Cdyl、G9a、及HDAC1在腎陽虛大鼠睪丸組織中的表達*

蔡 濤,尤耀東,張 磊,李廣森,蔡 劍Δ

1.彭州市中醫(yī)醫(yī)院(彭州 611930); 2.成都中醫(yī)藥大學，(成都 610075);3.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 (成都 610072)

·論著·

Cdyl、G9a、及HDAC1在腎陽虛大鼠睪丸組織中的表達*

蔡 濤1,尤耀東2,張 磊3,李廣森3,蔡 劍2Δ

1.彭州市中醫(yī)醫(yī)院(彭州 611930); 2.成都中醫(yī)藥大學，(成都 610075);3.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 (成都 610072)

目的觀察Cdyl、G9a、HDAC1在腎陽虛大鼠睪丸組織中的表達，探討Cdyl及相關因子引起雄性大鼠腎陽虛的機制。方法20只健康雄性SD大鼠隨機分為空白組與模型組，模型組采用環(huán)磷酰胺50 mg/kg·d腹腔注射，空白組給予等量生理鹽水注射。大鼠造模后第6天，將大鼠取血處死，分離睪丸、附睪進行相關指標檢測。結(jié)果與空白組比較，模型組大鼠精子濃度、活力及活率明顯降低；模型組大鼠睪丸組織Cdyl、G9a表達明顯降低(P<0.01)，HDAC1表達明顯升高(P<0.01)。結(jié)論Cdyl、G9a表達降低，HDAC1表達升高與雄性大鼠腎陽虛相關。

Cdyl基因；G9a基因；HDAC1基因；腎陽虛；大鼠

“腎藏精”是祖國醫(yī)學藏像理論的重要內(nèi)容。中醫(yī)學認為腎藏精，是人體生長、發(fā)育、生殖之源；腎在中醫(yī)學中被視為“先天之本”，具有極為重要的地位?！爸魃场笔恰澳I藏精”的重要表現(xiàn)，兩性的生殖之精，尤其是男性的精液質(zhì)量通常是衡量“腎藏精”功能狀態(tài)的重要依據(jù)。腎陽虛是腎虛的最基本證型之一，通常也會出現(xiàn)精液質(zhì)量下降、生殖能力減退等反映“腎藏精”功能減退的臨床癥狀。在中醫(yī)內(nèi)科學教材中，由于腎陽虛、腎陰虛等腎虛證候，男性出現(xiàn)精液質(zhì)量下降或異常，生殖能力減退是腎系疾病的重要內(nèi)容。隨著基因蛋白技術在中醫(yī)學中運用的深入，現(xiàn)已認識到中醫(yī)證型與特定基因蛋白表達相關[1]。Cdyl與組蛋白去乙?；?(histone deacetylase1,HDAC1)、組蛋白甲基化酶G9a，又稱常染色質(zhì)組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶2(euchromatic histone-lysine N-methyltransferase2,EHMT2)[2]在睪丸中均有分布，Cdyl及相關因子異常表達與精液質(zhì)量異常有關?；凇澳I藏精，主生殖”的中醫(yī)理論，本研究采用環(huán)磷酰胺制作腎陽虛大鼠模型[3]，從模型大鼠睪丸組織特定基因蛋白表達差異角度，探討腎陽虛證型的分子生物學機制，為中醫(yī)藥治療腎陽虛證候的中醫(yī)腎系疾病提供現(xiàn)代醫(yī)學證據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1 實驗動物 在成都中醫(yī)藥大學實驗動物中心購買2月齡雄性SD大鼠(清潔級)20只，體質(zhì)量200±20 g，專業(yè)檢疫合格。購入的SD大鼠在成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院動物實驗中心飼養(yǎng)。

1.1.2 主要實驗藥物及試劑 環(huán)磷酰胺(Cyclopho sphamide， CP)：山西普德藥物股份有限公司，0.2 g/瓶，批號：04150605。一抗：兔多克隆抗體，批號：ab5188，英國abcam-艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；二抗：生物素化山羊抗兔IgG(H+L),批號：13152A11，北京中山金橋生物有限公司；三抗：辣根酶標記鏈霉素卵蛋白素(HRP/A-V)，批號：13152A11，北京中衫金橋生物有限公司。

1.1.3 主要儀器 WL-9000型偉力彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)(北京偉力公司)；數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)，型號BA400Digital；實時熒光定量(RT-PCR)儀(美國ThermoFisher儀器有限公司)，型號PIKORed 96。

1.2實驗方法

1.2.1 動物分組與造模 將20只SD大鼠按數(shù)字隨機法分為空白組10只，模型組10只，造模大鼠采用CP 50 mg/kg進行腹腔注射，每天1次，連續(xù)5 d，空白組予以等量生理鹽水腹腔注射。

1.2.2 取材 CP 腹腔注射造模5天后，各組大鼠均予以水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈抽血處死大鼠，迅速摘取附睪、睪丸，將右側(cè)睪丸分成兩半，均投入4%多聚甲醛中保存，另一側(cè)睪丸投入液氮中保存，分別用于睪丸組織HE染色，免疫組化及RT-PCR檢測。

1.2.3 精液質(zhì)量分析 取一側(cè)附睪尾部放入3 mL 37 ℃生理鹽水中，剪碎，放置1分鐘左右，經(jīng)處理后，取少量加到計數(shù)板上，采用WLJY-9000型精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)(Computer-aided sperm analysis,CASA)，進行精子質(zhì)量檢查。主要測試指標：精子密度、精子活力、精子活率。

1.2.4 大鼠睪丸組織形態(tài)學觀察 檢測標本為保存于4%多聚甲醛中的大鼠右側(cè)的1/2睪丸。睪丸組織固定后經(jīng)全自動脫水機脫水，包埋，切片，置于載玻片上，進行HE染色，再將切片經(jīng)二甲苯透明，加拿大樹膠封片后供鏡檢。用光學顯微鏡進行睪丸病理組織學檢查，主要觀察睪丸生精小管內(nèi)生精細胞的病變情況。

1.2.5 大鼠睪丸組織Cdyl、HDAC1、G9a免疫組化檢測 檢測標本為保存于4%多聚甲醛中的大鼠右側(cè)的另1/2睪丸。固定睪丸組織經(jīng)石蠟切片后置于防脫玻片上，進行常規(guī)脫蠟、熱修復抗原處理后，依次加入一抗、二抗、三抗及各種相關試劑，予以DBA顯色。顯色結(jié)果在圖像采集后，隨機抽取3個400倍采集圖像區(qū)域，Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定分析圖像平均光密度。

1.2.6 大鼠睪丸組織Cdyl、G9a、HDAC1的RT-PCR檢測 從美國國家生物技術信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中搜索Cdyl、G9a、HDAC1基因序列，使用引物設計軟件Primer5.0設計篩選特異性引物，引物及堿基序列見表1。將保存在液氮中大鼠睪丸組織在液氮中充分研磨，進行勻漿處理，從勻漿的大鼠組織提取RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用Sequence Detection soft wareversion 1.2.3軟件(Applied Biosy stems公司)分析PCR過程各檢測樣本的CT( Threshold cycle)值，通過2-△△CT計算X相對mRNA表達水平。

表1 本次檢測所用引物及堿基序列

1.3統(tǒng)計分析

2 實驗結(jié)果

2.1大鼠基本情況

造模的5 d過程中，空白組與模型組大鼠體質(zhì)量無明顯變化，無大鼠死亡。造模過程中，模型組大鼠開始出現(xiàn)精神萎靡、反應遲鈍、活動度減少、眼神無光、卷縮、畏寒等腎陽虛的癥狀和體征，與岳宗相[4]的實驗結(jié)果相似。

2.2大鼠精子質(zhì)量比較

模型對照組在腹腔CP液 (50 mg/kg·d) 注射5天后，附睪精子密度下降、精子活力下降、精子活率減低，與空白組比較有顯著差異(P<0.01)(表2)。說明模型大鼠睪丸內(nèi)存在生精障礙，本實驗造模成功。

表2 各組大鼠精液常規(guī)的比較

2.3大鼠睪丸組織結(jié)構變化

空白組生精小管飽滿，生精上皮外界膜均勻、完整；各級生精細胞排列規(guī)則，可見不同發(fā)育階段的生精細胞，精子形態(tài)和數(shù)量正常，睪丸間質(zhì)細胞排列均勻。模型組生精小管變形、塌陷，數(shù)量增多；生精小管內(nèi)生精細胞脫落及排列紊亂，各級生精細胞數(shù)量減少，生精上皮變薄，睪丸間質(zhì)細胞排列稀疏，間質(zhì)透明樣變性。模型組睪丸病理損傷程度明顯大于空白組，見圖1。

圖1 空白組與模型組大鼠睪丸組織HE染色注：A.空白組(×100)；B.模型組(×100)

2.4大鼠睪丸組織Cdyl、G9a、HDAC1免疫組化結(jié)果

在睪丸組織中，Cdyl、G9a、HDAC1免疫陽性產(chǎn)物為淺黃色或棕黃色，陽性表達在基部細胞質(zhì)、精子細胞、支持細胞等。Cdyl、G9a、HDAC1蛋白免疫組化顯微圖片見圖2。

每組免疫組化結(jié)果選取相同部位，進行平均光密度統(tǒng)計分析。與空白組相比，模型組大鼠睪丸組織Cdyl、G9a平均光密度明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；HDAC1平均光密度明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，統(tǒng)計分析結(jié)果見表3。

2.5大鼠睪丸組織Cdyl、G9a、HDAC1基因表達

本研究統(tǒng)計了藥物對大鼠睪丸組織中Cdyl、G9a、HDAC1的2-△△CT(基因表達值)的統(tǒng)計結(jié)果。與空白組相比，模型組大鼠睪丸組織Cdyl和G9a的mRNA表達均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；HDAC1的mRNA表達明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，統(tǒng)計分析結(jié)果見表4。

表3 大鼠睪丸組織Cdyl、G9a、HDAC1平均光密度的影響

組別CdylG9aHDAC1空白組1.00±0.07 0.99±0.05 1.00±0.12 模型組0.64±0.18**0.51±0.11**1.21±0.17**t6.0912.38-3.14P<0.001<0.001<0.001

圖2 大鼠睪丸組織Cdyl、G9a、HDAC1免疫組化

注：A.空白組Cdyl表達(×400)；B.模型組Cdyl表達(×400)；C.空白組G9a表達(×400)；D.模型組G9a表達(×400)；E.空白組HDAC1表達(×400)；F.模型組HDAC1表達(×400)

3 討論

“主生殖”是“腎藏精”的重要內(nèi)容，男性精子生成障礙，精液質(zhì)量下降，生殖能力減退也是“腎藏精”功能減退的重要表現(xiàn)。在中醫(yī)門診中，隨著現(xiàn)代生活方式改變，伴有精液質(zhì)量下降、生殖功能減退的腎陽虛證候也愈發(fā)常見。腎陽虛中醫(yī)證侯可能與蛋白基因的表達差異相關[5]，從基因蛋白靶點研究腎陽虛機制，為中醫(yī)藥治療腎陽虛證候的“腎藏精”功能減退提供現(xiàn)代醫(yī)學證據(jù)，是中醫(yī)學研究的熱點。在生精功能障礙的諸多相關因子中，Y染色體長臂上的無精子因子(azoospermia factor, AZF)是其中的重要一類，AZF區(qū)通常分為AZFa區(qū)、AZFb區(qū)、AZFc區(qū)，其中AZFc區(qū)的微缺失是生精功能障礙研究的熱點。CDY位于AZFc區(qū)，CDY基因表達異常會導致生精障礙[6]。G9a即常染色質(zhì)組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，具有甲基化活性，在精子發(fā)生過程中有重要作用[7]，G9a在動物睪丸中廣泛分布，動物實驗研究發(fā)現(xiàn)[8]，將小鼠的G9a基因敲除后，會導致小鼠生精功能障礙，出現(xiàn)不育現(xiàn)象。HDAC是一類水解蛋白酶，HDAC1是HDACs家族成員之一，具有去乙?；饔?，HDAC1在鼠類等動物睪丸中大量存在，研究[9-10]顯示HDACs表達異常與生精功能障礙相關。

組蛋白修飾機制在精子發(fā)生過程中的發(fā)揮著重要調(diào)控作用[11]，是雄性生殖機制研究的熱點。組蛋白修飾包括甲基化、去甲基化、乙酰化、去乙酰化等。研究顯示，人類CDY蛋白與鼠類Cdyl 蛋白的chromo結(jié)構域能夠選擇性結(jié)合組蛋白H3甲基化的ARK(S/T)基序[12-13]，CDY的“CoA口袋”結(jié)構域還能與HDACs結(jié)合，因此，CDY(L)蛋白可以將表觀遺傳學中組蛋白的甲基化修飾與乙?；揎椔?lián)系起來。已知人體存在CDY(L)、HDAC1、G9a蛋白復合體[14]，CDY(L)可以將一些重要的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶如G9a，去乙?；溉鏗DAC1招募到染色質(zhì)上，提示CDY(L)及相關G9a、HDAC1因子可通過表觀遺傳中組蛋白甲基化及乙?；揎棛C制調(diào)控精子發(fā)生。

在本實驗中，通過腹腔注射具有明確生殖毒性環(huán)磷酰胺藥物，模型組雄性大鼠出現(xiàn)腎陽虛證候，大鼠精液質(zhì)量下降，表現(xiàn)出“腎藏精”功能減退癥狀，大鼠睪丸組織內(nèi)Cdyl、G9a基因蛋白表達量明顯下降，HDAC1基因蛋白表達明顯升高。該結(jié)果提示大鼠睪丸中Cdyl、G9a基因蛋白表達下降，HDAC1基因蛋白表達升高與腎陽虛證型，及“腎藏精”功能減退相關，可能由于Cdyl及相關基因蛋白異常表達會導致精子發(fā)生表觀遺傳過程中甲基化、乙?；揎棛C制異常，但需更加深入的后續(xù)實驗研究予以明確。

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ExpressionofCdyl,G9aandHDAC1intheTestistissueofMaleRatswithKidney-yangDeficiency

CaiTao1,YouYaodong2,ZhangLei3,LiGuangsen3,CaiJian2Δ.

1.PengzhouHospitalofTraditionalChineseMedicine,Pengzhou611930,China;2.ChengduUniversityofT.C.M,Chengdu610075,China;3.TeachingHospitalofChengduUniversityofT.C.M,Chengdu610072,China

ObjectiveTo observe the expression of chromodomain Y-like (Cdyl), G9a (also known as euchromatic histone lysine N-methyltransferase2) and histone deacetylase1(HDAC1) in the testis tissue of the male rats with kidney-yang deficiency and explore the mechanism of male rats′ kidney-yang deficiency induced by Cdyl and the relevant factors.Methods20healthy male SD rats were randomly divided into the blank control group and model group. The model group was administered with intraperitoneal injection of50mg/kg·d Cyclophosphamide, while the blank control group was given the same amount of normal saline injection. On the6th day of modeling, the rats were sacrificed. The testis and epididymis were separated for inspection.ResultsCompared with the blank control group, the sperm density, progressive motility and vitality reduced in the model group; the expression of Cdyl and G9a in the testis tissue decreased significantly (P<0.01) in the model group, while the expression of HDAC1increased significantly (P<0.01).ConclusionThe expression decrease of Cdyl and G9a and the expression increase of HDAC1are correlated with the kidney-yang deficiency of male rats.

Cdyl; G9a; HDAC1; Kidney-yang deficiency; Rat

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170829.1026.006.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.04.017

四川省教育廳基金資助(No:14ZB0078)

：蔡劍，E-mail:1581942151@qq.com

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