí)候，從幼苗上取嫩葉以堿煮法提取DNA可能會(huì)是比較便捷的 途徑。

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A Rapid DNA Extraction Method for Large Squash Population

LI Wei1，2，DAI Zu-yun1，XIA Wei-wei1，WANG Wen-wen1

（1Anhui Jianghuai Horticulture Seed Co. Ltd.，Hefei 230031，Anhui，China；2College of Horticulture，Anhui Agricultural University，Hefei 230061，Anhui，China）

Genotype identification is an important link in molecular-marker-assisted breeding and genetic analysis of gene function．Since this method is used more and more frequently，researchers need a high-throughput technique．This experiment took a pair of SSR primers of complementary type as the method，and compared the effect of extracting DNA from cotyledon and root during seedling stage．The effect of extracting DNA from each tissue of the plant by NaOH-boiling method during maturing stage was also verified．The results indicated that extracting DNA from root with NaOH-boiling method was a rapid way to measure seed purity．Therefore，extracting DNA with NaOH-boiling method from all tissues of the matured plant could be used for screening plant genotype．

Squash；Genotype identification；Molecular breeding；NaOH-boiling method

李委，男，博士，講師，專業(yè)方向：分子遺傳學(xué)，E-mail：childelee@126.com

2017-02-04；接受日期：2017-07-03

安徽省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（1501142220）