水通道蛋白4在肺癌裸小鼠模型中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖與遷移的影響研究

周永春，張 琦，陳琬玲，方 育，李融林，張 璟

·論著·

水通道蛋白4在肺癌裸小鼠模型中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖與遷移的影響研究

周永春1，張 琦2，陳琬玲3，方 育4，李融林2，張 璟2

目的探討水通道蛋白4(AQP4)在肺癌裸小鼠模型中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖與遷移的影響。方法2016年12月于昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院云南省肺癌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選取SPF級(jí)雄性裸小鼠60只并采用隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組與觀(guān)察組，每組30只。對(duì)照組裸小鼠于背側(cè)靠腋窩處皮下注射未轉(zhuǎn)染的A549肺癌細(xì)胞0.2 ml以建立肺癌裸小鼠模型，而觀(guān)察組裸小鼠于背側(cè)靠腋窩處皮下注射AQP4-shRNA轉(zhuǎn)染的A549肺癌細(xì)胞0.2 ml以建立肺癌裸小鼠模型。比較兩組裸小鼠腫瘤重量、微血管密度(MVD)，AQP4、E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏著蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表達(dá)水平。結(jié)果觀(guān)察組裸小鼠腫瘤重量及MVD低于對(duì)照組(P<0.05)。觀(guān)察組裸小鼠AQP4、N-cadherin、Vimentin表達(dá)水平低于對(duì)照組，E-cadherin表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論APQ4在肺癌裸小鼠模型中表達(dá)增強(qiáng)，其可能參與了肺癌的病理生理過(guò)程，可在一定程度上促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移。

肺腫瘤；小鼠，裸；水通道蛋白質(zhì)4

近年來(lái)，隨著工業(yè)的發(fā)展、空氣污染加重及人們生活習(xí)慣的改變，肺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。目前，臨床診療技術(shù)不斷提高，使肺癌的早期診斷和治療方法改進(jìn)，但肺癌患者的5年生存率未改善[1]。水通道蛋白(AQPs)是近年發(fā)現(xiàn)的一組與水通道有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其在細(xì)胞膜上組成孔道，可影響水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境平衡[2]；其種類(lèi)較多，且分布于不同的組織中，在多種生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用[3]。研究表明，AQPs在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、擴(kuò)散及侵襲過(guò)程中表達(dá)增強(qiáng)[4]。本研究旨在探討水通道蛋白4(AQP4)在肺癌裸小鼠模型中的表達(dá)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖與遷移的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性的裸小鼠60只，體質(zhì)量15～22 g，月齡4～6個(gè)月，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物編號(hào)：SCXK(滬)2015-0002；飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室SPF環(huán)境中，溫度(24±2)℃，濕度60%～70%。實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理方式符合動(dòng)物倫理要求。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 免疫組化化學(xué)試劑盒和酶底物購(gòu)自北京中杉生物科技有限公司；山羊抗兔一抗和二抗購(gòu)自賽默飛公司；預(yù)染液Marker購(gòu)自美國(guó)New England Biolab公司，Ecl發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)皮爾斯公司；臺(tái)盼藍(lán)染液購(gòu)自上海科興生物有限公司；碘伏購(gòu)自上海翔升實(shí)業(yè)有限公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；蘇木精購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich；AQP4抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；3′3二氨基聯(lián)苯胺購(gòu)自鄭州阿爾法化工有限公司；E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與儀器 2123型孵育箱(美國(guó)Shellab)；TGL-16G型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))；XS-212-201型光學(xué)顯微鏡(南京光電集團(tuán)股份有限公司)；XDS-1B型倒置顯微鏡(重慶光電集團(tuán)股份有限公司)；WD800型微波爐(廣東格蘭仕公司)；HS-ES 500型生物組織石蠟包埋機(jī)(金華市華速科技有限公司)；A1004N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；研磨器(鞏義市穎輝高鋁瓷廠(chǎng))；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(上海晶安生物科技有限公司)；RM2145石蠟標(biāo)本切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)；SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組方法 2016年12月于昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院云南省肺癌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)裸小鼠進(jìn)行編號(hào)并采用隨機(jī)數(shù)字表法分為觀(guān)察組與對(duì)照組，每組30只。觀(guān)察組裸小鼠體質(zhì)量16～21 g，平均體質(zhì)量(17.3±4.6)g；對(duì)照組裸小鼠體質(zhì)量15～22 g，平均體質(zhì)量(18.1±3.5)g。兩組裸小鼠體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.758，P>0.05)。

1.2.2 模型制備方法 (1)采用10%小牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素、10%非必需氨基酸的RPMI1640培養(yǎng)基，于37 ℃，5%的CO2孵育箱中進(jìn)行肺癌細(xì)胞培養(yǎng)，定期換液，3～5 d傳代一次，培養(yǎng)18 h將細(xì)胞進(jìn)行消化、離心和重懸后稀釋為1×106個(gè)/L，以2 ml/孔接種于6孔培養(yǎng)板中。(2)以AQP4-shRNA轉(zhuǎn)染A549肺癌細(xì)胞，采用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色標(biāo)記活細(xì)胞數(shù)，裸小鼠背側(cè)靠腋窩處經(jīng)碘伏消毒，觀(guān)察組裸小鼠皮下注射AQP4-shRNA轉(zhuǎn)染A549肺癌細(xì)胞0.2 ml(細(xì)胞密度：3×107/ml)，對(duì)照組裸小鼠皮下注射未轉(zhuǎn)染的A549肺癌細(xì)胞0.2 ml。(3)接種后7～10 d，裸小鼠接種部位出現(xiàn)硬結(jié)節(jié)狀組織，以確定建模成功。

1.2.3 標(biāo)本采集 于造模成功后以離斷頸椎法處死兩組裸小鼠，摘取腫瘤組織，稱(chēng)重并記錄；腫瘤組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片(4 μm)，蘇木素染色，常規(guī)脫水，透片，封片。

1.2.4 觀(guān)察指標(biāo) (1)腫瘤重量、微血管密度(MVD)：采用A1004N電子天平稱(chēng)量?jī)山M裸小鼠腫瘤重量；采用CD34標(biāo)記，于100倍低倍鏡下全面觀(guān)察切片以確定血管高密度區(qū)域；在200倍視野下觀(guān)察與周?chē)[瘤細(xì)胞和結(jié)締組織成分明顯區(qū)別的任何一個(gè)棕色染色的細(xì)胞簇作為一個(gè)微血管，只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)也可作為一個(gè)微血管進(jìn)行計(jì)數(shù)，記錄8個(gè)視野內(nèi)的微血管數(shù)，取平均值。(2)AQP4、E-鈣黏著蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏著蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表達(dá)水平：兩組裸小鼠標(biāo)本予以3%過(guò)氧化氫孵育消除過(guò)氧化物酶活性，微波修復(fù)10 min，滴加非免疫性血清，室溫孵育20 min后去除血清；滴加AQP4抗體，過(guò)夜后利用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗脫后進(jìn)行染色，利用3′3二氨基聯(lián)苯胺進(jìn)行顯色反應(yīng)；采用蘇木精復(fù)染，封片后觀(guān)察顏色變化(棕黃色為陽(yáng)性)；E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的檢測(cè)方法同AQP4(AQPs抗體分別更換為E-cadherin、N-cadherin、Vimentin抗體)。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤重量、MVD觀(guān)察組裸小鼠腫瘤重量為(0.41±0.18)g，對(duì)照組裸小鼠腫瘤重量為(1.02±0.23)g。觀(guān)察組裸小鼠腫瘤重量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.98，P<0.05)。觀(guān)察組裸小鼠MVD為(20.1±9.2)條；對(duì)照組裸小鼠MVD為(45.2±12.3)條。觀(guān)察組裸小鼠MVD低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.38，P<0.05)。兩組裸小鼠腫瘤細(xì)胞質(zhì)量形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 兩組裸小鼠腫瘤質(zhì)量

2.2AQP4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達(dá)水平 光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)裸小鼠腫瘤組織中AQP4、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表達(dá)(見(jiàn)圖2)；觀(guān)察組裸小鼠AQP4、N-cadherin、Vimentin表達(dá)水平低于對(duì)照組，E-cadherin表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

Table1 Comparison of expressions of AQP4，E-cadherin，N-cadherin and Vimentin of nude mice between the two groups

組別例數(shù)AQP4E-cadherinN-cadherinVimentin對(duì)照組300.27±0.030.31±0.020.41±0.040.34±0.03觀(guān)察組300.23±0.020.36±0.030.34±0.030.28±0.02t值6.0767.5967.6689.115P值<0.05<0.05<0.05<0.05

注：AQP4=水通道蛋白4，E-cadherin=E-鈣黏著蛋白，N-cadherin=N-鈣黏著蛋白，Vimentin=波形蛋白

注：AQP4=水通道蛋白4，E-cadherin=E-鈣黏著蛋白，N-cadherin=N-鈣黏著蛋白，Vimentin=波形蛋白

圖2 兩組裸小鼠AQP4、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達(dá)情況(HE染色，×100)

Figure2 Expressions of AQP4，E-cadherin，N-cadherin and Vimentin of nude mice of the two groups

3 討論

肺癌是最常見(jiàn)的肺原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率居男性惡性腫瘤之首，嚴(yán)重威脅人們生命健康。外科手術(shù)是目前治療早期肺癌的主要手段，但患者生存率較低；另外，放化療治療晚期肺癌患者的毒副作用較多，且治療效果欠佳。因此，肺癌的治療仍是臨床亟待解決的難題之一。近年來(lái)，隨著肺癌靶向治療的發(fā)展，許多靶點(diǎn)相繼發(fā)現(xiàn)給肺癌患者帶來(lái)了福音。

AQPs是一組小分子疏水性的內(nèi)在膜蛋白家族，存在于動(dòng)物、植物和微生物的細(xì)胞膜上，目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)20種亞型，各種亞型均有相似的蛋白結(jié)構(gòu)和高度同源的DNA序列，均具有促進(jìn)血管增生和增加血管滲透性的作用[4-5]。APQ4由2個(gè)重復(fù)跨膜域構(gòu)成，有2個(gè)連接環(huán)，且每個(gè)鏈接環(huán)包含1個(gè)天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸特征性序列，當(dāng)2個(gè)鏈接環(huán)發(fā)生重疊并形成1個(gè)孔道時(shí)可使1個(gè)水分子實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[6-8]。研究表明，APQ4具備水分子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，可增強(qiáng)細(xì)胞膜水滲透性，促使腫瘤細(xì)胞遷移[9]；其敲除可明顯降低星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移能力[10]；并在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[11-12]。

本研究結(jié)果顯示，觀(guān)察組裸小鼠腫瘤重量、MVD低于對(duì)照組，與相關(guān)研究結(jié)果一致[13]，提示APQ4可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和血管生成。研究表明，APQ4可增加腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散能力，N-cadherin和Vimentin有助于提高細(xì)胞生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)移能力，尤其在侵襲性腫瘤中；E-cadherin可保持上皮細(xì)胞的正常功能和完整性，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散[14]；APQ4在肺癌中的表達(dá)水平較高，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移[15]。本研究結(jié)果顯示，觀(guān)察組裸小鼠AQP4、N-cadherin、Vimentin表達(dá)水平低于對(duì)照組，E-cadherin表達(dá)水平高于對(duì)照組，與相關(guān)研究結(jié)果一致[14]。分析原因可能為本研究觀(guān)察組通過(guò)抑制APQ4的表達(dá)而導(dǎo)致N-cadherin和Vimentin的表達(dá)水平降低和E-cadherin表達(dá)水平升高，而減緩了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度。

綜上所述，APQ4在肺癌裸小鼠模型中表達(dá)增強(qiáng)，其可能參與了肺癌的病理生理過(guò)程，可在一定程度上促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與遷移。但本研究未探討APQ4在肺癌遷移中的具體作用機(jī)制，仍有待進(jìn)一步研究完善。

作者貢獻(xiàn)：周永春、張琦、陳婉玲進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫(xiě)論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；方育、李融林、張璟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；周永春進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：李潔晨)

ExpressionandImpactonTumorCellProliferationandMigrationofAQP4inNudeMicewithLungCancer

ZHOUYong-chun1，ZHANGQi2，CHENWan-ling3，F(xiàn)ANGYu4，LIRong-lin2，ZHANGJing2

1.YunnanProvincialKeyLaboratoryforLungCancer，theThirdAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650118，China2.DepartmentofThoracicSurgery，theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650031，China3.DepartmentofOncology，YunnanProvincialGeneralHospitalofChineseArmedPoliceForce，Kunming650221，China4.DepartmentofAnesthesiology，theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity，Kunming650031，China

ObjectiveTo investigate the expression and impact on tumor cell proliferation and migration of AQP4 in nude mice with lung cancer.MethodsThis experiment was carried out in December 2016，in Yunnan Provincial Key Laboratory for Lung Cancer，the Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University.A total of 60 SPF-level male nude mice were selected and divided into control group and observation group according to random number table，each of 30 mice.Nude mice of control group

subcutaneous injection of A549 lung cancer cells without infection(0.2 ml)around dorsal axillary tissue to prepare the lung cancer model，while nude mice of observation group received subcutaneous injection of A549 lung cancer cells with AQP4-shRNA infection(0.2 ml)around dorsal axillary tissue to prepare the lung cancer model.Tumor weight，microvessel density，expressions of AQP4，E-cadherin，N-cadherin and Vimentin were compared between the two groups.ResultsTumor weight and microvessel density of observation group were statistically significantly lower than those of control group(P<0.05).Expressions of AQP4，N-cadherin and Vimentin of observation group were statistically significantly lower than those of control group，while expression of E-cadherin of observation group was statistically significantly higher than that of control group(P<0.05).ConclusionExpression of APQ4 is higher in nude mice with lung cancer，it may plan a role in the pathophysiological process of lung cancer，can promote the tumor cell proliferation and migration to some extent.

Lung neoplasms；Mice，nude；Aquaporin 4

云南省教育廳科研基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2013Z110)；云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)(2013FB132)；云南省衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014NS001)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究面上項(xiàng)目(2016FB145)

R 734.2

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2017.08.016

2017-03-10；

2017-08-05)

1.650118云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院云南省肺癌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

2.650031云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸外科

3.650221云南省昆明市，中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)云南省總隊(duì)醫(yī)院腫瘤科

4.650031云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科

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