梔子油對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的保護作用

張風(fēng)波，羅光明，肖日傳，袁源見，饒雅琪，李 波，謝 晶

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，南昌 330004)

梔子油對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的保護作用

張風(fēng)波，羅光明，肖日傳，袁源見，饒雅琪，李 波，謝 晶

(江西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，南昌 330004)

研究梔子油對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的保護作用，并探討其保肝作用機制。采用四氯化碳小鼠急性肝損傷模型，測定小鼠血清中ALT、AST活性，TBA、TBIL、DBIL水平，肝組織中SOD活力及MDA、GSH的水平，用HE染色切片對肝組織進行病理學(xué)觀察，考察梔子油各劑量組對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的保護作用。結(jié)果表明：與模型組相比，梔子油中劑量組(0.6 g/kg)、高劑量組(1.2 g/kg)可顯著改善四氯化碳所致急性肝損傷小鼠的肝臟組織病理學(xué)變化，顯著降低肝損傷小鼠血清中ALT、AST的活性和TBA、TBIL、DBIL的水平；梔子油高劑量組可提高肝勻漿中SOD活力和GSH水平，降低MDA含量。梔子油對四氯化碳所致急性肝損傷小鼠具有保肝作用，其機制可能與降酶、抑制自由基脂質(zhì)過氧化、維持肝細胞膜正常形態(tài)有關(guān)。

梔子油；肝損傷；脂質(zhì)過氧化；保肝

梔子為市面上常見大宗藥材之一，來源于茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實[1]，主要產(chǎn)于江西、湖南、福建等省，是江西省道地藥材[2]。梔子中主要含有環(huán)烯醚萜類、有機酸類和梔子黃色素等成分，梔子性苦味寒，具有瀉火除煩、涼血解毒的功效[3-5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，梔子具有保肝利膽、鎮(zhèn)靜、降壓、消炎等多種藥理作用[6-7]。

目前國內(nèi)外對梔子現(xiàn)代藥理研究及藥物開發(fā)主要是針對環(huán)烯醚萜類成分，少有對梔子油進行藥理研究，而梔子中梔子油含量很高[8]，為進一步綜合開發(fā)利用梔子的臨床價值，本文探討梔子油對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的影響及其可能的保護機制，為臨床防治肝病的新藥研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級昆明種雄性小鼠，體重18～22 g，共60只，由山東省實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)20140007。動物房溫度20～25℃，濕度55%～75%。

1.1.2 藥品與試劑

梔子由江西省九江市湖口縣順昌梔子藥材基地提供，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源學(xué)科羅光明教授鑒定為茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實，藥材存放于江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗大樓C座種質(zhì)資源室；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT，批號：20160917)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST，批號：20160917)、總膽汁酸(TBA，批號：20160918)、總膽紅素(TBIL，批號：20160918)、直接膽紅素(DBIL，批號：20160917)、總蛋白(TP，批號：20160918)、還原型谷胱甘肽(GSH，批號20160611)、超氧化物歧化酶(SOD，批號：20160918)和丙二醛(MDA，批號：20160917)試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。聯(lián)苯雙酯滴丸(浙江萬邦藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號：160605，每丸1.5 mg)；食用性花生油，購于江西南昌金海棠藥用油有限公司，批號：160610；四氯化碳、吐溫-80，均購于西隴化工股份有限公司。

1.1.3 主要儀器

UV-1800型紫外可見分光光度計，日本島津公司；MULTISKAN GO酶標儀，賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 梔子油的提取[9]

取干燥后的梔子，粉碎，過20目篩，加5倍量的石油醚，85℃索氏提取3 h，提取結(jié)束后用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀回收石油醚，得梔子油，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 四氯化碳肝損傷模型的建立[10]

取60只昆明小鼠隨機分為6組，分別為正常對照組、四氯化碳肝損傷模型組、梔子油低劑量組(0.3 g/kg)、梔子油中劑量組(0.6 g/kg)、梔子油高劑量組(1.2 g/kg)、聯(lián)苯雙酯組(200 mg/kg)。正常對照組和模型組小鼠給予灌服等量的0.5%吐溫-80溶液，其他各組小鼠灌服相應(yīng)的藥物，連續(xù)給藥7 d 后，除正常對照組腹腔注射純花生油外，其余各組分別腹腔注射0.15%四氯化碳(用精制花生油配制，0.15 mL/10 g)，16 h后摘眼球取血同時取肝組織。全血3 000 r/min離心10 min，取上層血清，檢測ALT、AST、TBA、DBIL、TBIL各項指標；取0.1 g肝臟組織，用4℃生理鹽水制成10%的肝勻漿，離心，取上清液，檢測TP、SOD、MDA、GSH各項生化指標；各指標的檢測均按其試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 肝臟組織學(xué)分析

取各組小鼠肝臟相同部位的肝組織，用10%甲醛溶液固定，之后進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片展片、HE染色，最后置光鏡下觀察肝組織的損傷程度。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均以“均值±標準差”表示(n=10)，采用數(shù)據(jù)分析軟件Graph Pad Prism 5進行單因素方差分析，組間差異采用t檢驗，p<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 梔子油對急性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性和TBA、TBIL、DBIL水平的影響(見表1)

表1 梔子油對急性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性和TBA、TBIL、DBIL水平的影響

注：相對于正常對照組，△表示p<0.05，△△表示p<0.01，△△△表示p<0.001；相對于模型組，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。下同。

由表1可知，模型組小鼠血清ALT、AST活性及TBA、TBIL、DNIL水平非常顯著高于正常對照組(p<0.001)，表明四氯化碳急性肝損傷模型很成功；與模型組相比，梔子油中劑量組顯著降低急性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性(p<0.05)；梔子油中劑量組、高劑量組的TBA、TBIL水平具有顯著性降低(p<0.05)；比較DBIL水平則梔子油中劑量組具有極顯著性降低(p<0.01)，梔子油高劑量組非常顯著性降低(p<0.001)。同樣，與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組非常顯著降低肝損傷小鼠血清ALT、AST活性及DBIL水平(p<0.001)，極顯著性降低TBA水平(p<0.01)，顯著降低TBIL水平(p<0.05)。

2.2 梔子油對急性肝損傷小鼠肝組織SOD活力及MDA、GSH水平的影響(見表2)

表2 梔子油對急性肝損傷小鼠肝組織SOD活力及MDA、GSH水平的影響

由表2可知，相比正常對照組，四氯化碳誘導(dǎo)的模型組小鼠產(chǎn)生了顯著的氧化還原反應(yīng)，表現(xiàn)在肝組織中MDA水平的非常顯著提高(p<0.001)及SOD活力、GSH水平的非常顯著降低(p<0.001)。與模型組相比，梔子油低劑量組、中劑量組MDA水平均有極顯著性差異(p<0.01)，梔子油高劑量組MDA水平具有非常顯著性差異(p<0.001)；比較梔子油各劑量組與模型組GSH水平和SOD活力，梔子油高劑量組具有極顯著性差異(p<0.01)；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組SOD活力、MDA和GSH水平均具有極顯著性(p<0.01)或顯著性差異(p<0.05)。從以上結(jié)果可得聯(lián)苯雙酯組及梔子油各劑量組都顯著降低四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，具有顯著的降酶、抑制自由基生成等保肝作用。

2.3 肝臟病理學(xué)檢查(見圖1)

圖1 梔子油對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的肝組織病理組織學(xué)的影響(HE×40)

由圖1可見，在高倍光學(xué)顯微鏡下觀察各組肝臟病理學(xué)切片，正常對照組小鼠肝臟的肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞明顯呈以中央靜脈為中心放射狀排列，同時肝細胞基本都呈正常形態(tài)；肝損傷模型組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂，肝細胞出現(xiàn)明顯的纖維化，細胞核有明顯聚集，也有清晰可見的壞疽；聯(lián)苯雙酯組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)大致恢復(fù)正常態(tài)，組織結(jié)構(gòu)相對完整；與肝損傷模型組進行比較，梔子油中、高劑量組的肝細胞變性、壞死情況明顯降低，說明其肝損傷情況有所改善。

3 討 論

四氯化碳肝損傷模型是經(jīng)過氧化脅迫和脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)肝臟損傷[11]，是一個非常經(jīng)典的急性肝損傷的模型，四氯化碳進入體內(nèi)后進行肝臟酶系統(tǒng)代謝，通過細胞色素P450及結(jié)合反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物最終生成CCl3OO自由基，進一步會對細胞膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等具膜物質(zhì)進行攻擊，進而引起肝細胞膜脂質(zhì)過氧化[12]，細胞膜的破壞會引起肝細胞通透性改變甚至凋亡，而丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)存在于肝細胞內(nèi)，當(dāng)細胞膜遭到破壞，導(dǎo)致其大量進入血漿中，進而使血清中ALT和AST的活力顯著增強，血清ALT和AST活力亦是檢測肝損傷程度的敏感指標[13]?？偰懠t素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)的正常代謝依賴于肝細胞，肝細胞受損時對其清除能力降低，導(dǎo)致其水平上升。總膽汁酸(TBA)是在肝臟內(nèi)合成以及代謝，是在肝臟酶系統(tǒng)代謝下由膽固醇轉(zhuǎn)化得到，故TBA可以作為對肝損傷程度的評價指標[14]。超氧化物歧化酶(SOD)是機體清除自由基的特異性酶，SOD活性的降低直接表明機體內(nèi)自由基產(chǎn)生的增加；丙二醛(MDA)是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的一個重要產(chǎn)物，其含量的高低又間接反應(yīng)了機體細胞受自由基攻擊的程度[15]；還原型谷胱甘肽(GSH)為解除毒素的特效物質(zhì)，是一種小分子肽，作為體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑，其被自由基的消耗程度也反映了肝損傷的程度。

4 結(jié) 論

本實驗中，梔子油中劑量組(0.6 g/kg)、高劑量組(1.2 g/kg)與模型組進行比較，小鼠血清中ALT、AST活性，TBA、DBIL和TBIL水平均顯著下降，效果近乎達到聯(lián)苯雙酯組水平，說明梔子油對脂質(zhì)過氧化有減弱效果，進而對四氯化碳所致小鼠肝損傷有保護作用；梔子油高劑量組顯著升高小鼠肝臟中SOD活力、GSH水平、降低MDA水平，表明一定劑量的梔子油可以通過提升SOD活力與GSH水平來抑制MDA的生成，阻止肝細胞進一步脂質(zhì)過氧化，減少自由基的生成，維持肝細胞膜的正常形態(tài)，降低肝細胞的損傷程度。以上情況說明，降酶、抑制自由基脂質(zhì)過氧化、維持膜正常態(tài)可能就是梔子油具有保肝功能的機制。

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ProtectiveeffectofGardeniaoiloncarbontetrachlorideacuteliverinjuryinmice

ZHANG Fengbo，LUO Guangming，XIAO Richuan，YUAN Yuanjian，RAO Yaqi，LI Bo，XIE Jing

(School of pharmacy, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China)

The protective effect ofGardeniaoil on carbon tetrachloride acute liver injury in mice was studied and its protective mechanism was investigated. The activities of ALT, AST and levels of TBA, TBIL, DBIL in serum, the activities of SOD and levels of MDA and GSH in liver tissue were measured and pathological morphological in liver tissues were monitored by HE staining section in carbon tetrachloride acute liver injury mice. The protective effect of different doses group ofGardeniaoil on carbon tetrachloride acute liver injury in mice was discussed. The results showed that compared with model group, middle dose group (0.6 g/kg) and high dose group (1.2 g/kg) ofGardeniaoil could significantly improve the pathological changes of liver tissue in carban tertrachloride acute liver injury mice, and could significantly reduce the activities of ALT, AST and the levels of TBA, TBIL, DBIL in serum. High dose group (1.2 g/kg) ofGardeniaoil could improve the SOD activity and GSH level, and reduce the MDA content in liver homogenate.Gardeniaoil had a significant hepatoprotective effect on carbon tetrachloride induced liver injury mice. The mechanism might be related to enzyme decreasing, inhibition of free radical lipid peroxidation and maintenance of normal morphology of hepatic cells.

Gardeniaoil; liver injury; lipid peroxidation; hepatoprotective

2016-11-21；

：2017-04-21

國家公益性科研專項(201507002)

張風(fēng)波(1992)，男，在讀碩士，研究方向為中藥資源開發(fā)與應(yīng)用(E-mail)1006365094@qq.com。

羅光明，教授，博士生導(dǎo)師(E-mail)jzlgm88@163.com。

TS225.1；R965.1

：A

：1003-7969(2017)07-0128-04