幽門螺旋桿菌感染與胃癌組織中p27、CyclinD1、MIF蛋白表達的相關性分析

曹世堂，易小兵，王玉華，楊立宇

(1.白求恩國際和平醫(yī)院二五六臨床部 a.消化內(nèi)科，b.病理科，c.醫(yī)務處，河北 石家莊 050800；2.河北醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北 石家莊 050081)

幽門螺旋桿菌感染與胃癌組織中p27、CyclinD1、MIF蛋白表達的相關性分析

曹世堂1a，易小兵1b，王玉華2，楊立宇1c

(1.白求恩國際和平醫(yī)院二五六臨床部 a.消化內(nèi)科，b.病理科，c.醫(yī)務處，河北 石家莊 050800；2.河北醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北 石家莊 050081)

目的探討幽門螺旋桿菌(Hp)感染與胃癌組織中細胞周期調(diào)節(jié)因子p27、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、巨噬細胞移動抑制因子(MIF)蛋白表達的相關性。方法收集2012年3月至2017年3月經(jīng)胃鏡與病理檢查明確診斷的胃癌標本60例，根據(jù)是否發(fā)生Hp感染分為Hp陽性組、Hp陰性組各30例，另以正常胃黏膜組織20例為正常黏膜組，采用免疫組織化學法檢測三組p27、CyclinD1、MIF蛋白表達水平，并分析其與胃癌患者臨床病理特征及與Hp感染的相關性。結果Hp陽性組p27陽性率低于Hp陰性組和正常黏膜組，CyclinD1、MIF蛋白表達水平高于陰性組和正常黏膜組(P< 0.05)，Hp陰性組與正常黏膜組上述指標差異也有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)；p27、CyclinD1、MIF表達水平與臨床分期、腫瘤浸潤深度、腫瘤分化程度有關(P< 0.05)；胃癌患者Hp感染與p27表達水平呈負相關，與CyclinD1、MIF表達水平呈正相關，且p27與CyclinD1、MIF水平呈負相關性(P< 0.05)。結論幽門螺旋桿菌感染與胃癌組織中p27、CyclinD1、MIF蛋白表達水平存在一定相關性，p27、CyclinD1、MIF可能參與胃癌發(fā)生發(fā)展。

幽門螺旋桿菌感染；胃癌癌組織；p27；CyclinD1；MIF；相關性

幽門螺桿菌(Hp)已被確診為1類胃癌致病因子，是慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌及胃黏膜淋巴樣淋巴瘤的主要病原體，分析與胃癌患者Hp感染相關的生物學標志物對控制胃癌進展及探討治療靶點有重要意義[1，2]。p27、CyclinD1、MIF均是細胞周期調(diào)控蛋白，參與多種癌癥發(fā)生發(fā)展，因此分析p27、CyclinD1、MIF在胃癌、胃癌合并Hp感染中的表達水平及相關性有重要意義[3，4]。本文分析Hp感染與胃癌癌組織中p27、CyclinD1、MIF表達水平的相關性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2012年3月至2017年3月我院經(jīng)胃鏡與病理檢查明確診斷的胃癌標本60例，經(jīng)4%中性福爾馬林固定、常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片作免疫組化標記及革蘭染色使用，所有取材標本的患者均未接受放化療治療，進行胃鏡檢查前近2周內(nèi)無抗Hp藥物使用史或服用非甾體抗炎藥物史，同時排除合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤者。另取距胃癌患者癌組織邊緣5 cm以上經(jīng)病理證實正常的胃黏膜20份，作為正常黏膜組。按是否合并Hp感染將胃癌標本分為Hp陽性組和Hp陰性組各30例，Hp陽性組男18例，女12例；年齡32～67歲[(49.10±0.15)歲]；組織分化程度：高度分化10例，中度分化11例，低分化9例；P-TNM分期Ⅰ+Ⅱ期12例，Ⅲ+Ⅳ期18例，Hp陰性組男17例，女13例；年齡30～68歲[(49.13±0.12)歲]；組織分化程度：高度分化8例，中度分化8例，低分化14例；P-TNM分期Ⅰ+Ⅱ期13例，Ⅲ+Ⅳ期17例，兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)學倫理委員會批準，且標本采集得到患者知情同意。

1.2試劑來源采用13C呼氣試驗及Giemsa染色法檢測Hp感染，PCR引物由上海生工生物工程有限公司設計，RT-PCR試劑盒選用Fermentas公司(合肥志宏生物技術有限公司代理)，2% Giemsa染液由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，免疫人多克隆抗體p27、CyclinD1、MIF(濃縮型)購自Santa Cruz公司(北京中杉金橋生物技術有限公司代理)，即用型非生物素Elivision plus免疫組化試劑盒(產(chǎn)品編號為KIT-9901)、DAB顯色試劑盒(DAB-0031)購自福州邁新生物技術開發(fā)公司。

1.3檢測方法

1.3.1Hp檢測 應用13C呼氣試驗，采用13C標記尿素，空腹達6 h后開始集呼氣100 ml，口服13C-尿素后，收集100 ml待測氣，收集完畢，連接13C紅外線能譜儀檢測孔，自動檢測，生成報告，以DOB值>2.5為陽性。組織切片進行改良Giemsa染色：取活檢標本以10%甲醛固定、不同濃度乙醇脫水，后用石蠟包埋、切成厚度約4 μm切片，進行Giemsa染色，將石蠟切片常規(guī)脫蠟復水，加入2%Giemsa染色劑染色30 min后，經(jīng)自來水洗后迅速加入純酒精內(nèi)脫水及二甲苯透明，以樹膠封固，1000倍油鏡下觀察Hp感染情況。

1.3.2p27、CyclinD1、MIF蛋白表達水平測定 按照試劑盒說明書進行操作，進行脫蠟至水，滴加一抗、二抗，以DAB顯色，染色時設陰性對照(以PBS代替一抗)、陽性對照(由試劑公司提供)，p27、CyclinD1、MIF著色部位主要在細胞核，判斷標準：陽性：細胞核背景呈清晰棕黃色或棕褐色，陽性細胞數(shù)0～5%計0分，6%～20%計1分，21%～50%計2分，>50%計3分，得分0～1分為陰性，2～3分為陽性，所有切片均由兩位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師應用雙盲法進行閱片。

1.3.3Western blot檢測 取標本組織，剪碎，加入PMSF后提取總蛋白，以12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉膜，應用5%脫脂奶粉TT-BS封閉液中封閉1 h，與1∶500稀釋的一抗(免疫人p27、CyclinD1、MIF多克隆抗體)結合，4 ℃孵育過夜，室溫洗膜，10 min/t，共洗滌三次，再與1∶1000稀釋的二抗結合，室溫孵育2 h后，TBS-T洗膜30 min三次后，DAB顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照，以β-肌動蛋白(β-action)作為內(nèi)參照，觀察結果。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。相關分析采用秩相關分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1p27、CyclinD1、MIF蛋白在不同組織中表達水平分析Hp陽性組p27蛋白表達水平明顯低于Hp陰性組和正常黏膜組，CyclinD1、MIF蛋白表達水平高于Hp陰性組和正常黏膜組(P< 0.05)，Hp陰性組與正常黏膜組上述蛋白表達水平差異也有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。見表1，圖1，圖2。

表1 p27、CyclinD1、MIF蛋白在不同組織中表達水平分析 [n(%)]

*與正常黏膜組比較，P< 0.05；#與Hp陰性組比較，P< 0.05

圖1 p27、CyclinD1、MIF蛋白在不同組織中表達病理圖 a:p27在胃癌合并感染胃黏膜組織、胃癌胃黏膜組織中低表達；b:p27在正常胃黏膜組織中高表達；c:CyclinD1在胃癌合并感染胃黏膜組織、胃癌胃黏膜組織中高表達；d:CyclinD1在正常胃黏膜組織中低表達；e:MIF在胃癌合并感染胃黏膜組織、胃癌胃黏膜組織中高表達；f:MIF在正常胃黏膜組織中低表達。

圖2 Western blot法檢測p27、CyclinD1、MIF蛋白在胃癌合并感染胃黏膜組織、胃癌胃黏膜組織、正常黏膜組織中的表達

2.2p27、CyclinD1、MIF蛋白表達水平與臨床病理特征分析對比臨床病理資料發(fā)現(xiàn)，在胃癌患者中，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、浸潤深度見全層、分化程度高者p27、CyclinD1、MIF蛋白陽性率較臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、浸潤深度未見全層、分化程度低者高(P< 0.05)。見表2。

2.3Hp感染與p27、CyclinD1、MIF表達水平的相關性分析胃癌患者Hp感染與p27蛋白表達水平呈負相關，與CyclinD1、MIF蛋白表達水平呈正相關，且p27與CyclinD1、MIF也存在負相關關系(P< 0.05)，見表3。

表2 p27、CyclinD1、MIF蛋白表達水平與臨床病理特征分析 [n(%)]

表3 Hp感染與p27、CyclinD1、MIF表達水平的相關性分析

3 討論

Hp為1983年Warren及Marshall發(fā)現(xiàn)的定植在胃黏膜的革蘭陰性螺旋細長微彎桿菌，目前Hp在我國感染率達50%～80%，且呈逐漸增加趨勢，該病原體為慢性胃炎感染、胃癌、胃淋巴瘤、消化性潰瘍的元兇，被世界衛(wèi)生組織列為致癌因子之一，常規(guī)呼氣、內(nèi)窺鏡等檢查效率率低，因此早期選擇有效生物學指標對其開展診斷有重要意義[5，6]。研究顯示胃癌的發(fā)生受多種癌基因及抑癌基因調(diào)控，腫瘤發(fā)生發(fā)展與細胞周期調(diào)控異常有關，其中Wnt經(jīng)典信號傳導通路在細胞增殖、分化及轉移等方面起重要調(diào)控作用，所以引起的細胞周期紊亂是腫瘤形成的重要決定因素，而Cyclin CD1是Wnt經(jīng)典信號通路的重要靶基因，為重要細胞周期蛋白，該蛋白過度表達可能促進細胞異常增殖或持續(xù)增殖，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展，研究顯示其在胃癌進展、分化、浸潤及轉移中起著重要作用，是判斷胃癌生物學行為的較好指標，但其與胃癌患者Hp感染的相關性較少報道[7～9]。胃癌的發(fā)生為多種因子、多步驟相互作用的復雜生物學過程，而MIF是一種在炎癥反應、腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮雙重作用的蛋白，為人體內(nèi)重要多功能細胞因子，可促進細胞轉化、腫瘤分裂及增殖，有利于促進腫瘤血管生成，有研究顯示胃癌與Hp感染存在相關性，而MIP表達能調(diào)控細胞凋亡，對胃癌發(fā)生發(fā)展有一定促進組作用[10，11]。p27蛋白為細胞周期負性調(diào)節(jié)因子，其表達在腫瘤性疾病發(fā)生中有調(diào)控作用，通過與細胞周期依賴性激酶抑制劑(CDK)結合而起到抑制細胞周期作用，同時也可與Cyclin復合物結合抑制其活性，控制細胞周期由G1期向S期的轉變，在維持胃黏膜上皮細胞增殖及凋亡的平衡過程中起著重要作用，但其表達水平與Hp感染的關系叫較少報道[12]。

在p27、CyclinD1、MIF在不同組織中表達水平方面，胡桂梅等[13]的研究結果顯示，p27在進展期胃癌組中表達水平明顯低于慢性胃炎組及上皮肉瘤變組，與早期胃癌組對比無顯著差異，且Hp感染陽性者p27表達陽性率下降，李多等[14]在分析胃癌組織中幽門螺旋桿菌感染與SOX2、CyclinD1蛋白表達的相關性時發(fā)現(xiàn)，在Hp感染陽性組胃癌組織中Cyclin D1蛋白表達水平達66.7%，明顯高于Hp陰性組的28.5%，歐玉榮等[15]的研究結果顯示胃癌組織中Hp-L陽性組MIF蛋白陽性表達率高于Hp-L陰性組，本研究結果顯示Hp陽性組、Hp陰性組、正常黏膜組的p27、CyclinD1、MIF蛋白陽性表達率對比均有統(tǒng)計學意義，且Hp陽性組p27水平低于Hp陰性組、正常黏膜組，CyclinD1、MIF水平高于Hp陰性組、正常黏膜組，Hp陰性組、正常黏膜組上述指標對比也統(tǒng)計學意義，這與上述研究結果相似，因而在胃癌、胃癌合并Hp感染患者中p27呈低表達，CyclinD1、MIF則呈高表達，尤其對于合并Hp感染者，p27蛋白表達量進一步下降，而CyclinD1、MIF表達水平增加，p27、CyclinD1、MIF在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要角色。在與臨床病理特征之間的關系方面，王軍等[16]的研究結果顯示，胃癌組織中Cyclin D1的表達水平與淋巴結轉移有關，p27在胃癌組織中表達水平與組織學分級、浸潤深度及淋巴結轉移有關，本研究結果顯示在胃癌患者中，臨床分期Ⅲ-Ⅳ期、浸潤深度見全層、分化程度高、淋巴結轉移者p27、CyclinD1、MIF蛋白陽性高于臨床分期Ⅰ-Ⅱ期、浸潤深度未見全層、分化程度低、淋巴結未轉移者，因此結合臨床病理資料，有望將p27、CyclinD1、MIF蛋白表達作為評估胃癌生物學行為及預后的新指標。此外本研究結果也顯示胃癌患者Hp感染與p27蛋白表達呈負相關，與CyclinD1、MIF蛋白表達水平存在正相關性，且p27與CyclinD1、MIF也呈負相關，這與胡桂梅、李多、歐玉榮等的研究結果也相近，因此p27、CyclinD1、MIF蛋白可作為臨床診斷胃癌及是否合并Hp感染的輔助指標，為后期診斷及治療、預后評估提供有價值信息。

綜上所述，胃癌患者Hp感染與其p27、CyclinD1、MIF蛋白表達水平存在一定相關性，同時可用于評估預后，值得在臨床推廣應用。

[1] 黃建民.13C呼氣試驗和血清學檢測幽門螺旋桿菌的結果分析[J].標記免疫分析與臨床，2016，23(12)：1481-1482.

[2] 何世偉，賀利榮，王艷，等.幽門螺桿菌感染與慢性支氣管炎發(fā)病相關性及其對患者血清C-反應蛋白影響的臨床研究[J].湖南師范大學學報(醫(yī)學版)，2016，13(4)：84-86.

[3] 徐惠敏，曹紹歧.CyclinD1、p73和p27在結直腸癌組織中的表達及臨床意義[J].河北醫(yī)藥，2016，38(4)：499-501.

[4] 陳曉露，羅昊，吳蓉宜，等.胃癌合并Hp-L感染患者MIF和MMP-9表達變化及其與血清炎癥因子的關系[J].重慶醫(yī)學，2017，46(2)：250-253.

[5] 季娜，谷婭楠.4214名健康體檢者幽門螺桿菌檢驗結果分析[J].標記免疫分析與臨床，2016，23(3)：303-305.

[6] 黃久評，曾慶彩.艾普拉唑聯(lián)合鉍劑標準四聯(lián)與序貫方案治療幽門螺桿菌感染性慢性胃炎的療效比較[J].醫(yī)學臨床研究，2015，32(2)：380-382.

[7] 丁矢，郭玉鳳，杜維，等.GSK3β和CyclinD1在胃癌組織中的表達及臨床意義[J].腫瘤學雜志，2015，21(7)：577-580.

[8] 王軍，趙醒，趙宇陽，等.胃癌組織中CyclinD1、CDC25B 的表達變化及意義[J].山東醫(yī)藥，2016，56(25)：49-51.

[9] 李多，于永強，齊維娟，等.幽門螺桿菌感染和細胞周期蛋白D1蛋白表達與胃癌的相關性研究[J].中國臨床醫(yī)生雜志，2016，44(7)：45-48.

[10]許穎，林代瓊，李長英，等.胃癌幽門螺桿菌感染患者巨噬細胞移動移植因子表達水平與臨床病理參數(shù)的關系研究[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2016，26(12)：2730-2732.

[11]王慶玉.胃癌組織中MIF與miR-451的表達及其臨床意義[J].中國實驗診斷學，2016，20(3)：375-377.

[12]王成，馬曉明.抑癌基因PTEN、p27在胃癌組織中的表達及臨床意義[J].世界華人消化雜志，2015，23(14)：2285-2289.

[13]胡桂梅，葉國良，秦麗君，等.Stathmin和p27在胃癌演變過程中的表達變化及與Hp感染的關系[J].浙江醫(yī)學，2016，38(17)：1393-1396.

[14]李多，齊維娟，于永強，等.胃癌組織中幽門螺旋桿菌感染與SOX2、CyclinD1蛋白表達的相關性研究[J].疑難病雜志，2016，15(4)：381-385.

[15]歐玉榮，康敏，周蕾，等.胃癌中幽門螺桿菌L型感染與MIF、MMP9、VEGF表達的關系[J].南方醫(yī)科大學學報，2014，34(2)：180-187.

[16]王軍，趙醒，趙宇陽，等.胃癌組織中Cyclin D1、CDC25B和p27的表達及其臨床意義[J].臨床與實驗病理學雜志，2016，32(6)：678-680.

CorrelationbetweenHelicobacterpyloriinfectionandtheexpressionofp27，cyclinD1andMIFproteinsingastriccancer

CAOShi-tang1a，YIXiao-bing1b，WANGYu-hua2，YANGLi-yu1c

(1a.DepartmentofGastroenterology，1b.DepartmentofPathology，1c.MedicalAdministrationDivision，256ClinicalDepartment，BethuneInternationalPeaceHospital，Shijiazhuang050800，China；2.DepartmentofOncology，TheFourthAffiliatedHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050081，China)

ObjectiveTo analyze the correlation between Helicobacter pylori (Hp) infection and the protein expressions of cell cycle regulatory factor p27，cyclinD1 and macrophage migration inhibitory factor (MIF) in gastric cancer.MethodsSixty gastric cancer specimens confirmed by gastroscopy and pathology were collected between March 2012 and March 2017.According to the occurrence of Hp infection，they were divided into Hp positive or negative groups.Another 20 normal gastric mucosa tissues were collected as normal mucosa group.The expression levels of p27，cyclinD1 and MIF in the three groups were detected by immunohistochemistry，and their correlations with the clinicopathological features and Hp infection were analyzed.ResultsThe positive rate of p27 in the Hp positive group was lower than that in the Hp negative group and the normal mucosa group while the expression levels of cyclinD1 and MIF in the Hp positive group were higher than those in the Hp negative group and the normal mucosa group (P< 0.05).There were significant differences in above indexes between the Hp negative group and the normal mucosa group (P< 0.05).The expression levels of p27，cyclinD1 and MIF were related to clinical stage，depth of tumor invasion and tumor differentiation degree (P< 0.05).Correlation analysis also showed that Hp infection was negatively correlated with the expression level of p27，and positively correlated with the expression levels of cyclinD1 and MIF.There was a negative correlation between p27 and cyclinD1 and MIF levels (P< 0.05).ConclusionThere is correlation between Hp infection and the expression levels of p27，cyclinD1 and MIF proteins in gastric cancer tissues.P27，cyclinD1 and MIF may be involved in the development of gastric cancer.

Helicobacter pylori infection；Gastric cancer tissue；p27；CyclinD1；MIF；Correlation

R735.2

A

1672-6170(2017)05-0154-04

2017-03-21；

2017-05-23)