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    運動對大鼠骨骼肌細胞凋亡及鈣離子含量的影響

    2017-09-15 05:32:42王海生王志勇蔣歡歡
    動物醫(yī)學進展 2017年9期
    關(guān)鍵詞:前肌骨骼肌脛骨

    王海生,王志勇,蔣歡歡

    (1.河北北方學院公共體育部,河北張家口 075000;2.河北北方學院附屬第二醫(yī)院藥劑科,河北張家口 075000)

    運動對大鼠骨骼肌細胞凋亡及鈣離子含量的影響

    王海生1,王志勇1,蔣歡歡2

    (1.河北北方學院公共體育部,河北張家口 075000;2.河北北方學院附屬第二醫(yī)院藥劑科,河北張家口 075000)

    探討運動對大鼠骨骼肌細胞凋亡及鈣離子含量的影響。將大鼠分為對照組、一般運動組和強運動組,對照組大鼠正?;顒?,一般運動組大鼠跑臺速度為18 m/min,強運動組大鼠跑臺速度為25 m/min,一般運動組和強運動組大鼠均運動至力竭。分別檢測大鼠比目魚肌和脛骨前肌細胞凋亡情況,大鼠血清和大鼠后肢組織勻漿上清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和鈣離子水平,大鼠肌肉組織中Bax、Bcl-2表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),一般運動組大鼠比目魚肌中細胞凋亡率和SOD活性均明顯高于對照組,差異極顯著(P<0.01)。強運動組大鼠比目魚肌中的SOD活性明顯低于一般運動組,差異極顯著(P<0.01)。試驗組大鼠血清中MDA水平均明顯低于對照組,差異極顯著(P<0.01)。一般運動組大鼠脛骨前肌和比目魚肌中MDA水平均明顯高于對照組和強運動組,差異極顯著(P<0.01)。一般運動組大鼠比目魚肌中鈣離子水平和Bax表達水平明顯高于對照組,差異顯著(P<0.05)。一般運動組大鼠比目魚肌中Bcl-2表達水平明顯低于對照組,差異極顯著(P<0.01)。表明一般運動比高強度運動更易導致比目魚肌細胞凋亡,作用機制可能與鈣離子濃度、氧自由基水平、Bax、Bcl-2有關(guān)。

    運動;細胞凋亡;比目魚??;脛骨前肌

    細胞凋亡(apoptosis)是一種正常情況下的細胞程序性死亡,是機體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要方式。骨骼肌細胞凋亡在骨骼肌正常發(fā)育、生長過程中具有重要作用[1]。有研究表明,運動可造成骨骼肌細胞的凋亡[2],發(fā)現(xiàn)小鼠的肌肉細胞經(jīng)過自發(fā)齒輪運動后出現(xiàn)凋亡[3]。純種馬在經(jīng)過長期的跑臺訓練后,TUNEL檢測發(fā)現(xiàn),肌細胞出現(xiàn)凋亡[4]。骨骼肌細胞凋亡情況與運動強度、運動時間和運動方式有關(guān)。

    細胞凋亡途徑有多種,其中線粒體途徑是目前研究最多的[5]。比目魚肌和脛骨前肌分別是大鼠典型的運動慢肌和快肌。研究表明,慢肌中含有的線粒體比快肌中更多[6]。為了明確不同運動強度對慢肌和快肌中骨骼肌細胞凋亡的影響,本研究以大鼠為模型,分別經(jīng)過不同的運動強度訓練后,檢測大鼠脛骨前肌和比目魚肌中的細胞凋亡及鈣離子含量變化情況,以期為進一步研究運動對骨骼肌細胞凋亡的影響奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物 36只成年SD雄性大鼠,體重200 g~220 g,2月齡,購自河北省實驗動物中心。

    1.1.2 主要儀器及試劑 紫外分光光度計,美國Thermo公司產(chǎn)品;BCA蛋白濃度檢測試劑盒,美國Sigma公司產(chǎn)品;SOD活性檢測試劑盒,上海紀寧實業(yè)有限公司產(chǎn)品;組織蛋白含量測定試劑盒,南京建成生物科技有限公司產(chǎn)品;鈣離子含量檢測試劑盒,浙江愛康生物科技有限公司產(chǎn)品;Bcl-2單克隆抗體、Bax單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物標記的二抗,美國CTS公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 分組 36只成年雄性大鼠隨機分為3組,每組12只。分別為對照組(1組)、一般運動組(2組)、強運動組(3組)。所有實驗動物飼養(yǎng)溫度為22℃~23℃,每天光照時間為7:00~19:00。一般運動組跑臺速度為18 m/min,強運動組跑臺速度為25 m/min,兩組大鼠運動至力竭后停止。對照組大鼠正?;顒硬贿\動。一般運動組和強運動組在試驗開始前1周均進行適應(yīng)性訓練,每天運動10 min,跑臺速度為10 m/min。實驗跑臺坡度均為0°。

    1.2.2 標本制作 各組大鼠運動后立即斷頸處死,同時取頸部血液3 mL,在室溫下靜置60 min 后,4 000 r/min離心15 min,吸取血清上清至新的EP管,放置于4℃?zhèn)溆谩H『笾饶眶~肌和脛骨前肌,其中右后肢部分用于制作石蠟切片和Western blot。左后肢部分用來制作組織勻漿和組織蛋白含量測定。組織勻漿和石蠟切片均按照常規(guī)方法操作制備[7]。

    1.2.3 細胞凋亡檢測 取制作厚度為5 μm的石蠟切片,放置于二甲苯中脫蠟,水化后,放在8.5 g/L的氯化鈉溶液中浸泡5 min,PBS洗滌后用40 g/L的多聚甲醛固定,固定時間為10 min。PBS洗滌后,按照每片100 μL加入濃度為20 μg/mL的Proteinase K處理組織20 min。PBS洗滌后,用40 g/L多聚甲醛固定5 min,PBS洗滌,加入100 μL平衡液,放置于濕盒中孵育12 min。加入100 μL的TUNEL混合液,在37℃避光濕盒中反應(yīng)60 min。用H2O2封閉POD,PBS洗滌后,加入體積為100 μL的Streptavidin標記的HRP(500倍稀釋)反應(yīng)3 min。PBS洗滌,加100 μL的DAB溶液,孵育反應(yīng)10 min,用蘇木素復染,二甲苯透明后封片。觀察細胞凋亡情況。每組大鼠隨機選擇8組切片,顯微鏡下隨機選擇2個視野觀察凋亡細胞數(shù)目,計算細胞凋亡率。

    1.2.4 SOD水平檢測 各組大鼠斷頸處死后,取血清和組織勻漿,按照SOD檢測試劑盒說明書檢測SOD水平。組織蛋白含量水平按照組織蛋白測定試劑盒說明書檢測肌肉組織中的蛋白含量。待測樣品中含有SOD時,亞硝酸鹽形成減少,待測管的吸光度會低于對照管的吸光度,計算SOD水平。

    1.2.5 MDA水平檢測 運用硫代巴比妥酸法檢測組織勻漿和血清中的MDA水平。硫代巴比妥酸可以與MDA反應(yīng)生成紅色物質(zhì),分光光度計檢測532 nm處的吸光度。操作步驟按照MDA檢測試劑盒說明書操作。計算MDA含量。

    1.2.6 鈣離子水平檢測 采用比色法檢測組織勻漿中的鈣離子濃度。取200 μL的濃度為100 g/L的組織勻漿液,10 000 r/min離心10 min后,棄上清液,加入冰預冷的生理鹽水重懸后,分光光度計測定570 nm的吸光度,計算鈣離子濃度。

    1.2.7 Bcl-2、Bax蛋白表達水平檢測 分別取大鼠肌肉組織,剪碎后放置于研缽中,加入液氮充分研磨。取40 mg的組織加入200 μL的細胞裂解液,放置于冰上裂解30 min。12 000 r/min、4℃離心15 min,轉(zhuǎn)移蛋白上清至新的EP管中。取蛋白樣品按照BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書檢測提取的蛋白濃度。取蛋白樣品與Loading buffer充分混合后,100℃煮沸5 min。SDS-PAGE蛋白電泳初始電壓為80 V,最終電壓為120 V,每孔加入變性蛋白樣品為50 μL。按照常規(guī)方法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜電壓為90 V。取出PVDF膜,經(jīng)50 g/L脫脂奶粉封閉后,依次與一抗(400倍稀釋)、二抗(1 000倍稀釋)孵育反應(yīng)后,在暗室中顯影,定影。以GAPDH為參照,分析蛋白表達水平。

    2 結(jié)果

    2.1 細胞凋亡結(jié)果

    TUNEL法檢測各組大鼠脛骨前肌和比目魚肌細胞凋亡顯示,一般運動組大鼠比目魚肌中細胞凋亡率明顯高于對照組,差異極顯著(P<0.01);強運動組大鼠脛骨前肌和比目魚肌中細胞凋亡率均明顯高于對照組,差異極顯著(P<0.01);強運動組大鼠比目魚肌中細胞凋亡率明顯低于一般運動組,差異顯著(P<0.05)(表1)。

    表1 運動對大鼠骨骼肌細胞凋亡的影響

    注:**P<0.01 vs 對照組;#P<0.05 vs 一般運動組。

    Note:**P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs general exercise group.

    2.2 SOD活性檢測結(jié)果

    各組大鼠血清和肌肉SOD水平檢測結(jié)果顯示,一般運動組和強運動組大鼠血清中的SOD活性均明顯低于對照組,差異極顯著(P<0.01)。一般運動組大鼠比目魚肌中SOD活性明顯高于對照組,差異極顯著(P<0.01);強運動組大鼠比目魚肌中的SOD活性明顯低于一般運動組,差異極顯著(P<0.01)(圖1)。

    2.3 MDA水平檢測結(jié)果

    各組大鼠血清和肌肉MDA水平檢測結(jié)果顯示,一般運動組和強運動組大鼠血清中MDA水平均明顯低于對照組,差異極顯著(P<0.01)。一般運動組大鼠脛骨前肌和比目魚肌中MDA水平均明顯高于對照組,差異極顯著(P<0.01);強運動組大鼠脛骨前肌中MDA水平明顯高于對照組,差異顯著(P<0.05);強運動組大鼠比目魚肌中MDA水平明顯高于對照組,差異極顯著(P<0.01)(圖2)。

    A.大鼠血清中SOD活性;B.大鼠肌肉組織勻漿上清中的SOD活性;1.對照組;2.一般運動組;3.強運動組;**P<0.01 vs 對照組;##P<0.01 vs 一般運動組

    A.SOD activity in serum of rats;B.SOD activity in the supernatant of rat muscle tissue;1.Control group;2.General exercise group;3.Strong exercise group;**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs general exercise group

    圖1運動對大鼠血清及肌肉組織中SOD活性的影響

    Fig.1 Effect of exercise on the activity of SOD in serum and muscle tissue of rats

    A.大鼠血清中MDA水平;B.大鼠肌肉組織勻漿上清中的MDA水平;1.對照組;2.一般運動組;3.強運動組;*P<0.05 vs 對照組;**P<0.01 vs 一般運動組

    A.MDA level in serum of rats;B.MDA level in the supernatant of rat muscle tissue;1.Control group;2.General exercise group;3.Strong exercise group;*P<0.05 vs control group;**P<0.01 vs general movement group

    圖2運動對大鼠血清及肌肉組織中MDA水平的影響

    Fig.2 Effect of exercise on the level of MDA in serum and muscle tissue of rats

    2.4 鈣離子水平檢測結(jié)果

    各組大鼠肌肉組織鈣離子水平檢測結(jié)果顯示,一般運動組大鼠比目魚肌中鈣離子水平明顯高于對照組,差異顯著(P<0.05);強運動組大鼠比目魚肌中鈣離子水平明顯低于對照組,差異顯著(P<0.05)(圖3)。

    2.5 Bcl-2、Bax表達結(jié)果

    Western blot檢測各組大鼠比目魚肌和脛骨前肌組織中Bcl-2、Bax表達水平。結(jié)果顯示,強運動組大鼠脛骨前肌和比目魚肌中Bax蛋白表達水平明顯高于對照組,差異極顯著(P<0.01)。強運動組大鼠脛骨前肌中Bcl-2蛋白表達水平明顯低于對照組,差異極顯著(P<0.01)。強運動組大鼠比目魚肌中Bcl-2蛋白表達水平明顯低于對照組,差異顯著(P<0.05)。一般運動組大鼠比目魚肌中Bax表達水平明顯高于對照組,差異極顯著(P<0.01);一般運動組大鼠比目魚肌中Bcl-2表達水平明顯低于對照組,差異極顯著(P<0.01)(圖4)。

    1.對照組;2.一般運動組;3.強運動組;*P<0.05 vs 對照組;#P<0.01 vs 一般運動組

    1.Control group;2.General exercise group;3.Strong exercise group;*P<0.05 vs control group;#P<0.01 vs group

    圖3運動對大鼠肌肉組織中鈣離子含量的影響

    Fig.3 Effect of exercise on the content of calcium in muscle tissue of rats

    A.脛骨前肌Western blot結(jié)果;B.脛骨前肌蛋白表達率;C.比目魚肌Western blot結(jié)果;D.比目魚肌蛋白表達率;1.對照組;2.一般運動組;3.強運動組;*P<0.05 vs 對照組;**P<0.01 vs 對照組

    A.Western blot results of anterior tibial muscle;B.Protein expression rate of tibialis anterior muscle;C.Western blot results of soleus muscle;D.Protein expression rate of soleus muscle;1.Control group;2.general exercise group;3.Strong exercise group;*P<0.05;vs control group;**P<0.01 vs control group

    圖4運動對大鼠肌肉組織中Bax、Bcl-2表達影響

    Fig.4 Effect of exercise on the expression of Bax and Bcl-2 in muscle tissue of rats

    3 討論

    在哺乳動物中,肌肉的發(fā)育與肌細胞凋亡具有密切關(guān)系。缺血再灌注、肌肉營養(yǎng)不良等均可以引發(fā)骨骼肌細胞凋亡。近年的研究發(fā)現(xiàn),不同的運動方式、運功強度、運動時間均可以不同程度的影響骨骼肌細胞的凋亡[8]。慢性心衰患者由于運動量的減少,有50%的患者出現(xiàn)不同程度的骨骼肌細胞凋亡[9]。一次性高強度負荷運動訓練可以引發(fā)細胞凋亡。長期的高強度負荷訓練適應(yīng)不會引發(fā)肌肉組織的炎癥,壞死的細胞可以經(jīng)過凋亡被清除。大鼠運動后48 h和0 h,骨骼肌均出現(xiàn)了明顯的細胞凋亡[10]。

    大鼠骨骼肌中的比目魚肌和脛骨前肌含有的Ⅰ型肌纖維大約為87%和2%,是典型的大鼠慢肌和快肌[11]。本研究中,大鼠經(jīng)過一般運動強度和高強度運動后0 h,分別取大鼠比目魚肌和脛骨前肌,經(jīng)TUNEL檢測細胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過一般運動強度的大鼠比目魚肌中出現(xiàn)了明顯的細胞凋亡,脛骨前肌細胞細胞凋亡情況沒有變化。而經(jīng)過高強度運動訓練的強運動組大鼠比目魚肌和脛骨前肌中細胞凋亡均明顯上升,與對照組相比差異顯著(P<0.01)。結(jié)果還顯示,一般運動組比目魚肌細胞凋亡情況高于強運動組。這提示,一般運動強度更容易引起慢肌細胞凋亡。

    氧自由基參與細胞凋亡過程[12]。有研究表明,氧自由基可以在體外誘導細胞凋亡[13]。在運動過程中,機體內(nèi)的代謝增多,能量的消耗也逐漸增多。為了滿足代謝的需求,機體耗氧量增加,線粒體內(nèi)的磷酸化過程也呈上升趨勢[14]。氧自由基的產(chǎn)生與線粒體電子傳遞過程有關(guān)[15]。SOD的活性和MDA的含量可以間接反映氧自由基的水平[16]。本研究發(fā)現(xiàn),一般運動組比目魚肌中的SOD活性高于對照組和強運動組,與一般運動組脛骨前肌相比明顯增高。強運動組比目魚肌和脛骨前肌中的SOD活性沒有明顯差異。一般運動組大鼠脛骨前肌中的MDA含量高于比目魚肌。這表明,一般運動強度更容易使慢肌產(chǎn)生自由基,而快肌對氧自由基的抵御水平高于慢肌。

    鈣離子水平在細胞信號轉(zhuǎn)導過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。鈣離子濃度的變化調(diào)控著多種病理及生理活動[18]。細胞維持正常的生理功能的基礎(chǔ)是鈣離子濃度的穩(wěn)定。運動過程中,肌肉的收縮與細胞鈣離子濃度有關(guān)[19]。鈣離子濃度與細胞凋亡有關(guān),多數(shù)報道表明鈣離子濃度升高會導致細胞凋亡。在某些特殊情況下,鈣離子濃度的升高對細胞凋亡起到抑制作用[20]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),運動后大鼠比目魚肌和脛骨前肌中的鈣離子濃度均有所上升,一般訓練后比目魚肌的鈣離子濃度上升最為明顯。

    Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。Bcl-2和Bax都屬于Bcl-2蛋白家族的成員[21]。Bcl-2在細胞凋亡過程中發(fā)揮抑制作用,Bax在細胞凋亡過程中發(fā)揮促進作用[22]。本研究用Western blot檢測了大鼠比目魚肌和脛骨前肌中的Bcl-2、Bax水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),一般運動組比目魚肌中的Bax水平增高,Bcl-2水平降低。這提示,運動引起的骨骼肌細胞凋亡與Bcl-2、Bax有關(guān)。

    綜上所述,一般強度竭力運動后,慢肌和快肌都出現(xiàn)細胞凋亡且慢肌的細胞凋亡最為明顯。一般運動強度比高強度運動更容易引發(fā)慢肌的細胞凋亡。其作用機制可能與細胞中氧自由基水平、鈣離子含量、Bcl-2、Bax水平有關(guān)。本研究為進一步研究運動與骨骼肌細胞凋亡奠定了基礎(chǔ)。

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    EffectofExerciseonCellApoptosisandCa2+ContentinRatSkeletalMuscle

    WANG Hai-sheng1,WANG Zhi-yong1,JIANG Huan-huan2

    (1.DepartmentofPublicPhysicalEducation,HebeiNorthUniversity,Zhangjiakou,Hebei,075000,China; 2.DepartmentofPharmacy,SecondAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou,Hebei,075000,China

    To investigate the effect of exercise on the apoptosis of skeletal muscle cells and the content of Ca2+in rat skeletal muscle,the rats were divided into control group, exercise group and strong exercise group,the rats in control group

    normal activities,the running speed in general exercise group rats was 18 m/min,and in strong exercise group rats was 25 m/min.The rats in general exercise group and exercise group were strong running to exhaustion.To detect the apoptosis of rat soleus muscle and anterior tibial muscle cells,the SOD activity,MDA content and Ca2+content in rat sera and rat hind limb tissue homogenate,and the expression levels of Bax and Bcl-2 in rat muscle tissue were detected.The apoptosis rate of the rats in the general exercise group was significantly higher than that in the control group (P<0.01).The SOD activity was significantly higher in the general exercise group than in the control group,the difference was significant (P<0.01);The SOD activity in the muscle of the strong exercise group was significantly lower than that in the general exercise group,and the difference was significant (P<0.01).The levels of MDA in the serum of general exercise group and strong exercise group were significantly lower than those in control group,and the difference was significant (P<0.01).The MDA levels in the anterior tibial muscle and the skeletal muscle of the general exercise group were significantly higher than those in the control group,and the difference was significant (P<0.01).The levels of Ca2+in the general exercise group was significantly higher than that in the control group,and the difference was significant (P<0.05).The level of Bax expression in general exercise of soleus muscle was significantly higher than that in the control group was significantly lower than that in the control group,the difference was significant (P<0.01).The expression of Bcl-2 in rat soleus muscle in general exercise group was significantly lower than that in the control group,the difference was significant (P<0.01).The general exercise is more likely to lead to the apoptosis of the muscle cells of soleus muscle.The mechanism may be related to the Ca2+concentration,the level of oxygen free radicals,Bax and Bcl-2 expressions.

    exercise;apoptosis;soleus muscle;anterior tibial muscle

    2016-09-04

    王海生(1978-),男,河北張家口人,講師,碩士,主要從事體育教育訓練研究。

    S852.21

    :A

    :1007-5038(2017)09-0078-06

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    切開復位內(nèi)固定與有限內(nèi)固定聯(lián)合外固定治療脛骨Pilon骨折的對比觀察
    骨骼肌缺血再灌注損傷的機制及防治進展
    多功能脛骨帶鎖髓內(nèi)釘治療脛骨近端關(guān)節(jié)外骨折的臨床觀察
    中藥結(jié)合植骨內(nèi)固定治療脛骨骨不連23例
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