黑枸杞水提物對(duì)中波紫外線輻射后人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖與凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響研究

加楊娥，任立汆，燕華玲

·論著·

黑枸杞水提物對(duì)中波紫外線輻射后人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖與凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響研究

加楊娥，任立汆，燕華玲*

目的研究黑枸杞水提物對(duì)中波紫外線(UVB)輻射后人角質(zhì)形成(HaCaT)細(xì)胞增殖與凋亡及凋亡相關(guān)蛋白〔P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)、P53、半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、B細(xì)胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)〕表達(dá)水平的影響，以期探討黑枸杞水提物減輕UVB損傷HaCaT細(xì)胞的作用機(jī)制。方法2015年3月—2016年1月，提取黑枸杞水提物，體外培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(無(wú)輻射)、UVB組(30 mJ/cm2UVB輻射40 min)、黑枸杞水提物組(30 mJ/cm2UVB輻射40 min+黑枸杞水提物2 mg/ml)。采用MTS法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，Western blotting法檢測(cè)各組P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2表達(dá)水平。結(jié)果UVB組細(xì)胞增殖活力小于對(duì)照組(P<0.05)；黑枸杞水提物組細(xì)胞增殖活力小于對(duì)照組，大于UVB組(P<0.05)。UVB組細(xì)胞凋亡率大于對(duì)照組(P<0.05)；黑枸杞水提物組細(xì)胞凋亡率大于對(duì)照組，小于UVB組(P<0.05)。UVB組P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3表達(dá)水平高于對(duì)照組，Bcl-2表達(dá)水平低于對(duì)照組(P<0.05)；黑枸杞水提物組P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3表達(dá)水平低于UVB組，Bcl-2表達(dá)水平高于UVB組(P<0.05)。結(jié)論黑枸杞水提物可促進(jìn)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞的增殖，同時(shí)阻止其凋亡，其機(jī)制可能為黑枸杞水提物能夠下調(diào)P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3表達(dá)水平及上調(diào)Bcl-2表達(dá)水平，進(jìn)而減輕HaCaT 細(xì)胞的輻射損傷。

枸杞△；紫外線；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；P38絲裂原活化蛋白激酶；腫瘤抑制蛋白質(zhì)p53；半胱氨酸蛋白酶類(lèi)；B細(xì)胞淋巴瘤因子2

加楊娥，任立汆，燕華玲.黑枸杞水提物對(duì)中波紫外線輻射后人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖與凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響研究[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2017，20(27)：3400-3404.[www.chinagp.net]

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黑枸杞為茄科，枸杞屬，是近年來(lái)新發(fā)掘的多年生耐鹽、抗旱野生植物，主要分布于青海、新疆、寧夏等地。《維吾爾藥志》記載，黑枸杞可用于治療尿道結(jié)石、牙齦出血等[1]?！毒е楸静荨酚涊d，黑枸杞用于治療心熱病、心臟病、月經(jīng)不調(diào)、停經(jīng)等且藥效顯著，民間用于滋補(bǔ)強(qiáng)壯、降血壓[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，黑枸杞含有多種有效成分，包括原花青素、多糖、酚酸、黃酮、氨基酸及K、Na、Fe、Ca、Mg等無(wú)機(jī)元素成分，具有降血壓、降血脂、保護(hù)心血管、防治癌癥、提高免疫力、抗氧化、抗衰老、緩解眼睛疲勞等多種功能，是一種安全無(wú)毒的“藥食兩用”的資源[2]。已有研究證實(shí)，中波紫外線(UVB)可誘導(dǎo)人角質(zhì)形成(HaCaT)細(xì)胞凋亡，黑枸杞水提物能夠減輕UVB輻射后HaCaT細(xì)胞的氧化損傷[3]，但關(guān)于其對(duì)P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)、P53、半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、B細(xì)胞淋巴瘤因子2(Bcl-2)相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究通過(guò)觀察黑枸杞水提物對(duì)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞增殖與凋亡及P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2表達(dá)水平的影響，探討其減輕UVB輻射損傷的機(jī)制，以期為黑枸杞水提物減輕UVB損傷提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 黑枸杞干果購(gòu)自青海德令哈市壹葉香茶行；HaCaT細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；DMEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司；金屬硫蛋白混合體(MTS)購(gòu)自Promega公司；RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；十二烷基硫酸鈉-聚丙基酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒購(gòu)自Biosharp公司；一抗(抗P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2、β-actin抗體)購(gòu)自Abcam公司；二抗(山羊抗兔抗體)購(gòu)自Proteintech公司；發(fā)光液購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；BCA試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；Bio-Rad酶標(biāo)儀(X-Mark型)購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2 黑枸杞水提物的提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取黑枸杞干果100 g，加入蒸餾水500 ml，煮沸2 h，每15 min攪拌1次，過(guò)濾，濾渣中加入同樣的蒸餾水繼續(xù)煮沸，重復(fù)3次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，冷凍干燥獲得黑枸杞水提物粉末。以含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基為溶劑，配制成2 mg/ml的黑枸杞水提物溶液，用0.22 μm孔徑的過(guò)濾器過(guò)濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng) 向裝有HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入含有10% FBS和1%雙抗(鏈霉素和青霉素)的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃ 5% CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，按1∶3比例傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3～5代HaCaT細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 2015年3月—2016年1月，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、UVB組、黑枸杞水提物組，置于培養(yǎng)箱用胰酶消化3 min，當(dāng)細(xì)胞變圓、間隙變大時(shí)，加入4～5倍含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打?yàn)榧?xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為105個(gè)/ml和4×105個(gè)/ml，分別接種于96孔板和6孔板中(前者用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，后者用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2表達(dá)水平)。黑枸杞水提物組于UVB輻射前12 h加入黑枸杞水提物2 mg/ml，對(duì)照組和UVB組只加入相同量的培養(yǎng)基。各組于UVB輻射前棄去培養(yǎng)基，加入少量的磷酸鹽緩沖液(PBS)，防止細(xì)胞干燥。將96孔板或6孔板置于15 W UVB燈管的正下方，距離20 cm，輻射時(shí)間為40 min，強(qiáng)度30 mJ/cm2，其中對(duì)照組用錫箔紙遮蔽。輻射結(jié)束后，棄去PBS，加入新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20 h。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 采用MTS法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活力。各組每孔中加入20 μl MTS，置于培養(yǎng)箱中孵育3 h，采用Bio-Rad酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490 nm處的吸光度，即細(xì)胞增殖活力。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)4次。

1.5.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 棄去各組原培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗3遍，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化細(xì)胞，收集并用1×膜聯(lián)蛋白緩沖液稀釋成106個(gè)細(xì)胞/ml，取100 μl細(xì)胞懸液，加入5 μl Annexin V和5 μl PI工作液，室溫避光孵育15 min后加入400 μl 1×膜聯(lián)蛋白緩沖液，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5.3 Western blotting法檢測(cè)P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞，采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白并采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。按照SDS-PAGE凝膠制備試劑盒說(shuō)明書(shū)配制12%的膠，上樣，SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉后，經(jīng)一抗(抗P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2、β-actin抗體)、二抗(山羊抗兔抗體)孵育后加入發(fā)光液，暗室曝光，采用Quantity One分析各組P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖活力比較 3組細(xì)胞增殖活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中UVB組細(xì)胞增殖活力小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；黑枸杞水提物組細(xì)胞增殖活力小于對(duì)照組，大于UVB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

2.2 細(xì)胞凋亡率比較 3組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中UVB組細(xì)胞凋亡率大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；黑枸杞水提物組細(xì)胞凋亡率大于對(duì)照組，小于UVB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2、圖1)。

2.3P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2表達(dá)水平比較 3組P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中UVB組P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3表達(dá)水平高于對(duì)照組，Bcl-2表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；黑枸杞水提物組P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3表達(dá)水平低于UVB組，Bcl-2表達(dá)水平高于UVB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表3、圖2)。

表1 各組細(xì)胞增殖活力比較±s，n=4)

注：UVB=中波紫外線；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與UVB組比較，bP<0.05

表2 各組細(xì)胞凋亡率比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與UVB組比較，bP<0.05

表3 各組P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2表達(dá)水平比較

注：P38MAPK=P38絲裂原活化蛋白激酶，caspase-8=半胱氨酸蛋白酶-8，caspase-3=半胱氨酸蛋白酶-3，Bcl-2=B細(xì)胞淋巴瘤因子2；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與UVB組比較，bP<0.05

注：A為對(duì)照組，B為中波紫外線(UVB)組，C為黑枸杞水提物組

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

Figure1 Cell apoptosis detected by flow cytometry

注：UVB=中波紫外線，P38MAPK=P38絲裂原活化蛋白激酶，caspase-8=半胱氨酸蛋白酶-8，caspase-3=半胱氨酸蛋白酶-3，Bcl-2=B細(xì)胞淋巴瘤因子2

圖2 Western blotting法檢測(cè)P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2表達(dá)水平的SDS-PAGE圖

Figure2 SDS-PAGE of Western blotting for detecting expression level of P38MAPK,P53,caspase-8,caspase-3,and Bcl-2

3 討論

人體的衰老與紫外線有著直接的關(guān)系，長(zhǎng)期紫外線輻射會(huì)引起皮膚形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和生理學(xué)改變，其中對(duì)人體造成損害的主要是UVB，且UVB輻射具有遺傳毒性，而HaCaT細(xì)胞是紫外線作用的主要靶細(xì)胞[4]。黑枸杞活性成分(多糖、花色苷、原花青素、酚酸和黃酮)具有較強(qiáng)的抗氧化、抗衰老活性，被原衛(wèi)生部列為“藥食兩用”品種，長(zhǎng)期服用可增強(qiáng)人體抵抗力[2]。目前對(duì)黑枸杞水提物的研究較少，但對(duì)枸杞多糖及花青素的研究較多。本研究以30 mJ/cm2的UVB輻射HaCaT細(xì)胞，建立UVB損傷細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，UVB組細(xì)胞增殖活力小于對(duì)照組，細(xì)胞凋亡率大于對(duì)照組，提示UVB輻射可誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡。黑枸杞水提物組細(xì)胞增殖活力小于對(duì)照組，大于UVB組；黑枸杞水提物組細(xì)胞凋亡率大于對(duì)照組，小于UVB組，與既往研究結(jié)果一致[5]；提示黑枸杞水提物可促進(jìn)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞的增殖，同時(shí)阻止UVB輻射后HaCaT細(xì)胞的凋亡，但不能完全抑制UVB的損傷。

既往研究證明，UVB輻射可增加細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+，激活P38、P53的表達(dá)，特異性降低Bcl-2表達(dá)水平，引起caspase蛋白酶解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6]。P53的活化受P38的調(diào)控，活化的caspase-8在胞質(zhì)中裂解Bcl-2家族成員Bid，誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C[7]進(jìn)而激活caspase-3，形成凋亡小體[8]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9-12]。caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志酶[13]。Bcl-2可通過(guò)抑制自由基的產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、線粒體膜的通透性[14]，阻止細(xì)胞色素C的釋放及caspase激活等機(jī)制發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。但目前尚未見(jiàn)黑枸杞水提物能否通過(guò)降低P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3表達(dá)水平，升高Bcl-2表達(dá)水平來(lái)減輕UVB輻射后HaCaT細(xì)胞凋亡的相關(guān)報(bào)道。因此，本課題組通過(guò)觀察凋亡相關(guān)蛋白(P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3、Bcl-2)表達(dá)水平，來(lái)探討黑枸杞水提物能否通過(guò)降低P38MAPK通路凋亡因子的表達(dá)水平來(lái)減輕UVB輻射后HaCaT細(xì)胞的凋亡。

本研究結(jié)果顯示，UVB組P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3表達(dá)水平高于對(duì)照組，Bcl-2表達(dá)水平低于對(duì)照組，提示UVB輻射可能通過(guò)增加凋亡相關(guān)蛋白P38MAPK、P53、caspase-3、caspase-8表達(dá)水平和降低Bcl-2表達(dá)水平來(lái)誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡。黑枸杞水提物組P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3表達(dá)水平低于UVB組，Bcl-2表達(dá)水平高于UVB組，提示黑枸杞水提物可能通過(guò)下調(diào)P38MAPK、P53、caspase-8表達(dá)水平及上調(diào)Bcl-2表達(dá)水平，進(jìn)而降低caspase-3表達(dá)水平從而減輕UVB輻射后HaCaT 細(xì)胞的凋亡。

本研究?jī)H限于細(xì)胞水平的體外實(shí)驗(yàn)，并未行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，且黑枸杞水提物是否能通過(guò)其他凋亡途徑來(lái)減輕UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞造成的凋亡現(xiàn)象尚有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，黑枸杞水提物可促進(jìn)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞的增殖，同時(shí)阻止其凋亡，其機(jī)制可能為黑枸杞水提物能夠下調(diào)P38MAPK、P53、caspase-8、caspase-3表達(dá)水平及上調(diào)Bcl-2表達(dá)水平，進(jìn)而減輕HaCaT 細(xì)胞的輻射損傷，這為進(jìn)一步探討黑枸杞水提物在UVB光保護(hù)作用中的機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)：加楊娥對(duì)文章進(jìn)行構(gòu)思和設(shè)計(jì)，參與大部分實(shí)驗(yàn)操作，撰寫(xiě)論文；任立汆進(jìn)行文獻(xiàn)資料的收集和整理；燕華玲進(jìn)行文章的可行性分析，對(duì)論文進(jìn)行修正，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

EffectsofBlackWolfberryWaterExtractsonProliferationandApoptosisandApoptosis-related-proteinExpressionLevelofHaCaTCellsafterUVBRadiation

JIAYang-e,RENLi-cuan,YANHua-ling*

DepartmentofDermatology,QinghaiUniversityAffiliatedHospital,Xining810001,China

*Correspondingauthor:YANHua-ling,Professor,Chiefphysician;E-mail:yhlckw@163.com

ObjectiveTo research the effect of black wolfberry water extracts on proliferation and apoptosis and P38 mitogen activated protein kinase(P38MAPK), P53, cysteine proteinase 8(caspase-8), cysteine proteinase 3(caspase-3) and B cell lymphoma factor 2(Bcl-2) expression of HaCaT cells after ultraviolet B(UVB) radiation,in order to explore the mechanism of black wolfberry water extracts reducing the damage of HaCaT cells after UVB radiation.MethodsFrom March 2015 to January 2016, black wolfberry water extracts was extracted and HaCaT cells were cultured in vitro.HaCaT cells in logarithmic growth phase were collected and randomly divided into 3 groups by random number table method:control group(without radiation), UVB group(30 mJ/cm2UVB radiation for 40 min) and black wolfberry water extracts group(30 mJ/cm2UVB radiation for 40 min+black wolfberry water extracts 2 mg/ml).Cell proliferation in each group was detected by MTS, apoptotic rate in each group was assessed by flow cytometry.The expression levels of P38MAPK, P53, caspase-8, caspase-3 and Bcl-2 in each group were detected by Western blotting.ResultsCell proliferation in UVB group was lower than that in control group(P<0.05);cell proliferation in black wolfberry water extracts group was lower than that in control group but higher than that in UVB group(P<0.05).Apoptotic rate in UVB group was higher than that in control group(P<0.05);apoptotic rate in black wolfberry water extracts group was higher than that in control group but lower than that in UVB group(P<0.05).The expression levels of P38MAPK, P53, caspase-8, caspase-3 in UVB group were higher than those in control group, but the expression level of Bcl-2 in UVB group was lower than that in control group(P<0.05);the expression levels of P38MAPK, P53, caspase-8, caspase-3 in black wolfberry water extracts group were lower than those in UVB group, but the expression level of Bcl-2 in black wolfberry water extracts group was higher than that in UVB group(P<0.05).ConclusionThe black wolfberry water extracts can promote the proliferation of HaCaT cells after UVB radiation and prevent their apoptosis.The mechanism might be that the black wolfberry water extracts can down-regulate the expression levels of P38MAPK, P53, caspase-8 and caspase-3 and up-regulate the expression level of Bcl-2, so as to reduce the radiation damage of HaCaT cells.

Lycium barbarum；Ultraviolet rays；Cell proliferation；Apoptosis；P38 mitogen activated protein kinase；Tumor suppressor protein p53；Cysteine proteases；B cell lymphoma factor 2

青海省科技計(jì)劃應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2014-ZJ-756)

R 758.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.07.y18

2017-02-07；

2017-06-05)

810001 青海省西寧市，青海大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科

*通信作者：燕華玲，教授，主任醫(yī)師；E-mail：yhlckw@163.com