GC-MS分析毛霉型、細(xì)菌型、曲霉型豆豉中脂肪酸組成

謝艷華, 謝 靚 , 李 跑 , 陳淼芬, 蔣立文,3, 陳力力,3

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，長沙 410128； 2.獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，長沙 410128；3.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410128)

GC-MS分析毛霉型、細(xì)菌型、曲霉型豆豉中脂肪酸組成

謝艷華1, 謝 靚1, 李 跑1, 陳淼芬2, 蔣立文1,3, 陳力力1,3

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，長沙 410128； 2.獸用中藥資源與中獸藥創(chuàng)制國家地方聯(lián)合工程研究中心，長沙 410128；3.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410128)

采用正己烷提取大豆、毛霉型豆豉、細(xì)菌型豆豉和曲霉型豆豉中粗脂肪，通過氫氧化鉀-甲醇和硫酸-甲醇對油脂進(jìn)行甲酯化處理，采用GC-MS分析脂肪酸組成，用外標(biāo)法對脂肪酸進(jìn)行定量。結(jié)果表明：大豆、毛霉型豆豉、細(xì)菌型豆豉和曲霉型豆豉中均含有12種脂肪酸，其中飽和脂肪酸7種，單不飽和脂肪酸3種，多不飽和脂肪酸2種，以亞油酸含量最高，不飽和脂肪酸含量高于飽和脂肪酸含量。不飽和脂肪酸含量(以干基計(jì))從高到低依次是毛霉型豆豉(23.52 g/100 g)、大豆(16.51 g/100 g)、細(xì)菌型豆豉(15.35 g/100 g)、曲霉型豆豉(7.00 g/100 g)。大豆經(jīng)毛霉發(fā)酵成豆豉后，其主要脂肪酸含量得到提高，而經(jīng)細(xì)菌和曲霉發(fā)酵成豆豉后，主要脂肪酸含量有所降低。

大豆；毛霉型豆豉；細(xì)菌型豆豉；曲霉型豆豉；脂肪酸；GC-MS

豆豉是大豆在微生物及酶的作用下制成的一種傳統(tǒng)調(diào)味副食品, 因風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富備受人們喜愛[1]。根據(jù)豆豉制曲過程中的微生物種類，可分為:毛霉型、細(xì)菌型、曲霉型、根霉型豆豉和脈孢菌型豆豉五大類。常見的是細(xì)菌型、毛霉型豆豉和曲霉型豆豉三大類。參與細(xì)菌型、毛霉型、曲霉型豆豉發(fā)酵的微生物分別是納豆芽孢桿菌、毛霉、米曲霉。

豆豉制作過程中油脂成分會(huì)保留到最終成品中，使得豆豉富含脂肪酸。脂肪酸不僅是營養(yǎng)成分，而且是風(fēng)味形成的前體物質(zhì)，可以改善口感質(zhì)構(gòu)，同時(shí)有保健功效。豆豉中脂肪酸主要包含棕櫚酸、油酸、亞油酸、亞麻酸等，這些脂肪酸能顯著影響和改善人類神經(jīng)或精神類疾病，作用于內(nèi)分泌失調(diào)以及代謝綜合癥相關(guān)的疾病，如糖尿病等[2-3]。

發(fā)酵型產(chǎn)品微生物能夠分泌脂肪酶，并且加入食鹽、白酒、生姜、面粉等，體系復(fù)雜，對脂肪酸有一定的影響。徐春濤等[4]研究發(fā)現(xiàn)醬油渣油脂中的亞油酸占比為49.46%，亞麻酸為8.76%，硬脂酸為4.75%，油酸為20.68%。微生物發(fā)酵能夠改變原料中脂肪酸含量，周思靜等[5]研究丹貝中的營養(yǎng)成分，發(fā)現(xiàn)丹貝中的不飽和脂肪酸、亞油酸和亞麻酸的含量與大豆中的相比均顯著性增加，分別增加了5.52、6.01、4.68倍。發(fā)酵過程中脂肪酸的變化趨勢不固定，田甜[6]采用酸堿作為脂肪酸衍生化試劑，研究豆醬發(fā)酵過程中脂肪酸含量變化，發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸含量在發(fā)酵45 d達(dá)到最大，隨后有所降低。

本文擬在大豆發(fā)酵過程中，將毛霉、納豆芽孢桿菌、米曲霉作為發(fā)酵劑分別接種，通過氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用法進(jìn)行分析、鑒定，并比較其脂肪酸組成和含量，以期為合理有效地開發(fā)、利用及推廣發(fā)酵豆制品提供可靠數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

大豆，購于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東之源超市；毛霉 (CGMCC8700)、納豆芽孢桿菌 (教研室從納豆中分離并純化)、米曲霉 (As3.042)，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院提供。

甲醇、正己烷，色譜純；無水硫酸鈉、氫氧化鉀、硫酸，分析純；37種脂肪酸甲酯混標(biāo)，美國西格瑪奧德里奇公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；ML204/02精密天平，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；KQ5200DE超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；DHG-9246A電熱恒溫干燥箱；XW-80A旋渦混合器，上海青浦滬西儀器廠；HERMLE 2323K冷凍離心機(jī)，德國；FW100高速萬能粉碎機(jī)，天津市太斯特儀器有限公司；

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 純種毛霉型、細(xì)菌型、曲霉型豆豉的制作

純種毛霉型豆豉的制作：大豆精選去雜→浸泡約12 h→水洗→熟化(121℃、20 min)→冷卻→接種擴(kuò)大培養(yǎng)的毛霉(接種量1%)→前發(fā)酵(25℃、48～72 h)→后發(fā)酵(8%食鹽、0.5%白酒、1%生姜、發(fā)酵時(shí)間30 d以上)→成熟。

純種細(xì)菌型豆豉的制作：大豆精選去雜→浸泡約12 h使體積增加至2倍左右→熟化(121℃、20 min)→冷卻→接種擴(kuò)大培養(yǎng)的納豆芽孢桿菌液(接種量1%)→40℃發(fā)酵24 h→冷藏48 h。

純種曲霉型豆豉的制作：大豆精選去雜→浸泡(夏季4～6 h)→熟化(121℃、20 min)→攤涼→冷卻→接種米曲霉(接種量1%)→制曲→拌料(8%食鹽、2%白酒和1%的甜酒)→裝壇→厭氧保溫后發(fā)酵(35℃，15 d)。

1.2.2 大豆、細(xì)菌型豆豉、毛霉型豆豉和曲霉型豆豉粗脂肪提取

取大豆、成熟毛霉型豆豉、細(xì)菌型豆豉和曲霉型豆豉各60 g，置于80℃烘箱中干燥至恒重,研磨粉碎后過40目篩得到干粉。分別將準(zhǔn)確稱取的0.12 g干大豆粉和干豆豉粉置于15 mL試管中，加入6 mL正己烷。提取條件為：超聲波功率350 W，提取溫度40℃，提取時(shí)間30 min。

1.2.3 大豆、細(xì)菌型豆豉、毛霉型豆豉和曲霉型豆豉脂肪酸組成及含量測定。

1.2.3.1 脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

先將37種脂肪酸甲酯混標(biāo)配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：將1 mL 10 g/L 37種脂肪酸甲酯混標(biāo)移至10 mL容量瓶中，并用正己烷定容。-20℃下避光保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：吸取2.5 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于5 mL容量瓶中，并用正己烷定容，制成0.500 0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，再從中吸取2.5 mL于新的5 mL容量瓶中，正己烷定容，制成0.250 0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，以此類推，分別制成0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.100 0、0.050 0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液以供GC-MS檢測使用。每個(gè)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液重復(fù)進(jìn)樣3次。

1.2.3.2 大豆、細(xì)菌型豆豉、毛霉型豆豉和曲霉型豆豉脂肪酸甲酯化

在已提取粗脂肪的15 mL試管中，加入0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液3 mL，60℃水浴酯化15 min，冷卻至室溫，加入體積分?jǐn)?shù)5%硫酸-甲醇溶液3 mL，60℃水浴酯化15 min，冷卻后加入少許無水硫酸鈉，4 000 r/min離心2 min。靜置分層，吸取上清液于干燥潔凈試管中，使用旋渦混合器使其混合均勻，通過0.22 μm的濾膜過濾后注入干燥好的潔凈樣品瓶中。

1.2.3.3 GC條件

色譜柱：CD-WAX石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；升溫程序：柱溫45℃，保持1 min，以5℃/min速率升溫至290℃，保持2 min。載氣：高純氦氣(99.999%)；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度為250℃；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL。

1.2.3.4 MS條件

電子轟擊離子源；離子源溫度200℃；發(fā)射電流150 μA；倍增器電壓1 037 V；萃取頭接口溫度220℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍 (m/z)45～500 。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

樣品均進(jìn)行3次重復(fù)，將檢測結(jié)果進(jìn)行定性和定量分析，采用SAS、Origin7.5等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，比較不同方法之間的差異性。

定性分析：將檢測信息用美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所NIST14s.LIB譜庫檢索，查詢文獻(xiàn)資料，對大豆、毛霉型豆豉、細(xì)菌型豆豉和曲霉型豆豉中各脂肪酸甲酯進(jìn)行核對和確認(rèn)(相似度值≥90%，相對含量≥0.1%)。

定量分析：采用峰面積歸一化法計(jì)算各成分的相對含量，外標(biāo)法計(jì)算各成分的絕對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及其相關(guān)系數(shù)

經(jīng)過GC-MS分析得到37種脂肪酸甲酯混標(biāo)總離子流圖，結(jié)果見圖1。根據(jù)各相關(guān)色譜峰的離子質(zhì)量，并檢索NIST14s.LIB譜庫，確定其脂肪酸的種類。從圖1可知，脂肪酸甲酯總離子流圖基線穩(wěn)定且離子峰基本分離。

圖137種脂肪酸甲酯混標(biāo)的總離子流圖

根據(jù)不同質(zhì)量濃度37種脂肪酸甲酯混標(biāo)的總離子流圖，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，相對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 主要脂肪酸甲酯線性關(guān)系

從表1可知，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均在0.999 0以上，說明在測定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，12種脂肪酸甲酯線性關(guān)系良好，適合于4種大豆及大豆制品相關(guān)脂肪酸的定量分析。

2.2 大豆、毛霉型豆豉、細(xì)菌型豆豉及曲霉型豆豉主要脂肪酸的組成及含量

采用NIST 14s.LIB質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫和人工譜圖解析相結(jié)合的手段將色譜圖進(jìn)行比對，對總離子流圖中各組分進(jìn)行峰面積歸一化，結(jié)合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)曲線得出大豆、毛霉型豆豉、細(xì)菌型豆豉以及曲霉型豆豉中脂肪酸組成及含量(以干基計(jì))，結(jié)果見表2。

表2 大豆、毛霉型豆豉、細(xì)菌型豆豉、曲霉型豆豉的脂肪酸組成及含量 g/100 g

2.2.1 脂肪酸總含量異同分析

從表2可知，4 種樣品主要的脂肪酸均由C14～C22之間的飽和及不飽和脂肪酸組成，均含有12種相同種類脂肪酸，其中7種飽和脂肪酸，5種不飽和脂肪酸，說明大豆發(fā)酵不會(huì)改變其脂肪酸種類。4種樣品主要脂肪酸均為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸，這與鄒筱等[7]研究大豆的結(jié)果一致，與雷雨和等[8]分析毛霉型豆豉的結(jié)果相同。脂肪酸種類與田甜等[9]用酸堿甲酯化法從豆醬中得到的脂肪酸種類相近，顯著多于酸甲酯化法和堿甲酯化法處理豆醬檢測得到的脂肪酸種類，表明甲酯化方法對脂肪酸分析結(jié)果的影響較大。

毛霉型豆豉的不飽和脂肪酸含量最高(23.52 g/100 g)，分別是大豆、細(xì)菌型豆豉、曲霉型豆豉中不飽和脂肪酸的1.42倍、1.53倍、3.36倍。有研究發(fā)現(xiàn)丹貝(根霉型豆豉)中不飽和脂肪酸含量是原料大豆的5.52倍，納豆(細(xì)菌型豆豉)的7.15倍[10]。表明不同微生物和不同加工工藝對脂肪酸有影響，具體原因有待進(jìn)一步探究。毛霉發(fā)酵使大豆的不飽和脂肪酸含量升高，一方面可能是因?yàn)槊剐投刽蟀l(fā)酵階段是一個(gè)厭氧發(fā)酵階段，且食鹽、白酒等的添加使大部分微生物生長受到抑制，在氧氣含量較低及酯酶受到抑制的情況下，脂肪酸自動(dòng)氧化速率大大降低；另一方面可能是亞麻酸是生物膜的結(jié)構(gòu)材料，毛霉在發(fā)酵生長過程中具有超常的油脂合成能力，同時(shí)油脂中含有γ-亞麻酸，利用毛霉、雅致枝霉、根霉生產(chǎn)γ-亞麻酸早有報(bào)道[11]，亞油酸含量升高也可能是這個(gè)原因，確切原因還有待進(jìn)一步考究；納豆芽孢桿菌和曲霉發(fā)酵大豆后不飽和脂肪酸含量有所降低，是因?yàn)榘l(fā)酵過程中微生物的生長需要能量，消耗了大量的碳水化合物之后，需要消耗脂肪作為能量補(bǔ)充。4種樣品中多不飽和脂肪酸為亞油酸和亞麻酸，均為必需脂肪酸，是人體生長和發(fā)育的必需物質(zhì)，必需脂肪酸攝入不足是免疫力降低、疲勞、健忘、視力減退以及各種心腦血管疾病和癌癥等的誘因[12-13]。因此，適當(dāng)多吃豆豉可以預(yù)防心血管等一系列疾病。

2.2.2 棕櫚酸含量差異

棕櫚酸又稱軟脂酸，是飽和脂肪酸的一種。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為碳鏈長度為C12～C16的飽和脂肪酸如肉豆蔻酸、棕櫚酸等會(huì)引起血清總膽固醇的升高，而血清總膽固醇水平越高，心血管疾病的發(fā)病率就越高[14]。但是近期有研究表明，飽和脂肪酸與心血管疾病并沒有直接聯(lián)系[15]。且4種樣品中，棕櫚酸含量均不高，含量最高的是毛霉型豆豉，僅7.65 g/100 g，含量最低的是曲霉型豆豉(1.60 g/100 g)，因此豆豉喜愛者不必有太多的擔(dān)憂。

2.2.3 硬脂酸含量差異

硬脂酸也是飽和脂肪酸的一種，大豆硬脂酸含量為1.83 g/100 g，大豆經(jīng)過曲霉和納豆芽孢桿菌發(fā)酵后硬脂酸含量均有所降低，而經(jīng)過毛霉發(fā)酵的大豆，硬脂酸含量提高到2.47 g/100 g，可見發(fā)酵菌種不同對于硬脂酸的變化有一定影響。有研究發(fā)現(xiàn)硬脂酸和ω-3多不飽和脂肪酸一樣與心肌梗塞的發(fā)病率呈反比，這可能與硬脂酸和ω-3多不飽和脂肪酸與心肌梗塞的發(fā)病機(jī)理有關(guān)[16]。還有研究表明，硬脂酸能作為ω-3多不飽和脂肪酸的補(bǔ)充來源[17]。豆豉中含有少量硬脂酸，適量攝入可改善和提高人體的健康狀況。

2.2.4 油酸含量差異

大豆、毛霉型豆豉、細(xì)菌型豆豉和曲霉型豆豉油脂中主要的單不飽和脂肪酸為油酸。4種樣品中油酸含量均較高，含量從高到低依次是毛霉型豆豉、細(xì)菌型豆豉、大豆、曲霉型豆豉，表明大豆經(jīng)毛霉和細(xì)菌發(fā)酵之后油酸含量均得到提高，而經(jīng)過曲霉發(fā)酵其含量反而降低，毛霉型豆豉和細(xì)菌型豆豉其油酸含量升高是由于在發(fā)酵的過程中多不飽和脂肪酸氧化所得。同時(shí)油脂中油酸和亞油酸共存時(shí)，亞油酸可誘導(dǎo)油酸氧化，可能是在曲霉型豆豉中油酸氧化的速率大于多不飽和脂肪酸自動(dòng)氧化成油酸的速率。多年來，對單不飽和脂肪酸的生理與保健作用存在爭議，但近年來的研究普遍認(rèn)為順式單不飽和脂肪酸對膽固醇和血糖有明顯的降低作用[18-19]，即油酸有降低膽固醇和血糖的作用。

2.2.5 亞油酸含量差異

4種樣品含有的多不飽和脂肪酸中亞油酸的含量最高。曲霉型豆豉中亞油酸含量最低，而毛霉型豆豉中亞油酸含量高達(dá)14.15 g/100 g。作為最早被確認(rèn)的必需脂肪酸和重要的多不和脂肪酸，人體每天攝取6 g亞油酸，才能維持正常的生理代謝，它具有防癌抗癌、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、 抗粥狀動(dòng)脈硬化和預(yù)防非酒精性脂肪肝以及炎癥等多種生理功能[20]。對于需要攝入較多亞油酸的人群，適當(dāng)?shù)囟嗍秤妹剐投刽潜容^適宜的。

2.2.6 亞麻酸含量差異

亞麻酸是一種必需脂肪酸，在體內(nèi)代謝可生成二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸。亞麻酸同樣具備多不飽和脂肪酸的多種生理功能，突出表現(xiàn)在具有改善記憶力、健腦、預(yù)防老年癡呆癥、增強(qiáng)機(jī)體免疫力以及對心血管疾病的防治上[21-22]。4種樣品中亞麻酸含量均較高。

3 結(jié) 論

本研究在大豆、毛霉型豆豉、細(xì)菌型豆豉和曲霉型豆豉中均鑒定出12種脂肪酸，說明發(fā)酵不會(huì)改變大豆中的脂肪酸種類。4種樣品中飽和脂肪酸以棕櫚酸為主，單不飽和脂肪酸以油酸為主，且不飽和脂肪酸含量較高。另外還含有少量其他種類的脂肪酸如：十五烷酸、肉豆蔻酸、花生酸、山崳酸等。研究表明：不同菌種發(fā)酵的大豆中脂肪酸在含量上均存在一定的差異，相比原料大豆，毛霉型豆豉脂肪酸含量大幅提高，細(xì)菌型豆豉和曲霉型豆豉脂肪酸含量有所降低。其中毛霉型豆豉中不飽和脂肪酸含量最高，達(dá)23.52 g/100 g。因此，毛霉型豆豉是不飽和脂肪酸的新型來源，可作為膳食營養(yǎng)補(bǔ)充劑添加到食品中，進(jìn)一步開發(fā)為功能性食品。

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GC-MSanalysisoffattyacidcompositioninmucor-type,bacterial-typeandaspergillus-typedouchi

XIE Yanhua1, XIE Jing1, LI Pao1, CHEN Miaofen2, JIANG Liwen1,3, CHEN Lili1,3

(1.College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.National and Provincial Union Engineering Research Center for the Veterinary Herbal Medicine Resources and Initiative, Changsha 410128, China; 3. Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, Changsha 410128, China)

The crude fats in soybean, mucor-type, bacterial-type and aspergillus-type douchi were extracted by hexane and esterified with KOH-CH3OH and H2SO4-CH3OH. The fatty acid composition was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and quantified by an external standard method. The results showed that twelve kinds of fatty acids were detected in soybean, mucor-type, bacterial-type and aspergillus-type douchi, including seven kinds of saturated fatty acids, three kinds of monounsaturated fatty acids and two kinds of polyunsaturated fatty acids. Among these fatty acids, the content of linoleic acid was the highest and the content of unsaturated fatty acids was higher than that of saturated fatty acids. The contents of unsaturated fatty acids (dry basis) from high to low were mucor-type douchi(23.52 g/100 g), soybean (16.51 g/100 g), bacterial-type douchi (15.35 g/100 g) and aspergillus-type douch (7.00 g/100 g). After soybean fermented into mucor-type douchi, the contents of main fatty acids increased. However, after soybean fermented into bacterial-type and aspergillus-type douchi, the contents of main fatty acids decreased.

soybean；mucor-type douchi；bacterial-type douchi; aspergillus-type douchi；fatty acid; GC-MS

2016-11-01；

：2017-03-20

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371828)

謝艷華(1990)，女，在讀碩士，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程(E-mail)1522129239@qq.com。

蔣立文，教授(E-mail)jlw_2002cn@yahoo.com.cn;陳力力，教授(E-mail)chenlili001@tom.com。

TS225.2; TQ644.3

：A

：1003-7969(2017)07-0115-06