晚期膝骨關(guān)節(jié)炎患者外周血中趨化因子表達譜的特征分析*

謝慶云，符培亮，陳 宜，王 波，李曉華，錢齊榮△

1 第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院 關(guān)節(jié)外科(上海 200003)；2 解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院 骨科(成都 610083)

·論著·

晚期膝骨關(guān)節(jié)炎患者外周血中趨化因子表達譜的特征分析*

謝慶云1, 2，符培亮1，陳 宜1，王 波1，李曉華1，錢齊榮1△

1 第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院 關(guān)節(jié)外科(上海 200003)；2 解放軍成都軍區(qū)總醫(yī)院 骨科(成都 610083)

目的探討行關(guān)節(jié)置換術(shù)的晚期膝骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)患者外周血中趨化因子譜的特征及變化，了解其慢性炎癥狀態(tài)。方法選取2016年1—7月在第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院住院的行關(guān)節(jié)置換術(shù)的晚期膝OA患者共20例，設(shè)為OA組，同期選取本院體檢中心健康體檢者共20例為正常對照組，通過流式液相多重蛋白定量技術(shù)，檢測兩組血漿中趨化因子表達譜水平。結(jié)果OA組和正常對照組血漿中，IL-8(CXCL8)、IP-10(CXCL10)、Eotaxin(CCL11)、MCP-1(CCL2)的濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；OA組血漿中，TARC(CCL17)和RANTES(CCL5)的濃度明顯低于正常對照組(P<0.05)。結(jié)論晚期膝OA患者外周血中趨化因子的產(chǎn)生趨于平穩(wěn)甚至逐漸降低，而炎癥反應(yīng)可能更多的局限于關(guān)節(jié)局部。

骨關(guān)節(jié)炎；趨化因子；炎癥；關(guān)節(jié)置換術(shù)；流式液相多重蛋白定量技術(shù)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種慢性的肌肉骨骼系統(tǒng)疾病，主要影響滑膜關(guān)節(jié)的結(jié)構(gòu)和功能，是全球主要致殘性疾病之一[1]。OA的主要特征為軟骨退變，關(guān)節(jié)軟骨的逐漸丟失，造成關(guān)節(jié)破壞。目前認(rèn)為，慢性炎癥在OA的關(guān)節(jié)軟骨破壞中發(fā)揮了重要作用[2]。趨化因子能夠趨化促炎細胞到達關(guān)節(jié)局部，維持或加重炎癥反應(yīng)，闡明趨化因子表達譜的特征性改變，尤其是參與炎癥和免疫紊亂的趨化因子，對于更深層次理解疾病的狀態(tài)非常重要。本研究將通過流式液相多重蛋白定量技術(shù)(cytometric bead assay，CBA)，分析晚期膝OA患者及正常對照組血漿中趨化因子譜的特征性變化，旨在探討趨化因子在OA疾病診斷和治療中的應(yīng)用價值，為進一步闡明OA發(fā)病機制，探尋疾病診斷和判斷療效的生物學(xué)標(biāo)記物提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1臨床資料

選取2016年1—7月在第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院住院的晚期膝OA患者，共20例，均符合1995年美國風(fēng)濕病學(xué)會OA的診斷標(biāo)準(zhǔn)，診斷為原發(fā)性膝OA，有關(guān)節(jié)置換手術(shù)指征，并行全膝關(guān)節(jié)置換。排除標(biāo)準(zhǔn)：除外合并其他可能影響炎癥指標(biāo)的疾病，如感染、腫瘤、創(chuàng)傷等；同時，除外合并有其他風(fēng)濕性疾病。記錄患者相關(guān)臨床資料，包括：病程、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、視覺模擬評分法(visual analogue scale/score，VAS)、膝關(guān)節(jié)Kellgren-Lawrence(K-L)分級等。正常對照組為同期本院體檢中心健康體檢者，共20例。由于OA的發(fā)病率隨著年齡的增加明顯增高，故正常對照組年齡選取在24～45歲，并行膝關(guān)節(jié)平片以除外膝OA。兩組性別、BMI構(gòu)成上，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。使用EDTA管采集外周靜脈血2 mL，離心后吸取上清，保存于-80 ℃待用。所有研究對象均行知情告知，并簽署知情同意書(表1)。

表1 兩組基本特征比較(n=20)

1.2方法

使用LEGENDplexTMHuman Proinflammatory Chemokine Panel試劑盒(美國Biolegend公司)，通過流式細胞儀，檢測OA組及對照組血漿中多種趨化因子濃度。檢測的趨化因子包括：IL-8(CXCL8)、IP-10(CXCL10)、Eotaxin(CCL11)、TARC(CCL17)、MCP-1(CCL2)和RANTES(CCL5)。具體操作步驟如下：1)制備標(biāo)準(zhǔn)品：按照1∶4稀釋倍數(shù)，分別制備標(biāo)準(zhǔn)品C7～C1, Assay buffer作為標(biāo)準(zhǔn)品C0 (0 pg/mL)。2)樣本稀釋：血漿樣本使用Assay buffer稀釋兩倍，血漿樣本不稀釋會導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。3)用前所有試劑室溫平衡，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)設(shè)置復(fù)孔。4)在96孔U底板中加入反應(yīng)體系：標(biāo)準(zhǔn)曲線孔中，加入25 μL Matrix B；樣本孔中加入25 μL Assay buffer；標(biāo)準(zhǔn)曲線孔中加入25 μL對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品；樣本孔中加入25 μL稀釋后的血漿樣本；所有孔中均加入25 μL混合微球和25 μL檢測抗體。注意加入微球的過程中，需間斷地?fù)u晃微球，以避免微球沉降到瓶底。5)用鋁箔將96孔板覆蓋以避光，96孔板放置于搖板器上室溫?fù)u板，600 r，2 h。6)每孔中加入25 μLSA-PE。7)用鋁箔將96孔板覆蓋以避光，將96孔板放置于搖板器上室溫?fù)u板，600 r ，30 min。8)將96孔板離心，1 000 g，2 229 r/min，離心半徑15.4 cm，5 min。9)用排槍盡可能吸去上清，注意不要吸走微球。10)每孔中加入200 μLWash buffer，搖板1 min以重懸微球。96孔板離心，1 000 g，2 229 r/min，離心半徑15.4 cm，5 min，移去上清。11)每孔中加入200 μLWash buffer，用移液槍吹打重懸微球。流式細胞儀BD FACSCaliburTM(dual laser)上機，F(xiàn)L 2(575 nm)和FL 4(660 nm)通道采集熒光信號。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1流式細胞儀讀取微球信息

BD FACSCaliburTM流式細胞儀FL 2(575 nm)和FL 4(660 nm)通道分別檢測PE、APC熒光染料強度。根據(jù)微球大小和自身攜帶的APC熒光強度，可將微球分為6種類型，用以標(biāo)記單個樣本中的6種趨化因子。而每種特定類型微球的PE熒光強度則代表了相對應(yīng)趨化因子的濃度(圖1)。

圖1 流式細胞儀檢測血漿中趨化因子的濃度

注：A. 根據(jù)APC熒光強度可將微球分為6群，分別對應(yīng)6種不同的趨化因子；B. 特定微球所結(jié)合的PE熒光強度代表了所對應(yīng)趨化因子的濃度

2.2趨化因子標(biāo)準(zhǔn)曲線的多參數(shù)擬合

輸入標(biāo)準(zhǔn)品的流式檢測數(shù)據(jù)，使用LEGENDplexTMData Analysis Software進行標(biāo)準(zhǔn)曲線的多參數(shù)擬合。由此可見，所檢測的6個趨化因子標(biāo)準(zhǔn)曲線變異范圍為0.16%～2.80%，相關(guān)性R2=0.998～1.000。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合良好，可用于檢測樣本趨化因子濃度的計算(圖2)。

圖2 多參數(shù)擬合趨化因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線

注：A. IL-8(CXCL8)標(biāo)準(zhǔn)曲線；B. IP-10(CXCL10)標(biāo)準(zhǔn)曲線；C. Eotaxin(CCL11)標(biāo)準(zhǔn)曲線；D. TARC(CCL17)標(biāo)準(zhǔn)曲線；E. MCP-1(CCL2)標(biāo)準(zhǔn)曲線； F. RANTES(CCL5)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3兩組血漿中趨化因子的濃度

通過流式細胞儀檢測APC和PE染料的熒光強度，對微球進行分群，并按照擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出每個樣品中多重趨化因子的濃度。可以看出，OA組和正常對照組血漿中，IL-8(CXCL8)、IP-10(CXCL10)、Eotaxin(CCL11)、MCP-1(CCL2)的濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；OA組血漿中TARC(CCL17)和RANTES(CCL5)的濃度明顯低于正常對照組(P<0.05)(圖3)。

圖3 OA組和正常對照組血漿中趨化因子的濃度

注：A. 兩組血漿中IL-8(CXCL8)含量的比較；B. 兩組血漿中IP-10(CXCL10)含量的比較；C. 兩組血漿中Eotaxin(CCL11)含量的比較；D. 兩組血漿中TARC(CCL17)含量的比較；E. 兩組血漿中MCP-1(CCL2)含量的比較； F. 兩組血漿中RANTES(CCL5)含量的比較；*表示兩樣本t檢驗；#表示采用Welch′st檢驗

3 討論

OA是一種常見的以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹饕淖兊募膊。?0歲以上人群的發(fā)病率約為40%[3]。目前，尚無有效方法可以延緩或逆轉(zhuǎn)病程，對晚期OA唯一有效的治療方法為關(guān)節(jié)置換手術(shù)[4]。OA的發(fā)病機制尚不清楚，認(rèn)為與應(yīng)力刺激、年齡、遺傳、炎癥、肥胖、損傷及環(huán)境因素等相關(guān)[5]。因此，進一步闡明 OA 的發(fā)病機制，并探尋更加有效的治療方法顯得尤為重要。近年來，炎癥在OA發(fā)病和疾病進程中的作用日益受到關(guān)注。有研究[6]認(rèn)為，炎癥因子網(wǎng)絡(luò)失衡在OA的發(fā)病中具有重要作用，慢性非感染性炎癥是OA全身及局部內(nèi)環(huán)境的主要特征。

趨化因子是一類能使細胞發(fā)生趨化運動的小分子細胞因子，根據(jù)其N-端半胱氨酸的數(shù)量和位置，可分為CC、CXC、C和CX3C趨化因子[7]。趨化因子在免疫監(jiān)視、器官發(fā)育、血管生成和免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[8]。趨化因子的表達譜，尤其是參與炎癥和免疫紊亂的趨化因子，對于更深層次的理解疾病的狀態(tài)是非常重要的，而此前研究[9]多數(shù)是關(guān)注炎癥細胞因子在OA發(fā)病機制中的作用，發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α等炎癥細胞因子在早期OA患者的外周血及關(guān)節(jié)局部明顯升高，誘導(dǎo)了關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)的破壞以及破骨細胞的分化。相比而言，關(guān)于趨化因子在OA發(fā)病及病程中的研究相對較少。

有學(xué)者[10]比較了關(guān)節(jié)置換的膝OA患者和膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷患者血清和關(guān)節(jié)液中的趨化因子水平，發(fā)現(xiàn)兩組血清中CXCL8、CCL5的濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而晚期膝OA患者關(guān)節(jié)液中CCL5水平高于膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷組。Hampel等[11]檢測了OA患者和RA患者關(guān)節(jié)液中趨化因子，發(fā)現(xiàn)OA患者關(guān)節(jié)液中Eotaxin、hGROα、IL-8、IL-10、MCP-1、MCP-2、MIG、RANTES和TARC水平均明顯低于RA患者。另1項研究[12]入組了161例行玻璃酸鈉關(guān)節(jié)腔注射的OA患者(K-L分級：2～4級)，通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，OA患者血清中MCP-1(CCL2)濃度高于正常對照組，但與K-L分級、疼痛評分均缺乏相關(guān)性。早期膝OA患者血漿中CXCL2濃度較正常對照組明顯升高，且與膝關(guān)節(jié)K-L分級具有相關(guān)性[13]。目前，尚缺乏晚期膝OA患者循環(huán)中趨化因子表達譜特征變化的研究報道。

本研究中，采用CBA分析了晚期膝OA患者及正常對照組血漿中趨化因子譜的變化特征。CBA是近年來發(fā)展起來的一種多重蛋白定量檢測技術(shù)，與傳統(tǒng)的ELISA方法相比較，具有更高的檢測敏感性和更廣泛的檢測范圍，能夠同時對多個趨化因子進行定量測定[14]。結(jié)果顯示，晚期膝OA組和正常對照組血漿中，IL-8(CXCL8)、IP-10(CXCL10)、Eotaxin(CCL11)和MCP-1(CCL2)的濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而晚期膝OA患者血漿中TARC(CCL17)和RANTES(CCL5)濃度較正常對照組明顯降低(P<0.05)。本研究部分結(jié)果與已有的文獻報道不完全一致，分析結(jié)果不一致的原因可能包括：其他研究大多納入的是早期OA病例，而本研究中均為行關(guān)節(jié)置換術(shù)的晚期膝OA患者，K-L分級3～4級，不同研究之間OA病例組的入選標(biāo)準(zhǔn)不同造成了結(jié)果差異；不同檢測方法對于異質(zhì)性抗體檢出的效率不同。TARC(CCL17)和RANTES(CCL5)作為CC趨化因子家族成員，主要生物學(xué)功能是將單核細胞和T細胞吸引、趨化至炎癥部位[15]。由此推測：早期OA患者全身慢性炎癥狀態(tài)更加明顯，晚期膝OA患者循環(huán)中趨化因子的產(chǎn)生趨于平穩(wěn)甚至逐漸降低，而炎癥反應(yīng)可能更多局限于關(guān)節(jié)局部。

本研究的局限性包括：首先，樣本含量較小，還需要進一步通過更大樣本量的研究加以證實；其次，由于正常對照組關(guān)節(jié)液很難獲取，本研究沒有比較晚期膝OA患者和正常對照組關(guān)節(jié)液中的趨化因子，無法證實關(guān)節(jié)局部趨化因子譜的特征性改變?？傊€需要進行更加深入的研究，進一步闡明趨化因子在OA疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用及機制，從整體上研究細胞因子之間的相互作用，探尋疾病的血清生物學(xué)標(biāo)記物，同時，開發(fā)簡單、準(zhǔn)確的多指標(biāo)聯(lián)合檢測方法，為疾病的診斷、治療和預(yù)后評估提供更為可靠的依據(jù)。

[1]Hoy D G, Smith E, Cross M,etal.Reflecting on the global burden of musculoskeletal conditions: lessons learnt from the global burden of disease 2010 study and the next steps forward[J]. Ann Rheum Dis, 2015, 74(1): 4-7.

[2]de Lange-Brokaar B J, Ioan-Facsinay A, van Osch G J,etal. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review[J]. Osteoarthr Cartil, 2012, 20(12): 1484-1499.

[3]Dieppe P A, Lohmander L S. Pathogenesis and management of pain in osteoarthritis[J]. Lancet, 2005, 365(9463):965-973.

[4]Bomer N, den Hollander W, Ramos Y F,etal. Underlying molecular mechanisms of DIO2 susceptibility in symptomatic osteoarthritis[J]. Ann Rheum Dis, 2015, 74(8): 1571-1579.

[5]Ramos Y F, Bos S D, Lakenberg N,etal. Genes expressed in blood link osteoarthritis with apoptotic pathways[J]. Ann Rheum Dis,2014, 73(10):1844-1853.

[6]Mendel O I, Luchihina L V, Mendel W. Aging and osteoarthritis.chronic nonspecific inflammation as a link between aging and osteoarthritis(Review)[J].Adv Gerontol, 2015, 28(2):274-283.

[7]Zlotnik A, Yoshie O. The chemokine superfamily revisited[J]. Immunity, 2012, 36(5):705-716.

[8]Stein J V, Nombela-Arrieta C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview[J]. Immunology, 2005, 116(1):1-12.

[9]Benito M J, Veale D J, FitzGerald O,etal. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis[J]. Ann Rheum Dis, 2005, 64(9):1263-1267.

[10] Pierzchala A W, Kusz D J, Hajduk G. CXCL8 and CCL5 expression in synovial fluid and blood serum in patients with osteoarthritis of the knee[J]. Arch Immunol Ther Exp(Warsz), 2011, 59(2):151-155.

[11] Hampel U, Sesselmann S, Iserovich P,etal. Chemokine and cytokine levels in osteoarthritis and rheumatoid arthritis synovial fluid[J]. J Immunol Methods, 2013, 396(1/2):134-139.

[12] Li L, Jiang B E. Serum and synovial fluid chemokine ligand 2/monocyte chemoattractant protein 1 concentrations correlates with symptomatic severity in patients with knee osteoarthritis[J]. Ann Clin Biochem,2015, 52(Pt 2):276-282.

[13] He W, Wang M, Wang Y,etal. Plasma and Synovial Fluid CXCL12 Levels Are Correlated With Disease Severity in Patients With Knee Osteoarthritis[J]. J Arthroplasty, 2016, 31(2): 373-377.

[14] Tsuchida A I, Beekhuizen M, 't Hart M C,etal. Cytokine profiles in the joint depend on pathology, but are different between synovial fluid, cartilage tissue and cultured chondrocytes[J]. Arthritis Res Ther, 2014, 16(5): 441.

[15] Deshmane S L, Kremlev S, Amini S,etal. Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1): an overview[J]. J Interferon Cytokine Res, 2009, 29(6):313-326.

TheCharacteristicAnalysisoftheExpressionProfileofChemokinesinthePeripheralBloodofPatientswithAdvancedKneeOsteoarthritis

XieQingyun1,2,FuPeiliang1,ChenYi1,WangBo1,LiXiaohua1,QianQirong1△.

1.DepartmentofJointSurgery,ChangzhengHospitalofTheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200003,China;2.DepartmentofOrthopaedics,GeneralHospitalofChengduMilitaryRegion,Chengdu610083,China

ObjectiveTo investigate the characteristics of chemokines in the peripheral blood of patients with advanced knee osteoarthritis (OA) treated with arthroplasty and understand the state of patients′ chronic inflammation.MethodsThe twenty patients with advanced knee OA treated with arthroplasty in Changzheng Hospital of The Second Military Medical University from January to July of2016were selected into the OA group, while the other twenty healthy controls were selected from those undergoing the medical examination in Medical Examination Centre of the hospital over the corresponding period. The cytometric bead array method was used to measure the expression profile of chemokines in the plasma of the two groups.ResultsThere were no significant differences between the OA group and the control group in the levels of IL-8(CXCL8), IP-10(CXCL10), Eotaxin (CCL11) and MCP-1(CCL2) (P>0.05). The concentrations of TARC (CCL17) and RANTES (CCL5) were significantly lower in the plasma of the OA group than in that of the control group (P<0.05).ConclusionThe production of chemokines in the patients with advanced knee OA tend to be stable and even decreased and the inflammatory reaction may be more limited to the joint.

Osteoarthritis; Chemokine; Inflammation; Arthroplasty; Cytometric bead array

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170511.1641.002.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.04.013

四川省科技廳重點研發(fā)項目(No:2017SZ0128);四川省衛(wèi)生廳基金項目(No:130320;No:130322)

：錢齊榮，E-mail:qianqr@163.com

R684.3

A

△