亞硝酰氫對心力衰竭大鼠心臟保護作用的研究

徐繼堯 郭彥青 楊晉靜 柴曉紅 王日軍 龐工力 王婧 王寧 張昊洲 王敬萍

亞硝酰氫對心力衰竭大鼠心臟保護作用的研究

徐繼堯 郭彥青 楊晉靜 柴曉紅 王日軍 龐工力 王婧 王寧 張昊洲 王敬萍

目的 探討亞硝酰氫對心力衰竭大鼠心臟是否有保護作用。方法 選取50只雄性Wistar大鼠，從中隨機抽取42只采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支方法制作心肌梗死后心力衰竭模型，剩余8只作為假手術(shù)組（Sham組，n=8）。術(shù)后3 d手術(shù)組大鼠存活17只，隨機分為心力衰竭對照組（HF組，n=8）和亞硝酰氫治療組（HNO組，n=9）。術(shù)后第3天開始給予HNO組大鼠腹腔注射亞硝酰氫供體Angeli′s salt，HF組及Sham組均給予等量生理鹽水；4周后用ELISA法檢測大鼠外周血N末端B型利鈉肽（NT-proBNP）水平，超聲心動圖檢測大鼠心功能，左心壓力導管檢測大鼠血流動力學改變，最后處死大鼠，計算心體指數(shù)。結(jié)果 術(shù)后4周HNO治療組大鼠與HF組相比，NT-ProBNP、左心室舒張末壓（LVEDP）明顯降低［（385.65±43.50）pg/ml比（496.13±52.80）pg/ml，P＜0.01；（17.49±2.04）mm Hg比（21.19±1.91）mm Hg，P＜0.05］，左心室射血分數(shù)（LVEF）［（52.88±5.46）%比（39.71±3.64）%，P＜0.01］、左心室短軸收縮率（LVFS）［（23.75±3.11）%比（16.57±1.72）%，P＜0.01］、左心室內(nèi)壓力最大上升速率（+dp/dt）［（3029.13±634.12）mm Hg/s比（2347.43±451.38）mm Hg/s，P＜0.05］、左心室內(nèi)壓力最大下降速率（-dp/dt）［（2896.50±642.66）mm Hg/s比（2169.29±433.17）mm Hg/s，P＜0.05］明顯增加，心體指數(shù)（HW/BW）、左心室舒張末內(nèi)徑（LVEDd）、左心室收縮壓（LVSP）無明顯差異［（2.97± 0.17）g/kg比（2.98±0.16）g/kg，（7.19±0.87）mm比（7.66±0.84）mm，（131.38±9.47）mm Hg比（130.57±11.46）mm Hg，P均＞0.05］。結(jié)論 亞硝酰氫可以增強心力衰竭大鼠心臟功能，改善血流動力學，降低外周血NT-ProBNP水平，對心力衰竭大鼠心臟起保護作用。

心力衰竭； 亞硝酰氫； 壓力導管； 血流動力學

急性心肌梗死（AMI）是各種原因引起的冠狀動脈狹窄或閉塞，導致冠脈有效循環(huán)血量減少或心肌氧供需矛盾使相應區(qū)域心肌缺血、缺氧性損害的一類疾病[1]。如果不及時治療或治療不當，將導致病變部位心肌細胞變性、凋亡或壞死，最終導致心臟舒縮功能障礙，不能滿足機體生理需求，出現(xiàn)心力衰竭（heart failure，HF），也是導致患者死亡的重要原因之一。目前HF的藥物治療雖可以改善患者的急性癥狀，但對其長期預后卻不是十分理想[2]。近期研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酰氫（Nitroxyl，HNO）可改善心臟收縮和舒張功能，擴張容量血管和阻力血管[3]，對心臟起保護作用。但這些研究大都局限于離體組織[4]或細胞實驗。HNO是否可以在生物體內(nèi)穩(wěn)定存在并發(fā)揮心臟保護作用，是否會影響生物體的心率、血壓變化仍未得到進一步證實。本實驗使用HNO供體Angeli′s salt[5]干預急性心肌梗死后心力衰竭大鼠，探討HNO對心衰大鼠心臟是否具有保護作用。

1 材料與方法

1.1 急性心肌梗死后心力衰竭模型制備 將大鼠稱重后用10%水合氯醛（3 ml/kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸前區(qū)及胸前區(qū)備皮，連接心電監(jiān)護，行氣管插管，呼吸機輔助呼吸（潮氣量10 ml，呼吸頻率60次/min，呼吸比1∶1）。開胸，用7/0無創(chuàng)縫合線在左心耳下方0.5～1.0 mm處結(jié)扎心臟左冠狀動脈前降支（LAD），結(jié)扎當時ST段明顯抬高（≥1/2R波），結(jié)扎遠端心臟變蒼白，逐層關(guān)胸，將大鼠放至37℃恒溫箱中自然蘇醒。

1.2 實驗分組及藥物干預 選取50只健康、雄性Wistar大鼠（購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，6～8周齡，體重160～180 g，健康編號0011896），其中42只制作心肌梗死后心力衰竭模型，術(shù)后3 d存活17只，隨機分為心衰對照組（HF組，n=8）和亞硝酰氫治療組（HNO組，n=9）；其余8只作為假手術(shù)組（Sham組，n=8，只予左心耳下方穿一縫合線，不結(jié)扎）。術(shù)后第3天開始給予HNO組大鼠HNO供體Angeli′s salt（AS，Cayman，USA）0.2 mg/kg[5]腹腔注射，2次/d；HF組和Sham組均給予等量生理鹽水；術(shù)后4周結(jié)束實驗。實驗中HF組和HNO組大鼠各死亡1只，均死于心衰。

1.3 N末端B型利鈉肽（NT-proBNP）測定 按ELISA試劑盒（ADL，USA）操作說明書測定。術(shù)后4周從鼠尾靜脈抽取靜脈血，3000 rpm離心10 min，收集血清；將血清樣品與不同濃度的標準品加入酶標板中，再加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體，37℃溫育1 h，洗板5次，加入底物A、B，37℃避光孵育15min，加入終止液，用450 nm波長檢測各孔OD值，繪制標準曲線，計算樣品中NT-proBNP含量。

1.4 超聲心動圖檢測心功能指標 所有大鼠均于術(shù)后4周行超聲心動圖檢查。檢測前用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥固定，胸前區(qū)備皮；用小動物超聲探頭（探頭頻率10 MHz，圖像深度2.5 cm）取胸骨旁左室長軸及短軸切面進行測量，測量參數(shù)包括左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDd）、左心室射血分數(shù)（LVEF）、左心室短軸收縮率（LVFS），每個指標取3個心動周期的平均值。

1.5 左心壓力導管檢測血流動力學指標 用BL-410生物轉(zhuǎn)換系統(tǒng)檢測血流動力學各項指標。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰臥固定，頸部備皮，分離右頸內(nèi)動脈，用連有壓力換能器的導管經(jīng)右頸內(nèi)動脈插入左心室，待出現(xiàn)穩(wěn)定的壓力波形時記錄大鼠左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、左心室內(nèi)壓力最大上升速率（+dp/dt）、左心室內(nèi)壓力最大下降速率（-dp/dt），每個指標用3個不同時刻的平均值代替。

1.6 心體指數(shù)計算 處死大鼠前稱取其體重（BW），然后迅速處死大鼠，取出心臟，生理鹽水洗凈殘血，準確稱取心臟重量（HW）。心體指數(shù)=HW/ BW。

1.7 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件分析。計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組間NT-proBNP及心體指數(shù)檢測結(jié)果 與Sham組相比，HF組NT-proBNP明顯增加（P＜0.01），而HW、BW及HW/BW均無明顯差異（P＞0.05）；與HF組相比，HNO治療組NT-proBNP明顯降低（P＜0.01），HW、BW、HW/BW亦無明顯差異（P＞0.05）。見表1。

表1 大鼠NT-proBNP、心體指數(shù)比較（±s）

表1 大鼠NT-proBNP、心體指數(shù)比較（±s）

注：NT-proBNP：N末端B型利鈉肽；HW：心臟重量；BW：體重；HW/BW：心體指數(shù)。與Sham組相比，aP＜0.01；與HF組相比，bP＜0.01

組別 NT-proBNP（pg/m l）HW（g）BW（g）HW/BW（g/kg）Sham組 148.04±19.94 0.73±0.04 242.75±7.50 3.01±0.10 HF組 496.13±52.80a 0.72±0.05 241.14±6.01 2.98±0.16 HNO治療組 385.65±43.50b 0.73±0.05 244.25±7.96 2.97±0.17

2.2 超聲心動圖檢測結(jié)果 與Sham組相比，HF組LVEF、LVFS明顯降低（P＜0.01），LVEDd明顯增加（P＜0.01）；與HF組相比，HNO治療組LVEF、LVFS明顯增加（P＜0.01），LVEDd無明顯差異（P＞0.05）。見表2。

表2 大鼠超聲心動圖各項指標比較（±s）

表2 大鼠超聲心動圖各項指標比較（±s）

注：LVEDd：左心室舒張末期內(nèi)徑；LVEF：左心室射血分數(shù)；LVFS：左心室短軸收縮率。與Sham組相比，aP＜0.01；與HF組相比，bP＜0.01

組別 L V E D d（m m） L V E F（%） L V F S（%）S h a m組 5 . 0 9 ± 0 . 6 6 8 1 . 2 5 ± 1 0 . 9 9 4 6 . 2 5 ± 1 2 . 1 2 H F組 7 . 6 6 ± 0 . 8 4a 3 9 . 7 1 ± 3 . 6 4a 1 6 . 5 7 ± 1 . 7 2aH N O治療組 7 . 1 9 ± 0 . 8 7 5 2 . 8 8 ± 5 . 4 6b 2 3 . 7 5 ± 3 . 1 1b

2.3 血流動力學檢測結(jié)果 與Sham組相比，HF組LVEDP明顯增加（P＜0.01），+dp/dt、-dp/dt明顯減低（P＜0.01），LVSP無明顯差異（P＞0.05）；與HF組相比，HNO治療組LVEDP明顯減低（P＜0.05），+dp/dt、-dp/dt明顯增加（P＜0.05），LVSP無明顯差異（P＞0.05）。見表3。

表3 大鼠血流動力學各項指標比較（±s）

表3 大鼠血流動力學各項指標比較（±s）

注：LVSP：左心室收縮壓；LVEDP：左心室舒張末壓；+dp/dt：左心室內(nèi)壓力最大上升速率；-dp/dt：左心室內(nèi)壓力最大下降速率。與Sham組相比，aP＜0.01；與HF組相比，bP＜0.05

組別 LVSP（mm Hg）LVEDP（mm Hg）+dp/dt（mm Hg/s）-dp/dt（mm Hg/s）Sham組 139.13±6.75 7.26±0.70 4170.50±646.82 3929.25±557.97 HF組 130.57±11.46 21.19±1.91a2347.43±451.38a2169.29±433.17aHNO治療組 131.38±9.47 17.49±2.04b3029.13±634.12b2896.50±642.66b

3 討論

HNO被認為是一氧化氮的單電子還原產(chǎn)物，與其他氮氧化物相比具有一些特殊的化學性質(zhì)[6]。它既可以作為還原劑與一些重要蛋白質(zhì)的金屬反應中心結(jié)合，改變其生物學活性；又可以作為氧化劑與具有半胱氨酸活性的巰基反應，將其氧化成N-羥化亞磺酰胺（RSNHOH）或形成二硫鍵改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，導致蛋白質(zhì)功能的變化。心肌細胞中的一些蛋白質(zhì)，如受磷蛋白、肌漿網(wǎng)鈣泵、雷諾丁受體、肌絲蛋白等均含有半胱氨酸活性巰基位點，HNO可改變這些蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象改善心肌細胞功能[7]。離體心臟灌流實驗[8]表明，HNO供體AS可呈劑量依賴性增加大鼠心臟冠狀動脈血流量，有效減輕心臟負荷，同時改善左心室收縮及舒張功能。

本實驗采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支（LAD）的方法制作心肌梗死后心力衰竭模型。該方法需在氣管插管、呼吸機輔助呼吸的條件下打開胸腔，迅速、準確地結(jié)扎LAD。術(shù)后大鼠成活率較低，但成模率可達100%，且造模所需時間短，模型穩(wěn)定、可靠，術(shù)后大鼠心衰程度相當。更重要的是心梗后心力衰竭模型對外周血管阻力影響相對較小，可在不改變外周血管阻力的條件下研究HNO對HF大鼠心血管功能的影響，增加實驗的說服力。

實驗中手術(shù)組大鼠心腔明顯大于Sham組，射血分數(shù)明顯降低，說明手術(shù)組大鼠出現(xiàn)了明顯的心衰，模型制作成功。經(jīng)過HNO治療4周后LVEF、LVFS明顯改善，初步證明HNO可以改善心力衰竭大鼠心臟功能，但對心衰大鼠LVEDd沒有影響，可能與我們的實驗周期短或與HNO的藥理作用有限有關(guān)。

為了進一步探討HNO對衰竭心臟的保護作用，本實驗采用左心壓力導管對所有大鼠進行血流動力學檢測，結(jié)果顯示，HNO可以明顯改善HF大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dt，與Chin等[8]的結(jié)果一致，再次證明HNO對心力衰竭心臟具有保護作用。LVEDP是重要的血流動力學指標之一，可在一定程度上反映心衰早期心臟的收縮功能、心臟負荷等。本實驗表明，HNO可明顯降低 HF大鼠LVEDP，減輕心臟負荷[9]，改善心臟功能。另外，HNO治療組大鼠+dp/dt明顯增加，說明HNO可以通過增加心臟收縮期收縮速度增強心肌收縮力，改善心臟收縮功能[6,7]。而-dp/dt主要反映心臟的舒張功能，在心衰后期dp/dt明顯低于正常，經(jīng)HNO治療后-dp/dt較對照組升高，因此，HNO也可以通過改善心臟舒張功能[8]對衰竭心臟起保護作用。

NT-proBNP是反映HF程度的重要指標，與HF的嚴重程度呈正相關(guān)[10]。本實驗中HNO供體AS治療組大鼠外周血NT-proBNP水平較HF組明顯降低，說明HNO可以減輕心室室壁張力，改善HF大鼠心功能，對HF大鼠有一定治療作用。但各組間心體指數(shù)卻無明顯差異，可能是因為結(jié)扎LAD后局部心肌壞死、吸收與梗死周邊區(qū)心肌細胞肥大、增生共存有關(guān)。

綜上所述，HNO可以增強急性心肌梗死后心力衰竭大鼠心臟功能，改善衰竭心臟血流動力學，降低外周血NT-proBNP水平，對心力衰竭大鼠心臟起保護作用，為心力衰竭的藥物治療提供新的方向。

本實驗的不足之處是沒有監(jiān)測大鼠肝腎功能及其他系統(tǒng)的變化。今后實驗中我們將進一步驗證HNO在改善心功能的同時是否對其他系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響，為HNO的安全性收集相關(guān)證據(jù)。

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The protective effect of Nitroxylon the heart of ratsw ith heart failure

XU Ji-yao，GUO Yan-qing，YANG Jin-jing，et al.The First Clinical Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

WANG Jing-ping，E-mail：525722439@qq.com

ObjectiveTo explore whether nitroxyl has a protective effect on the heart of rats with heart failure.M ethods50 male Wistar rats were selected and 42 rats out of them were selected to build heart failure model after acute myocardial infarction by a ligation of anterior descending branch，17 rats survived，which were randomly divided into heart failure group（HF group，n=8）and nitroxyl-treated group（HNO group，n=9），the remaining 8 rats were taken as a sham operation group（n=8），Nitroxyl donor Angeli′s saltwere intraperitoneal injection to HNO group from the day 3 after operation，the HF group and the sham group were given the same dose normal saline，4 weeks later，the level of NT-ProBNP in rats′peripheral blood had been tested by ELISA method，the ultrasonic cardiogram and the left-heart pressure transducer were used to test the rats′cardiac function，the rats were eventually killed to calculate the heart-body index.ResultsAt week 4 after operation，compared with heart failure group，the nitroxyl-treated group had a significant decline in NT-proBNP，LVEDP［（385.65±43.50）pg/ml vs（496.13±52.80）pg/ml，P＜0.01，（17.49±2.04）mm Hg vs（21.19±1.91）mm Hg，P＜0.05］，and a significant increase in LVEF，LVFS，+dp/dt，-dp/dt［（52.88±5.46）%vs（39.71±3.64）%，P＜0.01，（23.75±3.11）%vs（16.57±1.72）%，P＜0.01，（3029.13±634.12）mm Hg/s vs（2347.43±451.38）mm Hg/s，P＜0.05，（2896.50±642.66）mm Hg/s vs（2169.29±433.17）mm Hg/s，P＜0.05］，the difference in HW/BW、LVEDd，LVSP between the two groups were not significant［（2.97±0.17）g/kg vs（2.98±0.16）g/kg，（7.19±0.87）mm vs（7.66±0.84）mm，（131.38±9.47）mm Hg vs（130.57±11.46）mm Hg，P＞0.05］.ConclusionNitroxyl is able to enhance the cardiac function of the rats having heart failure，improve the hemodynamics，reduce the level of NTProBNP in peripheral blood，exert a protective effect on the heart of rats having heart failure.

Heart failure； Nitroxyl； Pressure transducer； Hemodynamics

山西省衛(wèi)生計生委科研課題（項目編號：2015070）

030001 山西省太原市，山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院通訊作者：王敬萍，E-mail：525722439@qq.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2017．01．024

Q95-33；R541.6

A

1672-5301（2017）01-0086-04