谷氨酰胺治療心肌缺血再灌注損傷的效果與機制分析

潘澤意 徐燕燕 徐曉艷 羅向紅

谷氨酰胺治療心肌缺血再灌注損傷的效果與機制分析

潘澤意 徐燕燕 徐曉艷 羅向紅

目的 探討谷氨酰胺治療心肌缺血再灌注損傷的效果與機制。方法 研究時間為2015年2～10月。選擇清潔級SPF大鼠48只，隨機分為假手術組、缺血再灌注組和谷氨酰胺組，每組16只。建立心肌缺血再灌注損傷后，谷氨酰胺組給予腹腔注射谷氨酰胺治療。觀察三組大鼠心功能及炎癥因子的表達變化情況。結(jié)果 缺血再灌注組和谷氨酰胺組都順利建立心肌缺血再灌注損傷模型，表現(xiàn)為抬高的ST段逐步恢復，MAP逐步恢復，左心室顏色轉(zhuǎn)紅；同時心功能無明顯變化，提示谷氨酰胺對心臟無明顯毒性。三組心率（HR）在缺血前無明顯差異，但缺血再灌注組再灌注后有下降趨勢，而再灌注30 min后谷氨酰胺組HR較缺血再灌注組升高（P＜0.05）。假手術組給藥前后MAP無明顯變化，缺血再灌注組及谷氨酰胺組在給藥后出現(xiàn)輕度下降，但未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。谷氨酰胺組再灌30min的TNF-α和IL-6含量［（234.22±74.91）μg/ml和（33.45±19.11）μg/ml］均明顯低于缺血再灌注組［（400.33±56.09）μg/ml和（67.29±12.22）μg/ml］（P＜0.05）；與假手術組比較未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結(jié)論 谷氨酰胺可以對抗缺血再灌注損傷引起的心肌損傷，發(fā)揮心臟保護作用，其機制可能與抑制炎癥反應有關。

谷氨酰胺； 心肌缺血再灌注損傷； 炎癥因子； 心臟保護作用

當前心血管疾病特別是心肌梗死在臨床上越來越多，溶栓及經(jīng)皮冠狀動脈介入治療可有效恢復缺血心肌的血流灌注，但是也容易出現(xiàn)心肌缺血再灌注損傷，導致心肌舒縮功能障礙、代謝異常、心律失常等，直接影響患者的預后[1,2]。心肌缺血再灌注誘發(fā)肺損傷的詳細機制目前尚未完全闡明，其中自由基導致大量細胞因子的產(chǎn)生和各種信號通路的激活，在心肌缺血再灌注引起的早期心肌損傷發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[3,4]。谷氨酰胺是人體內(nèi)一種重要的游離氨基酸，在維持機體酸堿平衡、調(diào)節(jié)機體免疫功能等方面發(fā)揮重要作用。文獻報道，谷氨酰胺能夠通過增加腸道內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性降低腸道缺血再灌注損傷，也能改善氧化還原狀態(tài)，從而降低肝臟缺血再灌注損傷[5,6]。相關研究證實，谷氨酰胺對缺血再灌注心肌具有保護作用，能改善心肌能量代謝，因而適合作為心肌細胞的保護劑用于缺血性心血管疾病的急救[7,8]。本研究通過動物模型分析谷氨酰胺治療心肌缺血再灌注損傷的效果與機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 研究時間為2015年2～10月。動物實驗得到動物倫理和福利委員會批準，所有操作均按照《實驗動物管理條例（1996）》的相關規(guī)定進行。選擇清潔級SPF大鼠48只（上海斯萊克實驗動物公司提供，動物合格證號 NCDWNO：2012-0015），體質(zhì)量150～220 g，雌雄各24只。將大鼠分籠飼養(yǎng)于清潔的籠具中，室溫25℃左右，自由進食和飲水，相對濕度60%左右。由我院動物中心給予標準化普通飼料，每2 d更換3次墊料和籠子。

1.2 實驗方法 將48只大鼠隨機分為3組，假手術組（NC group）、缺血再灌注組（IR group）和谷氨酰胺組（Glu group），每組16只。建立心肌缺血再灌注損傷模型：將大鼠用25%烏拉糖（1 g/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術臺上，監(jiān)測生命體征。所有手術器械都經(jīng)過滅菌處理。碘伏消毒頸胸部，剪除大鼠頸部及胸部被毛，縱行剪開頸部皮膚1.5～2.0 cm，鈍性分離皮下組織及肌肉，在氣管旁、胸鎖乳突肌前緣分離出右側(cè)頸動脈，結(jié)扎動脈遠心端，記錄收縮壓（SBP）及舒張壓（DBP）。提起氣管后縫合線，行氣管插管，根據(jù)大鼠表現(xiàn)調(diào)節(jié)呼吸機的呼吸頻率、呼吸比及潮氣量。在胸骨左緣3 mm處縱向剪開胸部皮膚約4 cm，暴露肋骨及肋間肌。貼胸壁撐開肋間隙，縱向夾閉、松開肋骨后剪斷第2、3、4根肋骨，剪開心包，暴露心臟。從左心耳下緣1 mm處水平進針，經(jīng)LAD下，于肺動脈圓錐旁出針，形成一個活結(jié)，水平拉緊，造成心肌缺血；然后放松活結(jié)使心肌恢復灌注，執(zhí)行心肌缺血30min再灌注2 h程序。谷氨酰胺組大鼠麻醉后，經(jīng)腹腔注射藥物（谷氨酰胺原濃度0.2 g/ml，使用時5倍體積稀釋至0.04 g/ml），觀察并記錄心電圖及血壓變化，30 min后進行開胸手術，也執(zhí)行心肌缺血30 min再灌注2 h程序。

1.3 觀察指標 ①建模成功情況：心肌缺血標志為ST段進行性抬高或降低，平均動脈壓（MAP）下降或升高，左心室發(fā)紺。心肌缺血再灌注損傷標志為抬高的ST段逐步恢復，MAP逐步恢復，左心室顏色轉(zhuǎn)紅。②心率和平均動脈壓測定：在給藥前、給藥5min、再灌30 min，用生物機能實驗系統(tǒng)記錄與計算HR及MAP值的變化。④流出液炎癥因子的檢測：在大鼠再灌30 min收集冠脈流出液，全自動生化分析儀檢測流出液中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細胞介素（IL）-6含量，按試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 14.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料用±s表示，兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)數(shù)據(jù)采用百分比表示，對比采用卡方分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 建模情況 經(jīng)過觀察，缺血再灌注組和谷氨酰胺組都順利建立心肌缺血再灌注損傷模型，表現(xiàn)為抬高的ST段逐步恢復，MAP逐步恢復，左心室顏色轉(zhuǎn)紅，同時心功能無明顯變化，提示谷氨酰胺對心臟無明顯毒性。

2.2 心率變化情況對比 三組HR在缺血前無明顯差異，但缺血再灌注組再灌注后有下降趨勢，而再灌注30 min后谷氨酰胺組HR較缺血再灌注組升高（P＜0.05）。見表1。

2.3 平均動脈壓變化情況對比 假手術組給藥前后MAP無明顯變化，缺血再灌注組與谷氨酰胺組在給藥后出現(xiàn)輕度下降，但未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表2。

表1 三組離體心臟HR比較（±s）

表1 三組離體心臟HR比較（±s）

注：HR：心率。與缺血再灌注組對比，aP＜0.05

組別 例數(shù)假手術組 16 448.53±34.20 441.98±22.87 445.20±24.89缺血再灌注組 16 449.09±22.14 345.11±31.45 334.98±33.22谷氨酰胺組 16 447.87±31.78 351.20±26.11 431.89±21.42aHR（次/min）給藥前 給藥5min 再灌30min

表2 三組離體心臟MAP比較（±s）

表2 三組離體心臟MAP比較（±s）

注：MAP：平均動脈壓。1mm Hg=0.133 kPa

組別 例數(shù)假手術組 16 126.34±5.87 123.98±9.10 119.87±4.24缺血再灌注組 16 123.13±7.13 114.20±9.42 116.30±7.46谷氨酰胺組 16 124.98±6.34 121.89±10.87 120.87±7.11 MAP（mm Hg）給藥前 給藥5min 再灌30min

2.4 流出液炎癥因子含量比較 經(jīng)過檢測，谷氨酰胺組再灌 30 min時 TNF-α和 IL-6含量［（234.22±74.91）μg/ml和（33.45±19.11）μg/ml］均明顯低于缺血再灌注組［（400.33±56.09）μg/m l和（67.29±12.22）μg/ml］（P＜0.05），而與假手術組比較未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05），見表3。

表3 三組流出液炎癥因子的比較（±s）

表3 三組流出液炎癥因子的比較（±s）

注：TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白細胞介素-6。與缺血再灌注組對比，aP＜0.05

組別 例數(shù) TNF-α（μg/m l） IL-6（μg/ml）假手術組 16 210.35±56.12 34.12±16.93缺血再灌注組 16 400.33±56.09 67.29±12.22谷氨酰胺組 16 234.22±74.91a 33.45±19.11a

3 討論

當前我國的心肌梗死發(fā)病率不斷升高，且發(fā)病年齡有年輕化的趨勢。心肌梗死發(fā)生的病理基礎是冠狀動脈的部分或完全阻塞造成心肌的缺血缺氧。隨著溶栓療法、動脈搭橋術等方法的建立和推廣，明顯減輕了細胞缺血性損傷，心肌組織重新獲得血液供應，但是也帶來了一定的再灌注損傷，直接影響患者的預后[9,10]。

心肌缺血再灌注損傷是指缺血心肌在恢復血液再灌注后，功能代謝障礙及結(jié)構破壞反而加重的現(xiàn)象，主要機制為自由基增多、微血管損傷、細胞內(nèi)鈣超載等[11]。當前研究顯示，一些能夠減輕氧化應激的治療方法均能不同程度地改善心肌缺血患者的預后，提示心肌缺血疾病的發(fā)生和進展與心肌氧化應激的變化相關。在重癥疾病中，氧化應激狀態(tài)是由于活性氧的增加與天然抗氧化物質(zhì)產(chǎn)生減少的平衡失調(diào)而引起[12]。谷氨酰胺作為谷胱甘肽的前體之一，在心肌缺血再灌注心肌和組織中均有明顯下降，提示谷氨酰胺可能具有重要的保護性作用[13]。谷氨酰胺可通過保持和增加組織細胞內(nèi)還原型谷胱苷肽的儲備，有助于受損細胞的修復和功能恢復，從而保護和減輕細胞免受氧自由基介導的損傷，提高機體抗氧化能力[14,15]。本研究顯示，三組HR在缺血前無明顯差異，但缺血再灌注組再灌注后有下降趨勢，而再灌注30 min后谷氨酰胺組HR較缺血再灌注組升高（P＜0.05），表明谷氨酰胺能夠明顯改善缺血再灌注損傷所導致的心功能降低，發(fā)揮心臟保護作用。

谷氨酰胺作為“條件必需氨基酸”，在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要的輔助作用。谷氨酰胺可通過減少氧自由基生成，維護心肌細胞能量和離子穩(wěn)態(tài)，抑制心肌細胞膜脂質(zhì)過氧化進而維持正常心肌電活動[16]。已有研究表明，谷氨酰胺能夠抑制燒傷所致心功能下降，能顯著升高失血后平均動脈壓，而谷氨酰胺對缺血再灌注所損傷心肌是否具有保護作用還未見報道[17]。本研究顯示，假手術組給藥前后MAP無明顯變化，缺血再灌注組和谷氨酰胺組在給藥后MAP出現(xiàn)輕度下降，但未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05），不過谷氨酰胺組則呈現(xiàn)穩(wěn)健的回復趨勢，體現(xiàn)出更好的保護作用。

心肌缺血再灌注損傷是一種全身系統(tǒng)炎性疾病的肺部表現(xiàn)，其發(fā)生機制目前尚不明確。諸多因素可激活一系列不同的炎癥細胞，可觸發(fā)失控性或過度的炎性反應，并進一步激發(fā)其他炎癥細胞，釋放大量炎癥細胞因子，明顯放大機體損傷信號，出現(xiàn)炎癥瀑布效應，最后出現(xiàn)器官嚴重損傷。研究顯示，心肌缺血再灌注后最早激活的是巨噬細胞，激活的巨噬細胞釋放一系列前炎性因子，如TNF-α和IL-6等[18]。有研究表明，谷氨酰胺和丙氨酰谷氨酰胺能夠誘導炎癥組織內(nèi)谷胱甘肽的累積，從而減輕炎癥反應并促進組織恢復[19]。本研究顯示，谷氨酰胺組再灌30 min的TNF-α和IL-6含量均明顯低于缺血再灌注組（P＜0.05），而與假手術組比較均未見統(tǒng)計學差異（P＞0.05），主要在于谷氨酰胺可以增強心肌對非應激性手術過程帶來的損傷的耐受性，進而能減輕炎癥反應。

總之，谷氨酰胺可以對抗缺血再灌注損傷引起的心肌損傷，發(fā)揮心臟保護作用，其機制可能與抑制炎癥反應有關。

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The effects and mechanism of glutam ine in the treatment ofm yocardial ischem ia reperfusion injury

PAN Ze-yi＊，XU Yan-yan，XU Xiao-yan，et al.＊Department of Surgery，Guangshui Second People′s Hospital of Hubei，Guangshui 432721，China

ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of glutamine in the treatment of myocardial ischemia and reperfusion injury.MethodsThe study time were from February 2015 to October 2015，48 SPF clean grade Rats were completely randomized the NC group（n=16），IR group（n=16）and Glu group（n=16）.After were establishment of myocardial ischemia and reperfusion injury，the Glu group were

intraperitoneal injection of glutamyl amine treatment.The expression changes of the three groups of cardiac function and inflammatory factors were observed.ResultsThe myocardial ischemia reperfusion injury models were successfully established in the IR group and Glu group.There were no significant difference in HR compared among the three groups before and after ischemia，but the IR group were showed decreasing trend after reperfusion，and the HR in the Glu group were higher than that in the IR group after reperfusion in reperfusion 30 min（P＜0.05）.There were no significant change in MAP before and after administration compared among the three groups，and there were a slight decrease in the IR group and Glu group after administration，but there were no significant difference compared between the groups（P＞0.05）.The TNF-αand IL-6 levels in the reperfusion 30 min in the Glu group［（234.22±74.91）μg/ml and（33.45±19.11）μg/ml］were significantly lower than that in IR group［（400.33±56.09）μg/ml and（67.29± 12.22）μg/ml］（P＜0.05），but there was no significant difference compared between the Glu group and the NC group（P＞0.05）.ConclusionGlutamine can protect againstmyocardial injury induced by ischemia and reperfusion injury，and itsmechanism may be related to the inhibition of inflammatory reaction.

Glutamine； Myocardial ischemia reperfusion injury； Inflammatory factors； Heart protectio

2014年湖北教育廳課題（項目編號：B2014045）

432721 湖北省廣水市，廣水市第二人民醫(yī)院外科（潘澤意），內(nèi)科（徐燕燕）；武漢科技大學臨床學院內(nèi)科（徐曉艷）；湖北醫(yī)藥學院（羅向紅）

10．3969/j．issn．1672－5301．2017．01．025

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2017）01-0089-05