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    冬凌草甲素對(duì)乳腺癌Bcap-37細(xì)胞凋亡影響的研究

    2017-09-15 15:35:24魯遙張嵐?fàn)?/span>駱豐陳琳章浙忠
    浙江臨床醫(yī)學(xué) 2017年8期
    關(guān)鍵詞:冬凌草甲素培養(yǎng)液

    魯遙 張嵐?fàn)?駱豐 陳琳 章浙忠?

    冬凌草甲素對(duì)乳腺癌Bcap-37細(xì)胞凋亡影響的研究

    魯遙 張嵐?fàn)?駱豐 陳琳 章浙忠?

    目的 通過體外無(wú)菌培養(yǎng)乳腺癌Bcap-37細(xì)胞,觀察冬凌草甲素對(duì)Bcap-37細(xì)胞的活性以及凋亡的影響,探索冬凌草甲素的抗腫瘤機(jī)制。方法 無(wú)菌培養(yǎng)Bcap-37細(xì)胞,冬凌草甲素濃度為0、1、2、4、8、16、32、64μg/ml,作用12、24、36、48h時(shí),采用MMT法檢測(cè)冬凌草甲素抑制Bcap-37細(xì)胞活性;冬凌草甲素濃度為8μg/ml、32μg/ml,作用24h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)Bcap-37細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 冬凌草甲素對(duì)乳腺癌Bcap-37細(xì)胞有增殖抑制以及誘導(dǎo)凋亡的作用。結(jié)論 冬凌草甲素可抑制乳腺癌Bcap-37細(xì)胞的增殖以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,為臨床治療乳腺癌提供了新的依據(jù)。

    冬凌草甲素 Bcap-37細(xì)胞 細(xì)胞凋亡

    據(jù)2011年全球癌癥統(tǒng)計(jì),全球新增乳腺癌患者1380000例,占同期新增癌癥患者例數(shù)的23%,死亡率則占同期癌癥死亡率的14%[1],目前仍無(wú)公認(rèn)的最佳治療藥物。隨著新型抗腫瘤藥物的不斷更新,乳腺癌治療后生存率也有所提高,但始終未達(dá)到理想的臨床效果。雖然手術(shù)治療是乳腺癌的首選治療方案,但是晚期乳腺癌以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌仍然威脅患者的生命,如何有效控制乳腺癌的發(fā)展以及促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡是本研究的主要目的。冬凌草甲素是從冬凌草中提取天然類化合物,味甘苦,性微寒,具清熱解毒﹑消炎止痛﹑健胃活血及抗腫瘤之功用,素有“人間仙草”之美稱[2]。本研究將不同濃度冬凌草甲素作用于Bcap-37細(xì)胞,觀察冬凌草甲素對(duì)Bcap-37細(xì)胞的活性以及凋亡的影響。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞 乳腺癌Bcap-37購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所。

    1.2 主要試劑 冬凌草甲素(HPLC≥98%)(TAUTO BIOTECH);PBS緩沖液(PH7.2±0.1)(吉諾生物);無(wú)支原體胎牛血清(FB)(天杭生物);RPMI 1640培養(yǎng)液(吉諾生物);噻唑藍(lán)(MTT)﹑二甲基亞砜(DMSO)(美國(guó)Sigma公司);0.25%胰蛋白酶(吉諾生物);Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(聯(lián)科生物);DMEM培養(yǎng)液(吉諾生物)。

    1.3 儀器 酶標(biāo)儀(美國(guó)Dynatech公司,型號(hào)MR-4100);細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司,型號(hào)HEPA CLASS 1003111);倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司,型號(hào)CKX31);熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司,型號(hào)IX71);流式細(xì)胞儀(美國(guó)guava 公司,型號(hào)guava easyCyte 6-2L)。

    1.4 方法 (1)細(xì)胞培養(yǎng):將Bcap-37細(xì)胞置于DMEM高糖培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代時(shí),按1:1加入0.25%胰酶和DMEM高糖培養(yǎng)液,待胰酶消化后,離心后收集細(xì)胞懸液至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng),細(xì)胞傳代3次后可用于實(shí)驗(yàn)。(2)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力:采用MTT法檢測(cè),將1.0×104個(gè)/孔的密度細(xì)胞傳代培養(yǎng)于4個(gè)96孔板中。冬凌草甲素濃度設(shè)置為0﹑1﹑2﹑4﹑8﹑16﹑32﹑64μg/ml,培養(yǎng)時(shí)間分別設(shè)置為12﹑24﹑36﹑48h,每組5個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)。定時(shí)加入20μl 5 mg/ml MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去培養(yǎng)液,加入150μl DMSO,在570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度值(A570)。細(xì)胞活力計(jì)算公式:細(xì)胞活力(%)=(加藥組A570 -空白組A570)/(對(duì)照組A570 - 空白組A570)×100%。獨(dú)立重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置為:對(duì)照組﹑8μg/ml組和32μg/ml組。將1.0×104個(gè)/孔的密度細(xì)胞傳代培養(yǎng)于24孔板中,待細(xì)胞貼壁后,按照設(shè)定濃度加入冬凌草甲素培養(yǎng)液,重復(fù)3次,培養(yǎng)24h后低速離心收集細(xì)胞,加入PBS重懸液后洗滌傾去上清液,加入1×binding buffer 500μl重懸細(xì)胞呈單細(xì)胞懸液,然后加入5μl Annexin V和10μl的PI,避光室溫孵育5min后,上機(jī)檢測(cè);測(cè)定細(xì)胞數(shù)為10000 個(gè);使用guava 微流式細(xì)胞分析儀Nexin程序。獨(dú)立重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示,組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 冬凌草甲素對(duì)Bcap-37細(xì)胞增殖活力的影響 冬凌草甲素濃度能有效地抑制Bcap-37細(xì)胞增殖,呈劑量-時(shí)間依賴性。冬凌草甲素抑制Bcap-37細(xì)胞增殖的最佳抑制濃度為32 μg/ml,最低抑制濃度為8 μg/ ml,最佳作用時(shí)間為24h。32 μg/ml的冬凌草甲素作用于細(xì)胞24h后,Bcap-37細(xì)胞活力為(19.89±2.19)%,明顯低于對(duì)照組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

    圖1 冬凌草甲素對(duì)Bcap-37細(xì)胞增殖活力的影響

    2.2 冬凌草甲素對(duì)Bcap-37細(xì)胞凋亡的影響 8 μg/ ml的冬凌草甲素作用于Bcap-37細(xì)胞24 h后,凋亡比例為5.45±0.21%;32 μg/ml冬凌草甲素作用于Bcap-37細(xì)胞24 h后,凋亡比例為14.85±0.92%,與空白組(1.9±0.17%)相比,早期凋亡細(xì)胞的比例顯著提升,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),結(jié)果提示冬凌草甲素能引起B(yǎng)cap-37細(xì)胞的凋亡,且呈一定的劑量依賴性。見圖2。

    圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)冬凌草甲素對(duì)Bcap-37細(xì)胞凋亡的影響

    3 討論

    乳腺癌是全球女性中最常見的一種腫瘤,并且逐漸成為了一種全球性的問題,盡管乳腺癌的預(yù)后有大幅改善,但是在中低收入國(guó)家,乳腺癌的病死率仍較高。乳腺癌的病因尚未完全清楚,從前期研究發(fā)現(xiàn)其可能與內(nèi)源性或外源性雌激素的長(zhǎng)期作用﹑乳腺導(dǎo)管和小葉的不典型增生﹑營(yíng)養(yǎng)狀況﹑遺傳家族史等均有關(guān)聯(lián),目前常用的治療方法有藥物治療﹑手術(shù)治療﹑放射治療[3-5],但是新觀點(diǎn)和新研究使人們深入地認(rèn)識(shí)到乳腺癌僅依靠單一的治療方法是不能達(dá)到根治的目的,必須采取綜合治療手段,有效殺死或抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng),減少體內(nèi)癌負(fù)荷,增強(qiáng)機(jī)體免疫力,提高自身抗癌能力。

    冬凌草甲素是從冬凌草中提取的天然類化合物,可作為新型防癌劑,具有抗腫瘤作用[2]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),冬凌草甲素能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖,但作用機(jī)制尚不明確。通過以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),冬凌草甲素能顯著抑制Bcap-37細(xì)胞的增殖,且最佳抑制濃度為32 μg/ml,32 μg/ml的冬凌草甲素作用于Bcap-37細(xì)胞24h后,細(xì)胞活力為(19.89±2.19)%,明顯低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),8μg/ml的冬凌草甲素作用于Bcap-37細(xì)胞24 h后,凋亡比例為(5.45±0.21)%;32 μg/ml冬凌草甲素作用于Bcap-37細(xì)胞24 h后,凋亡比例為(14.85±0.92)%,與空白組(1.9±0.17%)相比,早期凋亡細(xì)胞的比例顯著提升,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),結(jié)果提示冬凌草甲素能引起B(yǎng)cap-37細(xì)胞的凋亡。

    大量的研究發(fā)現(xiàn),冬凌草甲素可以從多條通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[6],生物個(gè)體是一個(gè)整體,細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路交織成復(fù)雜網(wǎng)絡(luò),相互調(diào)節(jié)是常見機(jī)制,具體的凋亡程序還需要進(jìn)一步研究。如何更準(zhǔn)確地抑制該信號(hào)通路,如何篩選更為合適的靶向藥物以及存在的安全問題都是應(yīng)當(dāng)考慮的,有待更深入的研究。

    [1] Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics.CA:a cancer journal for clinicians,2011,61(2):69-90.

    [2] 劉淑云,譚英姿,范明松,等.冬凌草甲素研究進(jìn)展.中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥,2012,19(13):17-18.

    [3] 劉建國(guó).乳腺癌的致病因素及治療原則.中國(guó)社區(qū)醫(yī)師,2012,14(5):48.

    [4] 潘凌霄,鄭文博,高進(jìn).乳腺癌的綜合治療.求醫(yī)問藥(學(xué)術(shù)版),2012,10(2):270.

    [5] 賈臻,胡夕春.乳腺癌的藥物治療進(jìn)展.藥品評(píng)價(jià),2012,9(6):4-7.

    [6] 金星鏡,丁文評(píng),張蓮,等.冬凌草甲素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116生長(zhǎng)的影響及其機(jī)制研究.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014, 14(23):44-46

    Objective To cultivate Bcap-37 cells of breast cancer through aseptic manipulation in vitro,observe the infl uence of oridonin on the activity and apoptosis of Bcap-37 cells,and explore anti tumor mechanism of oridonin. Methods Axenic cultivation of Bcap-37 cells,set the concentrations of oridonin by 0,1,2,4,8,16,32,64ug/ml respectively,after 12,24,36,48 hours,detect the inhibition of oridonin to Bcap-37 cells activity by MMT method;set the concentrations of oridonin by 8 ug/ml,32ug/ml,24 hours later,use fl ow cytometry to detect the effect of apoptosis on Bcap-37 Cells by oridonin. Results Oridonin has the effect on inhibiting the proliferation and inducing apoptosis of Bcap-37 cells. Conclusion Oridonin can inhibit the proliferation of Bcap-37 cells and induce the apoptosis of Bcap-37 cells,thus providing a new reference for the clinical treatment of breast cancer.

    Oridonin Bcap-37 cells Apoptosis

    浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016ZB038);浙江中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)科研基金項(xiàng)目(2015ZY10)

    310000 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院

    *通信作者

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