口蹄疫病毒L、2B基因siRNA重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建

賈俊濤++郭鳳英++烏倫吉如嘎++張小宇++陳金頂

摘要：根據(jù)siRNA設(shè)計原則，分別選擇O型FMDV的L和2B基因上保守序列作為可能的干擾位點，設(shè)計了2個siRNAs，并將siRNAs克隆到pSIREN-Shuttle中，獲得2個siRNA重組表達載體pShuttle-L和pShuttle-2B。用限制性內(nèi)切酶I-Ceu I和PI-Sce I雙酶切siRNA重組表達載體和腺病毒質(zhì)粒載體pAdeno-X，利用體外連接法獲得了重組質(zhì)粒。經(jīng)PCR擴增、酶切鑒定及序列測定，成功構(gòu)建了重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-L和pAdeno-2B。

關(guān)鍵詞：口蹄疫病毒；RNA干擾；重組腺病毒質(zhì)粒

中圖分類號：S852.65+9.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）16-3152-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.16.039

Construction of Recombinant Adenovirus Plasmid Containing the L and 2B Gene siRNAs of Foot-and-Mouth Disease Virus

JIA Jun-tao1，GUO Feng-ying1，Wulunjiruga1，ZHANG Xiao-yu1，CHEN Jin-ding2

（1.Vocational and Technical College of Inner Mongolia Agricuitural University， Baotou 014109， Inner Mongolia， China；

2.South China Agricultural University，Guangzhou 510640，China）

Abstract： In this study， the conservative sequence in L and 2B gene of O type FMDV were chose as possible interference sites. Two siRNAs were designed and synthesized. These siRNAs were cloned into the plasmid pSIREN-Shuttle， then the siRNAs recombined expression vectors were obtained including pShuttle-L and pShuttle-2B. The vectors and the adenovirus vector pAdeno-X were digested with restriction endonuclease I-Ceu I and PI-Sce I and connected in vitro， then recombinant plasmids were obtained. The result of PCR， enzyme-cutting and sequencing suggested that the recombined adenovirus plasmids pAdeno-L and pAdeno-2B were constructed successfully.

Key words： Foot-and-mouth disease virus（FMDV）； RNA interference（RNAi）； recombinant adenovirus plasmid

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄類動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]。它不僅可使動物生產(chǎn)性能下降，而且還限制動物及動物產(chǎn)品的國際貿(mào)易，有“政治經(jīng)濟病”之稱，被OIE列為烈性傳染病之首[2]。由于FMDV感染率高、傳染性強、患病動物排毒量大，可使爆發(fā)地區(qū)遭受巨大經(jīng)濟損失，因此該病是世界各國檢疫和防疫的重點對象。目前，采用免疫接種與撲殺相結(jié)合，再輔以封殺、隔離、消毒、抗體檢測等綜合措施，但仍不能控制FMDV的感染與傳播，這就迫使人們尋求更加有效的防控方法。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一項可以在體外有效抑制病毒復(fù)制的技術(shù)，其是由與靶基因序列同源的dsRNA引發(fā)廣泛存在于動植物中的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程[3]。腺病毒載體因具有感染細胞種類多、感染效率高、外源基因表達水平高，且既適于體外又適于體內(nèi)研究等特點而被作為轉(zhuǎn)基因載體[4]。本研究構(gòu)建了攜帶有O型FMDV L、2B基因siRNA片段的重組腺病毒質(zhì)粒，為研究腺病毒介導(dǎo)的RNAi抑制FMDV增殖的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、質(zhì)粒和菌株 FMDV O/HKN/2003由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物實驗室保存。E1、E3區(qū)缺失的腺病毒質(zhì)粒載體pAdeno-X、穿梭質(zhì)粒pSIREN-shuttle由廣州醫(yī)學(xué)院李彬教授惠贈。大腸桿菌DH5α購自廣州合達生物技術(shù)公司。

1.1.2 主要試劑 歸位內(nèi)切酶I-Ceu Ⅰ、PI-Sce Ⅰ購自NEB公司。去內(nèi)毒素質(zhì)粒小量抽提試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品；DNA轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000為Invitrogen產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)腺病毒質(zhì)粒pAdeno-X序列和歸位內(nèi)切酶I-Ceu Ⅰ、PI-Sce Ⅰ的識別序列，設(shè)計下列引物：P1：5′-CGGGAAAACTGAATAAGACG-3′；P2：5′-CATCAAACGAGTTGGTGCT-3′，引物由北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成。endprint

1.2.2 siRNA表達質(zhì)粒的獲得 根據(jù)siRNA的設(shè)計原則[5]，以GenBank中O型FMDV基因組核苷酸序列以及現(xiàn)有的FMDV株O/HKN/2003的序列測定結(jié)果，選擇非結(jié)構(gòu)蛋白L、2B基因保守序列作為可能的干擾位點，設(shè)計了含有siRNA序列的寡核苷酸片段，命名為siRNA-L、siRNA-2B。將siRNA寡核苷酸片段克隆到pSIREN-Shuttle中，經(jīng)過鑒定獲得陽性克隆。

1.2.3 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒載體的獲得 提取鑒定正確的重組質(zhì)粒及腺病毒質(zhì)粒載體pAdeno-X分別進行I-Ceu Ⅰ、PI-Sce Ⅰ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，連接回收產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。以P1、P2為引物進行菌落PCR，篩選陽性克隆。PCR條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸 1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。同時采用質(zhì)粒PCR、Pac Ⅰ酶切及測序鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落PCR鑒定

在轉(zhuǎn)化的平板上各選取5個菌落進行菌落PCR來初步篩選陽性克隆，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，分別有4個菌落擴增出大小為600 bp左右的電泳條帶，其大小與預(yù)期相符（圖1、圖2）。

2.2 重組腺病毒質(zhì)粒載體PCR鑒定

菌落PCR篩選后，以質(zhì)粒為模板，進行質(zhì)粒PCR鑒定，擴增出大小約600 bp的電泳條帶，其大小與預(yù)期相符（圖3），進一步證實陽性重組子的可能性。

2.3 重組腺病毒質(zhì)粒載體的酶切鑒定

將可能的陽性重組子用Pac Ⅰ酶切后出現(xiàn)兩條亮帶，一條在3 000 bp左右，另一條在30 kb左右，與預(yù)期相符（圖4）。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 重組質(zhì)粒載體的序列測定

將質(zhì)粒PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒載體pAdeno-L、pAdeno-2B進行序列測定，結(jié)果與預(yù)期序列完全吻合（圖5、圖6）。

3 小結(jié)與討論

口蹄疫是目前危害世界養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病之一。FMDV滅活疫苗防治是目前防治該病的重要手段之一，但這種預(yù)防措施只能給動物提供短期保護，而且存在病毒逃逸和病毒滅活不徹底的潛在危險。迅速發(fā)展的RNAi技術(shù)已經(jīng)使其成為一種功能強大的研究動物特定基因表達和功能的工具[3]。已有報道表明，通過人工轉(zhuǎn)染siRNA能夠有效地誘發(fā)RNAi抵抗病毒的感染[6]。由于RNAi技術(shù)的快速性和特異性，可以彌補目前已有的病毒防御手段的不足?？谔阋卟《镜幕蚪M是一條單鏈RNA，其既作為信使RNA又作為復(fù)制模板行使功能，因此口蹄疫是利用RNA干擾技術(shù)防制的理想對象。

本研究選擇了FMDV L、2B基因保守序列作為可能的干擾位點，并設(shè)計了含有相應(yīng)siRNA序列的寡核苷酸片段。FMDV基因組為單股正鏈RNA，其基因組RNA具有mRNA性質(zhì)。L、2B基因?qū)儆贔MDV的非結(jié)構(gòu)蛋白基因。在FMDV的復(fù)制過程中，Lpro可特異性地降解宿主翻譯起始因子eIF-4G，導(dǎo)致宿主依賴cap的mRNA翻譯關(guān)閉[7，8]。Lpro對宿主蛋白質(zhì)合成具有抑制作用，因此認為是FMDV的毒力因子。2B基因編碼的2B蛋白具有輔助病毒誘導(dǎo)細胞病變作用，現(xiàn)已表明2B蛋白能增強膜的通透性和阻斷蛋白分泌途徑。FMDV的L和2B基因在病毒復(fù)制周期中發(fā)揮重要作用，因此，如果L、2B基因的表達被抑制，就會抑制病毒的增殖。

RNAi表達載體有質(zhì)粒載體[9]和病毒載體[10，11]，其中病毒載體克服了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞效率低的缺點，并可體內(nèi)應(yīng)用，實現(xiàn)長時間的靶基因沉默，具有臨床應(yīng)用前景等優(yōu)勢。腺病毒是目前轉(zhuǎn)基因效率最高的載體之一，被廣泛用于基因治療、基因功能性研究等領(lǐng)域。目前用于基因治療的腺病毒載體多為復(fù)制缺陷型載體，即缺失了腺病毒基因組中某些復(fù)制增殖所必需的基因，這部分基因的功能由輔助細胞或病毒提供。本研究采用復(fù)制缺陷型腺病毒載體，使用體外連接的方法成功構(gòu)建了重組腺病毒質(zhì)粒pAdeno-L和pAdeno-2B，為研究腺病毒介導(dǎo)的RNAi抑制FMDV增殖的作用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] BROWN F. The history of research in foot-and-mouth disease virus[J].Virus Research，2003，91：3-7.

[2] SOBRINO F，S IZ M，JIM NEZ-CLAVERO M A，at al. Foot-and-mouth disease virus：A long known virus，but a current threat[J].Vet Res，2001，32（1）：1-30.

[3] FAMULOK M，VERMA S. In vivo-applied funcationl RNAs as tools in proteomics and genomics research[J].Trends Biotechnol，2002，20：462-466.

[4] MCCONNELL M J，IMPERIALE M J. Biology of adenovirus and its use as a vector for gene therapy[J].Hum Gene Ther，2004，15：1022-1033.

[5] TUSHL T. Expanding small RNA interference[J].Nat Biotechnol，2002，20（5）：446-468.

[6] DING S W. RNA silencing：A conserved antiviral immunity of plants and animals[J].Virus Res，2004，102：109-115.

[7] DEVNAYE M A，VAKHARIA V N，LLOYD R E，et al. Leader portein of foot-and-mouth disease virus is required for cleavage of the p220 component of the cap-binding protein complex[J].J Virol，1988，62：4407-4409.

[8] MEDINA M，DOMINGO E，BRNAGYN J K，et al. The two species of the foot-and-mouth disease viurs leader protein，expressed individually，exhibit the same activities[J].J Virol，1993， 194：355-359.

[9] BRUMMELKAMP T R，BERNARDS R，AGAMI R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells[J]. Science，2002，296：550-553.

[10] SCHOMBER T，KALBERER P C，WODNAR-FILIPOWICZ A，et al. Gene silencing by lentivirus-mediated delivery of siRNA in human CD34+ cells[J].Blood，2004，103（12）：4511-4513.

[11] UPRICHARD S L，BOYD B，ALTHAGE A，et al. Clearance of hepatitis B virus from the liver of transgenic mice by short hairpin RNAs[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（3）：773-778.endprint