BD926對骨髓源性未成熟樹突狀細(xì)胞增殖及吞噬作用的影響*

蘇志偉，楊 苗，楊 凱，徐 燦，彭 旭，段佳毅，冷 瀟,，王衍堂,△

1. 成都醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)系(成都 610500)；2. 成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫教研室(成都 610500)

·論著·

BD926對骨髓源性未成熟樹突狀細(xì)胞增殖及吞噬作用的影響*

蘇志偉1，楊 苗2，楊 凱1，徐 燦1，彭 旭1，段佳毅1，冷 瀟1,2，王衍堂1,2△

1. 成都醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)系(成都 610500)；2. 成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫教研室(成都 610500)

目的研究苯并噻唑類衍生物BD926對小鼠骨髓源性未成熟樹突狀細(xì)胞(immature dendritic cells, imDCs)增殖及吞噬作用的影響。方法分離小鼠骨髓源性單核細(xì)胞誘導(dǎo)imDCs，借助PE/Annexin V凋亡檢測試劑盒、CFSE細(xì)胞增殖試劑盒以及FITC-葡聚糖，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測BD926對imDCs在粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)刺激下的細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖以及吞噬作用的影響。結(jié)果與PBS組相比，25 、5 、1 μM 的BD926處理imDCs后，其細(xì)胞增殖水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高、中、低3個劑量組BD926處理后，imDCs與PBS組相比，細(xì)胞存活差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)；高、中、低3個劑量組BD926處理后，imDCs與PBS組相比，吞噬作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)。結(jié)論BD926在體外可明顯抑制GM-CSF刺激的imDCs增殖作用，對imDCs的細(xì)胞存活和吞噬作用則無明顯影響。

苯并噻唑類衍生物；未成熟樹突狀細(xì)胞；細(xì)胞增殖；吞噬作用；凋亡

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs) 起源于骨髓多功能造血干細(xì)胞(multiple hematopoietic stem cell, MHSCs)，是機(jī)體內(nèi)最強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells, APC)，能高效激活幼稚T細(xì)胞，在誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答以及T細(xì)胞相關(guān)的免疫耐受過程中存在極為重要的作用[1]。DCs作為連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁，近期研究[2]提示，其在自身免疫性疾病發(fā)病中的作用愈發(fā)重要。DCs攝取自身抗原，經(jīng)加工后呈遞并激活外周幼稚T細(xì)胞，其分泌的細(xì)胞因子如IL-6、IL-12、IL-23和TGF-β等亦是誘導(dǎo)Th1和Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵要素[3-4]。DCs的細(xì)胞表面分子表型、成熟度和細(xì)胞因子功能的異質(zhì)性是免疫反應(yīng)和免疫耐受實(shí)現(xiàn)動態(tài)平衡的重要因素。成熟DCs(mature dendritic cells, mDCs)表達(dá)高豐度的共刺激分子，分泌大量T細(xì)胞活化相關(guān)的細(xì)胞因子(如IL-6、IL-12、IL-18、IL-23等)，選擇性激活并誘導(dǎo)各亞型T細(xì)胞分化，進(jìn)而產(chǎn)生免疫反應(yīng)。未成熟樹突狀細(xì)胞(immature dendritic cells, imDCs)表達(dá)低水平的MHC分子以及CD40、CD80和CD86等共刺激分子，但具有較強(qiáng)的吞噬、遷移能力以及增殖特性[5]。

苯并噻唑類衍生物是一類芳香族雜環(huán)化合物，既往研究主要集中于腫瘤[6-7]與細(xì)菌感染[8]，但其免疫抑制活性相關(guān)的研究尚未見報道。本研究合成篩選出一組苯并噻唑衍生物，可明顯抑制小鼠和人的T細(xì)胞增殖。其中，以BD750活性最高，該化合物通過抑制IL-2誘導(dǎo)的STAT5磷酸化在2μM濃度下，即可有效抑制T細(xì)胞增殖[9]。盡管BD750在體外具有較好的免疫抑制活性，但其體內(nèi)免疫抑制作用一般，其原因可能是BD750難溶于水，吸收緩慢，達(dá)不到有效的血藥濃度。通過對BD750進(jìn)行化學(xué)修飾等結(jié)構(gòu)改造，合成其新的水溶性衍生物BD926，發(fā)現(xiàn)BD926亦能明顯抑制T細(xì)胞增殖，且相關(guān)分子機(jī)制與BD750相似，亦是作用于STAT5磷酸化信號通路[10]。而過去研究[11-12]已證實(shí)，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)通過誘導(dǎo)STAT5活化，在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及DCs等髓系免疫細(xì)胞的增殖、活化和成熟方面存在關(guān)鍵作用。因此，本研究擬觀察BD926處理的小鼠骨髓源性的imDCs，在GM-CSF刺激后，其存活、增殖和吞噬相關(guān)的細(xì)胞功能是否發(fā)生改變。探討B(tài)D926是否因其對STAT5磷酸化的抑制作用，干擾小鼠骨髓來源imDCs在GM-CSF刺激后的細(xì)胞活動，從而為水溶性苯并噻唑類衍生物BD926在后續(xù)動物體內(nèi)干預(yù)自身免疫性疾病發(fā)病提供更為豐富的體外實(shí)驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗材料

1.1.1 實(shí)驗動物 6～8周齡雄性SPF級C57BL/6小鼠(北京維通利華)，飼養(yǎng)于成都醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗中心SPF動物房。實(shí)驗動物使用許可證號：SYXK(川)2015-196，室溫20 ～ 26 ℃，相對濕度40%～70%，光暗周期(12 h/12 h)。

1.1.2 主要實(shí)驗試劑 rmGM-CSF購買于美國Peprotech公司；LPS購買于美國Sigma公司；FITC-Dextran(40 000 MW)購買于美國Sigma公司；PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I購買于美國BD Pharmingen公司；CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit購買于美國Invitrogen公司。

1.2實(shí)驗方法

1.2.1 小鼠骨髓源性imDCs純化分離及受試藥物

取雄性C57BL/6小鼠(6～8周齡)，行頸椎脫臼，處死后，放入75%酒精，浸泡消毒3 min。無菌條件下，分離股骨，放入冰浴中的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中。70% 酒精浸泡消毒2 min， 預(yù)冷的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌2次。剪掉股骨末端骨骺，借助1 mL注射器，吸取PBS緩沖液對骨髓腔反復(fù)沖洗，收集沖洗后的細(xì)胞懸液，40 μm孔徑細(xì)胞篩網(wǎng)(美國BD Falcon)過濾。離心(300 g/min, 5 min)，棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，PBS洗滌，離心(300 g/min, 5 min)，收集細(xì)胞。細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度(1×106個/mL)，并重懸于RPMI-1640培養(yǎng)基(10%胎牛血清)中，接種至100 mm平皿，加入rmGM-CSF 20 ng/mL，5%CO2孵箱，37 ℃培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h換液，吸棄含未貼壁細(xì)胞及細(xì)胞碎片的培養(yǎng)液。加入新的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，吹打收集輕微黏附貼壁細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度(1×106個/mL)，重新接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)條件同前。

本實(shí)驗的受試藥物苯并噻唑類衍生物BD926 [sodium 2-(benzo[d]thiazol-2-yl)-4,5,6,7-tetrahydro-2H-indazol-3-olate, C14H12N3NaOS, MW: 293.3]，是在之前已報道的小分子化合物BD750 [2-(2-benzothiazoleyl)-4,5,6,7-tetrahydro-2H-indazol-3-ol, C14H13N3OS, MW: 271.3]的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)行化學(xué)修飾優(yōu)化后得到的水溶性衍生物(圖1)[9]。

1.2.2 劑量設(shè)計 本研究設(shè)5個實(shí)驗組，每組設(shè)2復(fù)孔，劑量設(shè)計如下所示(表1)。

圖1 水溶性苯并噻唑類衍生物BD926的合成

GM-CSFBD926CP690550PBS陰性對照組20ng/mL--BD926低劑量組20ng/mL1μM-BD926中劑量組20ng/mL5μM-BD926高劑量組20ng/mL25μM-CP690550陽性對照組20ng/mL-1μM

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測BD926對imDCs細(xì)胞存活的影響 在細(xì)胞培養(yǎng)第2天，重新接種于24孔培養(yǎng)板的imDCs(細(xì)胞密度1×106個/mL)，在加入20 ng/mL的GM-CSF以及實(shí)驗設(shè)計的各劑量組藥物后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，按PE/Annexin V凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行染色，應(yīng)用BD公司Accuri C6分析型流式細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測BD926對imDCs細(xì)胞增殖的影響 在細(xì)胞培養(yǎng)第2天，自100 mm平皿收集的輕微黏附貼壁細(xì)胞。細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度(1×106個/mL)。加入CFSE溶液(2 M)，孵育10 min(37 ℃)，每2 min吹打混勻；加入含5% 胎牛血清的PBS緩沖液(預(yù)冷)中止染色，離心(300 g/min, 5 min)，收集細(xì)胞，PBS緩沖液重復(fù)洗滌兩次。調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106個/mL，接種于24孔培養(yǎng)板的imDCs，加入20 ng/mL的GM-CSF以及實(shí)驗設(shè)計的各劑量組藥物后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，PBS洗滌后上機(jī)檢測。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測BD926對imDCs細(xì)胞吞噬作用的影響 在細(xì)胞培養(yǎng)第2天，接種于24孔培養(yǎng)板的imDCs(細(xì)胞密度1×106個/mL)，在加入20 ng/mL的GM-CSF以及實(shí)驗設(shè)計的各劑量組藥物后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個/mL，重新接種于24孔培養(yǎng)板。加入FITC-Dextran終濃度為1 mg/mL，37 ℃，孵育60 min，預(yù)冷PBS洗滌2次后，上機(jī)檢測imDCs對抗原的攝取能力。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1BD926對imDCs細(xì)胞存活的影響

BD926高、中、低3個劑量組干預(yù)后的imDCs在培養(yǎng)48 h后，其細(xì)胞存活率與PBS陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；細(xì)胞凋亡率(Annexin V陽性細(xì)胞比率)與PBS陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

2.2BD926對imDCs細(xì)胞增殖的影響

BD926高、中、低3個劑量組干預(yù)后的imDCs在培養(yǎng)48 h后，其細(xì)胞增殖與PBS陰性對照組相比，增殖指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且BD926對GM-CSF誘導(dǎo)的imDCs細(xì)胞增殖的抑制作用存在一定劑量依賴關(guān)系。此外，1 μM CP690 550對imDCs的細(xì)胞增殖亦有抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

2.3BD926對imDCs吞噬作用的影響

BD926高、中、低3個劑量組干預(yù)后的imDCs，對Dextran的攝取能力與PBS陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；此外，1 μM CP690 550干預(yù)后的imDCs對Dextran的攝取能力與PBS陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

圖2 BD926對骨髓源性imDCs細(xì)胞活性的影響注：A. PI/Annexin V雙染后，流式細(xì)胞術(shù)檢測imDCs凋亡率；B. 定量分析存活細(xì)胞及Annexin V陽性細(xì)胞比率

圖3 BD926對骨髓源性imDCs細(xì)胞增殖及吞噬作用的影響

注：A. CFSE標(biāo)記后，流式細(xì)胞術(shù)檢測imDCs增殖率；B. 流式細(xì)胞術(shù)檢測imDCs對Dextran的吞噬作用；C. 定量分析細(xì)胞增殖指數(shù)及Dextran陽性細(xì)胞比率；與PBS陰性對照組比較，**P<0.05

3 討論

具有免疫抑制活性的小分子化合物在移植免疫和自身免疫等領(lǐng)域的臨床用藥中顯現(xiàn)其日益重要的地位。2012年，美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)輝瑞公司開發(fā)的Jak抑制劑CP690 550用于治療甲氨喋呤療效不佳或不耐受的中至重度活動性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)成人患者。本研究小組篩選出新型苯并噻唑類衍生物BD750，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與當(dāng)前進(jìn)入臨床階段的小分子免疫抑制劑如CP690 550、雷帕霉素、環(huán)孢霉素A及FK506等存在明顯差異，表明BD750是一種全新的免疫抑制劑[13]。在體外實(shí)驗研究中，進(jìn)一步明確BD750通過阻斷STAT5信號通路完全抑制T細(xì)胞增殖[9]。而其經(jīng)過化學(xué)修飾結(jié)構(gòu)改造后得到的水溶性衍生物BD926，也表現(xiàn)相似的體外活性以及分子機(jī)制[10]。因此，BD926具有成為新型STAT5信號通路抑制劑的潛力，其作為先導(dǎo)化合物，通過將來持續(xù)的優(yōu)化改造，有望成為應(yīng)用于對抗移植排異以及自身免疫性疾病的免疫抑制藥物。在后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗中，將著重研究苯并噻唑類衍生物BD926對不同的自身免疫疾病動物模型的發(fā)病及疾病活動的干預(yù)作用。由于STAT5信號通路廣泛存在于機(jī)體不同的細(xì)胞類型，具有重要的生理學(xué)意義[6]。因此，BD926進(jìn)入機(jī)體后，對T細(xì)胞以外的其他細(xì)胞，尤其是其他免疫細(xì)胞的細(xì)胞功能的影響也非常值得關(guān)注。

在本研究中，探討了苯并噻唑類衍生物BD926對骨髓源性imDCs增殖及吞噬作用的影響，結(jié)果顯示，1 μM BD926在體外即可明顯抑制骨髓源性imDCs在GM-CSF刺激后的細(xì)胞增殖作用，而在25 μM的藥物作用濃度下能基本實(shí)現(xiàn)對imDCs增殖的完全抑制。但高、中、低3個劑量組的BD926對imDCs的存活和吞噬作用則無明顯影響。imDCs因其增殖能力、吞噬功能、趨化作用、細(xì)胞形態(tài)以及活化分子和共刺激因子等細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)方面與mDCs均存在明顯差異。但imDCs在吞噬攝取外來或自身抗原并加工呈遞活化幼稚T細(xì)胞，以及在受到抗原刺激后分化成熟并分泌大量的炎性細(xì)胞因子在T細(xì)胞相關(guān)反應(yīng)中，存在不可或缺的作用，是連接固有免疫與獲得性免疫之間的重要橋梁[14]。近期研究[15]發(fā)現(xiàn)，imDCs因其與mDCs在成熟度和功能上的差異，在誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受等方面亦存在不可或缺的作用 。因此，BD926對imDCs細(xì)胞擴(kuò)增、存活和吞噬方面的影響，在藥物調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)過程中亦不容忽視。本研究為水溶性苯并噻唑類衍生物BD926在后續(xù)動物體內(nèi)干預(yù)自身免疫性疾病發(fā)病提供更為堅實(shí)和豐富的體外實(shí)驗數(shù)據(jù)。

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TheEffectofBD926ontheProliferationandPhagocytosisofMurineBoneMarrow-DerivedImmatureDendriticCells

SuZhiwei1,YangMiao2,YangKai1,XuCan1,PengXu1,DuanJiayi1,LengXiao1, 2,WangYantang1, 2△.

1.SchoolofBiomedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China;2.DepartmentofImmunology,SchoolofBasicMedicalSciencesofChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China

ObjectiveTo study the effect of the Benzothiazole derivative BD926on the proliferation and phagocytosis of murine bone marrow-derived immature dendritic cells (imDCs).MethodsImDCs were isolated and induced from murine bone marrow-derived mononuclear cells. The flow cytometry (FCM) was used to detect the effect of BD926on the cell survival, proliferation and phagocytosis of imDCs upon the stimulation of GM-CSF with the help of PE/Annexin V Apoptosis Detection Kit, CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit and FITC-dextran.ResultsCompared with the PBS group, the cell proliferation of imDCs treated by BD926of25μM,5μM and1μM respectively were significantly reduced in a concentration-dependent manner (P<0.05), while the survival and phagocytosis of imDCs treated by BD926of the high, medium and low dosage respectively were not statistically different from those of imDCs in the PBS group (P>0.05).ConclusionThe Benzothiazole derivative BD926can suppress the proliferation of imDCs stimulated by GM-CSF in vitro, and it has no obvious effect on the survival and phagocytosis of imDCs.

Benzothiazole derivative; Immature dendritic cells; cell proliferation; Phagocytosis; Apoptosis

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20170901.1059.014.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.04.011

國家自然科學(xué)基金資助項目(No: 81202363)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(No:201513705005)；發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗室研究基金(No:SYS16-002)

：王衍堂，E-mail: yt-wang@hotmail.com

R392.5

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