正交試驗(yàn)法優(yōu)化甲醇提取艾蒿中槲皮素工藝條件

沙芮++陳靜++丁潔++牛犇++宋勇強(qiáng)++梁寧

摘要：以艾蒿為原料，槲皮素含量為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化甲醇提取艾蒿中槲皮素的工藝。結(jié)果表明，甲醇提取艾蒿中槲皮素最佳提取工藝為料液比1∶16（g/mL），甲醇體積分?jǐn)?shù)100%，浸泡時(shí)間2 h，超聲時(shí)間30 min。按優(yōu)選工藝條件下槲皮素含量為0.698 mg/g，驗(yàn)證試驗(yàn)證明結(jié)果穩(wěn)定，具有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：正交試驗(yàn)；艾蒿；槲皮素；甲醇

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）16-3133-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.16.034

Study on Orthogonal Test Optimization of Methanol Extraction of Quercetin from Artemisia argyi Process Conditions

SHA Rui，CHEN Jin，DING Jie，NIU Ben，SONG Yong-qiang，Liang Ning

（Commercial Technology Institute of Gansu Province，Lanzhou 730020， China）

Abstract： Artemisiaargyi was treated the raw material with methanolto extract quercetinand the yield of quercetinwas used to be an indicator. On the basis of single-factor experiments，the orthogonal experiment method were carried out to optimize the extraction process ofquercetin. The results showed that the optimal extraction parameters were found as follows：mass fraction of methanol 100%；material-to-liquid 1∶16 g/mL；soak time 4 h；ultraphonic time 30 min. According to the optimal process conditions the yield ofquercetin was 0.698%.It could be well fitted with model and was reliable and applicable for actual prediction.It had value of production.

Key words： the orthogonal experiment method； Artemisia argyi； quercetin； methanol

艾蒿（Artemisia argyi Levt. et Vant）為菊科（Compositae）艾屬（Artemisia）多年生草本植物，主要分布于亞洲東部，如朝鮮半島、日本、蒙古，中國東北、華北、華東、華南、西南、陜西及甘肅等地均有分布。其適應(yīng)性強(qiáng)，普遍生長于路旁荒野、草地[1]。尤其以西北寒旱地區(qū)生長的有效成分高，品質(zhì)優(yōu)良藥用價(jià)值高[2]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3-7]，艾蒿中的化學(xué)成分主要有黃酮、三萜、揮發(fā)油類，黃酮中含有槲皮素和柚皮素成分，槲皮素除有抗菌、消炎、抗癌、抗氧化、心血管系統(tǒng)保護(hù)作用外[8]，槲皮素聯(lián)合放射線有顯著減少瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的膠原合成作用，槲皮素對(duì)皮膚具有保護(hù)作用。但目前對(duì)艾蒿中槲皮素定量的分析研究鮮見。槲皮素含量測(cè)定方法主要有高效液相色譜法、紫外分光光度法、薄層色譜法等。雖然高效液相色譜法檢測(cè)限低、靈敏度高，但該方法檢測(cè)設(shè)備成本高、耗時(shí)、操作步驟繁雜。而紫外分光光度法具有操作簡(jiǎn)便、成本低等特點(diǎn)。本研究采用紫外分光光度法艾蒿中槲皮素進(jìn)行含量測(cè)定，為艾蒿黃酮類化合物定量分析提供一種簡(jiǎn)便、有效的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 艾葉產(chǎn)地河北，購自蘭州黃河藥材市場(chǎng)，經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院生藥室馬志剛教授鑒定；甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號(hào)164782）；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（ChromaDex，美國，批號(hào)00017030-566）；純水（自制，pH 6.82，電導(dǎo)率15 μs/cm（27 ℃））。

1.1.2 儀器 UV2300Ⅱ型雙光束紫外可見光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XS225A型電子分析天平（普利塞斯公司，瑞士）；優(yōu)普UPT-I-20L落地式純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備[9] 精密稱量槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品5.13 mg，用5 mL甲醇溶液溶解，定容于5 mL容量瓶，得到濃度為1.026 0 mg/mL槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL定容于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液定容至10 mL，配置成標(biāo)準(zhǔn)溶液。在300～600 nm范圍內(nèi)掃描，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液在370 nm處有最大吸收峰，和陳志剛等[10]測(cè)定的槲皮素最大吸收波長374 nm基本相同，以吸光度對(duì)質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度成良好線性關(guān)系。線性回歸方程為y=7.617x-0.014，R2=0.991。槲皮素在0.015 5～0.094 4 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。endprint

1.2.2 槲皮素提取 稱取5 g艾蒿，剪碎，放入250 mL三角瓶中，加入一定質(zhì)量甲醇，浸泡，超聲，過濾，計(jì)算艾蒿中槲皮素得率。

1.2.3 艾蒿提取槲皮素單因素試驗(yàn)[11] 固定艾蒿甲醇料液比（g/mL，下同）1∶12，甲醇體積分?jǐn)?shù)80%、浸泡2 h、設(shè)定超聲波功率100 W提取時(shí)間15 min的情況下，改變其中1個(gè)因素，料液比1∶12、1∶16、1∶20、 1∶24、1∶28；甲醇濃度60%、70%、80%、90%、100%；浸泡時(shí)間1、2、3、4、5、6 h；超聲提取5、15、25、35、45 min，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以得率為指標(biāo)，擇優(yōu)參數(shù)。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用SPSS19.0軟件，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置水平，以料液比、甲醇體積分?jǐn)?shù)、浸泡時(shí)間、超聲時(shí)間4個(gè)因素的3個(gè)水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9（34）優(yōu)化艾蒿甲醇提取槲皮素工藝（表1）。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（M±SE）表示，對(duì)各組結(jié)果采用統(tǒng)計(jì)學(xué)Duncan檢驗(yàn)比較差異，以不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1 料液比對(duì)槲皮素含量的影響 由圖1可知，隨著溶劑的增加槲皮素得率增加，差異顯著。試驗(yàn)對(duì)比顯示，料液比>1∶6時(shí)，甲醇剛剛浸沒艾蒿，甲醇量過少對(duì)槲皮素的含量有影響。當(dāng)料液比從1∶12降至1∶16，槲皮素得率大幅提高，說明甲醇量增加可以更好地析出槲皮素。當(dāng)甲醇量繼續(xù)增加，槲皮素得率變化不大，料液比低于1∶20后得率基本不變，說明溶劑量增大到一定程度，析出速率達(dá)到平衡。因此選擇1∶12～1∶20為料液比的正交試驗(yàn)因素水平。

2.1.2 甲醇濃度對(duì)槲皮素得率的影響 由圖2可知，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)提高槲皮素得率增加，差異顯著。試驗(yàn)對(duì)比顯示，甲醇體積分?jǐn)?shù)﹤80%時(shí)，水中易浸出其他易溶于水的黃酮類物質(zhì)，可能對(duì)槲皮素這種易溶于醇的極性較小苷元的浸出有影響。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)>80%后，槲皮素得率基本不變，說明甲醇體積分?jǐn)?shù)越大水的影響因素越小，溶解速率達(dá)到平衡。因此選擇80%～100%為甲醇體積分?jǐn)?shù)的正交試驗(yàn)因素水平。

2.1.3 浸泡時(shí)間對(duì)槲皮素得率影響 由圖3可知，槲皮素得率隨著浸泡時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)，浸泡時(shí)間<3 h時(shí)，差異顯著。浸泡超過3 h后提取率基本不變。由此可知通過浸泡有利于槲皮素浸出，但浸泡時(shí)間使槲皮素浸出能力有限，浸泡時(shí)間>3 h時(shí)，通過浸泡的溶解物質(zhì)達(dá)到飽和，不再浸出。綜合試驗(yàn)效率因素，選擇時(shí)間2～6 h為浸泡時(shí)間的正交試驗(yàn)因素水平。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)槲皮素得率的影響 由圖4可知，隨著超聲時(shí)間延長，槲皮素得率呈上升趨勢(shì)，在15～35 min內(nèi)槲皮素得率增加較快，且差異顯著，超過35 min槲皮素得率基本不變，說明35 min左右槲皮素浸出達(dá)到平衡。隨著超聲時(shí)間加長，溫度增高，槲皮素苷元浸出達(dá)到平衡，所以槲皮素得率基本不變。因此選擇15～45 min為超聲時(shí)間的正交試驗(yàn)因素水平。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇4個(gè)影響因素的3個(gè)水平設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)L9（34）優(yōu)化艾蒿槲皮素甲醇提取工藝（表1）。

由表2、表3可知，艾蒿槲皮素甲醇提取的影響因素中，甲醇體積分?jǐn)?shù)影響極顯著，料液比、超聲時(shí)間影響不顯著。由表2可知，最佳提取條件為A2B3C1D2；而極差分析結(jié)果中得出的最佳工藝方案是A2B3C2D3，二者不一致，通過驗(yàn)證試驗(yàn)比較，即料液比1∶16，甲醇體積分?jǐn)?shù)100%，浸泡時(shí)間4 h，超聲時(shí)間45 min條件下進(jìn)行提取，計(jì)算槲皮素含量，重復(fù)6次，含量為0.665%，RSD=1.86%（n=6）。由此可知，在極差分析結(jié)果中得出的最佳提取條件和表2中得出的最佳提取條件提取率差異不大，綜合成本因素，得出最佳提取條件為A2B3C1D2，即料液比1∶16，甲醇體積分?jǐn)?shù)100%，浸泡時(shí)間2 h，超聲時(shí)間30 min。

3 小結(jié)與討論

1）槲皮素作為一種多羥基黃酮類化合物[12-18]具有多種生物學(xué)活性及很高的藥用價(jià)值，槲皮素除了抗氧化清除自由基、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒之外，近年來研究還發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用，抗抑郁作用，而且槲皮素聯(lián)合放射線顯著減少體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩治療藥物，與放療聯(lián)合作用，可減少放療劑量，減輕放療對(duì)正常皮膚的損害。而且槲皮素廣泛存在于植物的花、果實(shí)中，目前已知有100多種中草藥中含有槲皮素。而且艾蒿分布廣泛，成活率高，成本低，可作為理想提取槲皮素植物。

2）槲皮素提取一般選用乙醇，甲醇或混合提取[19]，根據(jù)之前的提取研究，高體積分?jǐn)?shù)的甲醇比乙醇對(duì)槲皮素的提取率高，所以本次試驗(yàn)選用甲醇作為提取溶劑。

3）超聲提取利用超聲波破壞植物細(xì)胞和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[20]，增加細(xì)胞內(nèi)容物穿透力，有助于黃酮類化合物釋放與溶出，同時(shí)超聲波的熱效應(yīng)使得水溫基本在57 ℃左右，對(duì)原料也有水浴作用。對(duì)比回流提取，具有省時(shí)、高效、節(jié)能、提高原料利用率的優(yōu)點(diǎn)。

綜上所述，通過單因素和正交試驗(yàn)，確定艾蒿中甲醇提取槲皮素最佳工藝參數(shù)為料液比1∶16，甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%，浸泡時(shí)間2 h，超聲時(shí)間30 min。槲皮素含量達(dá)0.698 mg/g。艾蒿分布廣泛、成活率高、成本低，可作為理想提取槲皮素植物，為槲皮素的綜合利用提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 胡林峰，崔乘幸，吳玉博，等.艾蒿化學(xué)成分及其生物活性研究進(jìn)展[J].河南科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，38（4）：75-78.

[2] 丁 潔，牛 犇，高志瑩，等.HPLC測(cè)定艾蒿黃酮乳膏中槲皮素和柚皮素的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（16）：86-88.endprint

[3] 江蘇新醫(yī)學(xué)院編.中藥大詞典.上冊(cè)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1985.

[4] TAN R X，JIA Z J. Eudesmanolides and other constituents from Artemisia argyi[J].Plant Mediea，1992，58（4）：370-372.

[5] 王曉琴，周成江，張 娜.野艾蒿化學(xué)成分研究[J].中藥材，2011， 34（2）：234-236.

[6] 高 俊，王愛霞，牛 犇，等.艾蒿黃酮?jiǎng)游铮ù笫螅╅L期毒性實(shí)驗(yàn)[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，38（1）：39-44.

[7] 牛 犇，王愛霞，梁 寧，等.艾蒿黃酮對(duì)實(shí)驗(yàn)性痤瘡干預(yù)作用的初步觀察[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（17）：192-197.

[8] 孫 涓，余世春.槲皮素的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2011，25（3）：85-88.

[9] 張吉祥，歐來良.正交試驗(yàn)法優(yōu)化超聲提取棗核總黃酮[J].食品科學(xué)，2012，33（4）：18-21.

[10] 陳志剛，山光強(qiáng)，譚云琴，等.紫外分光光度法測(cè)定槲皮素含量方法的建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2016，37（1）：122-124.

[11] 丁 潔，王寧波，王愛霞，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)化酒石酸提取柑橘皮渣中水溶性膳食纖維的工藝條件[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，51（5）：137-140.

[12] 馬建勛，田宏偉，李安強(qiáng)，等.槲皮素誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的研究[J].中華腫瘤防治雜志，2008，15（23）：1792-1795.

[13] 趙麗婷，郭長江，蔡?hào)|聯(lián)，等.補(bǔ)充槲皮素對(duì)大鼠外周血抗氧化體系的影響[J].武警后勤學(xué)院學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2009，19（4）：269-270.

[14] 秦曉蓉，張銘金，高緒娜，等.槲皮素抗菌活性的研究[J].化學(xué)與生物工程，2009，26（4）：55-57.

[15] 朱 宇，王曉蓉，曲莉穎，等.中藥槲皮素對(duì)皮膚增色作用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[J].中國皮膚性病學(xué)雜志，2007，21（4）：242-244.

[16] KAMADA C，EDSON L，SILVA D，et al. Attenuation of lipid peroxidation and hyperlipidemia by quercetin glucosidein in the aorta of high cholesterol-fedrabbit[J].Free Radic Res，2005， 39（2）：185-194.

[17] AJAY M，ACHIKE F I，MUSTAFA A M，et al. Direct effects of quercetin on impaired reactivity of spontaneously hypertensive rat aortae comparative study with ascorbic acid[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2006，33（4）：345-350.

[18] 王莉娟，龔 濤，王 麗，等.槲皮素對(duì)香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞死亡的抑制效應(yīng)[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2009， 25（7）：960-963.

[19] 馮 濤.竹葉總黃酮提取及純化工藝的研究[D].天津：天津科技大學(xué)，2003.

[20] 李筱玲，鄧寒霜.黃酮類化合物提取分離方法研究進(jìn)展[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，61（1）：79-79.endprint