蒽環(huán)類藥物的心臟毒性機(jī)制

秦 聰(綜述)，吳星恒(審校)

(南昌大學(xué)a.研究生院醫(yī)學(xué)部2014級(jí); b.第一附屬醫(yī)院兒科，南昌330006)

蒽環(huán)類藥物的心臟毒性機(jī)制

秦 聰a(綜述)，吳星恒b(審校)

(南昌大學(xué)a.研究生院醫(yī)學(xué)部2014級(jí); b.第一附屬醫(yī)院兒科，南昌330006)

蒽環(huán)類藥物(ANT)是應(yīng)用最廣泛的抗腫瘤藥物之一，但由于其嚴(yán)重的心臟毒性，臨床應(yīng)用受到限制。早期研究認(rèn)為ANT的心臟毒性作用與氧化應(yīng)激及鐵代謝失衡有關(guān)，新近的研究發(fā)現(xiàn)，ANT還可通過(guò)干擾基因的表達(dá)及加快細(xì)胞自噬導(dǎo)致心臟損傷，本文就氧化應(yīng)激、鐵代謝失衡、細(xì)胞自噬、基因表達(dá)等方面，對(duì)ANT致心臟毒性機(jī)制進(jìn)行綜述。

蒽環(huán)類藥物; 心臟毒性; 機(jī)制

蒽環(huán)類藥物(ANT)應(yīng)用于臨床已達(dá)半世紀(jì)之久，被越來(lái)越多的化療方案采用以發(fā)揮其最大的抗腫瘤效應(yīng)，成為現(xiàn)代腫瘤治療學(xué)的重大成就之一。近年來(lái)某些化療藥物逐漸被靶向治療所替代，而ANT在腫瘤聯(lián)合化療方案中的地位仍難以取代[1-3]。由于ANT嚴(yán)重的心臟毒性使其臨床應(yīng)用受到了極大的限制，心臟毒性大小往往呈劑量相關(guān)性，與非蒽環(huán)類化療藥物聯(lián)合治療時(shí)，心臟毒性常常加重。ANT致心臟毒性作用可隨時(shí)發(fā)生，即使是緩解期的腫瘤患者也不能幸免[4-5]。關(guān)于ANT致心臟毒性機(jī)制，早期研究以氧化應(yīng)激、鐵代謝失衡為主，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)ANT致心臟毒性是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，并將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到基因表達(dá)層面。本文就幾種ANT致心臟毒性機(jī)制作一綜述。

1 ANT產(chǎn)生活性氧簇(ROS)與心肌損傷

ANT產(chǎn)生的ROS及有毒醛類物質(zhì)對(duì)多種細(xì)胞及組織均有損害作用，為什么心臟對(duì)ANT的損傷最敏感呢？首先，由于心肌細(xì)胞缺乏抗氧化酶，因此抗氧化活性較其他組織、細(xì)胞弱。肝臟中過(guò)氧化氫酶的含量是心臟的150倍，超氧化物歧化酶的含量約為心臟的4倍[7]。Doroshow等[7]研究表明盡管正常肝臟和心臟所含谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性相同，但阿霉素作用后心臟的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶卻更易受其影響致活性下降。實(shí)驗(yàn)以遞增濃度的阿霉素(5、10、15 mg·kg-1)作用于小鼠，發(fā)現(xiàn)阿霉素劑量越高，小鼠心臟的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性越低，心肌細(xì)胞損傷越嚴(yán)重；而心臟的超氧化物歧化酶、肝臟的超氧化物歧化酶以及肝臟的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性受同一劑量的阿霉素影響不明顯。由此猜想，心臟對(duì)抗過(guò)氧化物損傷主要通過(guò)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶作用，但其活性可受阿霉素的影響而降低，使心臟缺乏對(duì)抗氫過(guò)氧化損傷及脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的能力。其次，ANT與心肌細(xì)胞有高度親和力，Parker等[8]通過(guò)建立2H標(biāo)記的心磷脂的陰離子型磷脂雙分子模型，在磁場(chǎng)存在的條件下，阿霉素與此模型結(jié)合可導(dǎo)致2H的分裂，以此來(lái)證實(shí)阿霉素與心磷脂的親和力，結(jié)果表明阿霉素對(duì)屬于陰離子型磷脂雙分子的心磷脂具有高度親和力。而動(dòng)物體內(nèi)的心磷脂大部分存在于線粒體細(xì)胞內(nèi)膜及心肌中。同時(shí)心肌細(xì)胞本身也富含線粒體，線粒體占據(jù)心肌細(xì)胞內(nèi)近50%的空間。另一方面，相較于肝臟線粒體，心肌細(xì)胞的線粒體可產(chǎn)生額外的NADH脫氫酶，循環(huán)生成更多ANT相關(guān)自由基參與氧化應(yīng)激損傷[9-10]。

2 鐵代謝失調(diào)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B8(ABCB8)與心肌損傷

Ichikawa等[11]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的新生鼠心肌細(xì)胞中，阿霉素的作用可使線粒體內(nèi)鐵含量顯著升高，ABCB8 mRNA及其蛋白質(zhì)水平卻顯著下降。ABCB8屬于ABC蛋白家族中的一員，有研究[12-13]表明，ABCB8通過(guò)協(xié)調(diào)線粒體鐵的輸出對(duì)維持線粒體內(nèi)鐵平衡及細(xì)胞質(zhì)Fe/S蛋白成熟有重要作用。由此猜測(cè)，阿霉素致心肌細(xì)胞鐵失衡與其調(diào)節(jié)ABCB8有關(guān)。Ichikawa等[11]還發(fā)現(xiàn)在ABCB8 mRNA及蛋白質(zhì)下調(diào)時(shí)，線粒體鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-2(一種參與線粒體內(nèi)鐵輸入的蛋白)水平無(wú)明顯改變，但與鐵存儲(chǔ)有關(guān)的線粒體鐵蛋白及其mRNA水平顯著上升，說(shuō)明阿霉素致心肌細(xì)胞鐵失衡是由于鐵的輸出受抑制而并非是鐵輸入的增加。離體實(shí)驗(yàn)中，阿霉素作用于ABCB8表達(dá)下調(diào)的新生鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)線粒體中的鐵水平明顯增高，而細(xì)胞核或者細(xì)胞質(zhì)中的鐵含量無(wú)明顯改變，通過(guò)MTS分析及TUNEL法測(cè)定本組的心肌細(xì)胞死亡率也較阿霉素作用的普通新生鼠心肌細(xì)胞明顯升高。另一方面，使ABCB8基因過(guò)表達(dá)可抑制阿霉素所致心肌細(xì)胞線粒體鐵聚集并明顯減少心肌細(xì)胞死亡率，說(shuō)明阿霉素致心臟損傷與其抑制ABCB8的表達(dá)進(jìn)而影響心肌細(xì)胞的鐵代謝有關(guān)。

3 帶有caspase富集功能域的凋亡抑制因子(ARC)、MicroRNA-532-3p與心肌損傷

ARC最初是作為內(nèi)源性細(xì)胞凋亡抑制因子被發(fā)現(xiàn)。它對(duì)內(nèi)源性及外源性的細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑均有對(duì)抗作用。ARC對(duì)于保持心臟生理功能也具有重要作用，在病理?xiàng)l件下，ARC下調(diào)可引起多種心臟疾病的發(fā)生，如心肌肥大、心力衰竭和心肌梗死。

Wang等[14]將阿霉素作用于離體的心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不論是在ARC mRNA水平還是在其蛋白水平，數(shù)量均下調(diào)。阿霉素劑量為2 μmol·L-1時(shí)，線粒體開始分裂，心肌細(xì)胞死亡率逐漸增加，在這個(gè)過(guò)程中，Caspase-3的活性明顯增加。但阿霉素作用于可高表達(dá)ARC的心肌細(xì)胞時(shí)，線粒體分裂、心肌細(xì)胞凋亡及Caspase-3的活性均降低。小劑量阿霉素(0.2 μmol·L-1)作用于正常心肌細(xì)胞時(shí)，僅有一小部分心肌細(xì)胞發(fā)生線粒體分裂、細(xì)胞凋亡，而相同的小劑量阿霉素作用于敲除ARC基因的心肌細(xì)胞，線粒體分裂、細(xì)胞凋亡及Caspase-3的活性再次顯著增加。由此猜測(cè)ANT致心臟毒性可能與其下調(diào)ARC表達(dá)有關(guān)。

MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼區(qū)的RNA，可通過(guò)控制mRNA自身的穩(wěn)定及其翻譯過(guò)程對(duì)靶基因進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)。miRNA也具有調(diào)節(jié)心臟功能的作用，例如控制心臟電信號(hào)的傳導(dǎo)、心肌細(xì)胞的收縮、心臟的生長(zhǎng)及形態(tài)的改變等。Wang等[14]通過(guò)RNA雜交工程及即時(shí)定量聚合酶連鎖反應(yīng)(qRT-PCR)研究ARC基因的3′非編碼區(qū)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，阿霉素作用使ARC表達(dá)下調(diào)時(shí)，一些miRNA數(shù)量增加，其中miRNA-532-3p數(shù)量增加明顯。進(jìn)一步的熒光標(biāo)記法證實(shí)miRNA-532-3p可通過(guò)作用于3′非編碼區(qū)來(lái)調(diào)節(jié)ARC的生成。單使心肌細(xì)胞的miRNA-532-3p擴(kuò)增對(duì)線粒體的裂解及凋亡無(wú)明顯影響，但加入阿霉素后，即使是小劑量(0.2 μmol·L-1)，miRNA-532-3p擴(kuò)增的心肌細(xì)胞也會(huì)出現(xiàn)明顯增多的線粒體裂解及心肌細(xì)胞凋亡，說(shuō)明阿霉素通過(guò)miRNA-532-3p下調(diào)ARC水平，使線粒體裂解增加進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。因?yàn)锳RC在某些腫瘤細(xì)胞中也可高表達(dá)，阿霉素使腫瘤細(xì)胞中ARC表達(dá)下調(diào)的過(guò)程中是否也有miRNA-532-3p參與？在一些腫瘤細(xì)胞中(例如Hela、SGC-7901、SW-480、HepG-2)，miRNA-532-3p表達(dá)水平較心肌細(xì)胞低。在Hela、SGC-7901、SW-480、HepG-2腫瘤細(xì)胞株中加入阿霉素，并未發(fā)現(xiàn)miRNA-532-3p的表達(dá)水平有明顯改變。敲除miRNA-532-3p基因的Hela、SGC-7901、SW-480、HepG-2腫瘤細(xì)胞株在作用于阿霉素后，其細(xì)胞凋亡情況較未敲除該基因的腫瘤細(xì)胞株無(wú)明顯差異。由此可見，miRNA-532-3p并未參與阿霉素的抗腫瘤過(guò)程，僅在阿霉素致心臟毒性中發(fā)揮作用。這為研究既不干擾阿霉素抗腫瘤作用,又可保護(hù)心臟的抗心肌損傷藥物提供了方向。

4 心肌細(xì)胞自噬

ANT引起的心臟毒性涉及多種不同的蛋白質(zhì)消耗，包括細(xì)胞自噬在內(nèi)的多種蛋白降解系統(tǒng)參與了ANT相關(guān)心臟毒性的發(fā)生。當(dāng)細(xì)胞自噬發(fā)生時(shí)，由自噬相關(guān)基因ATG8編碼的微管相關(guān)蛋白質(zhì)輕鏈3(LC3)酶解掉一小段多肽，使LC3-I(18 000)轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-Ⅱ(16 000)，并進(jìn)入自噬小體(AVs)形成其中一部分。因此LC3-Ⅱ的水平在一定程度上與自噬小體的數(shù)量正相關(guān)。為了解阿霉素對(duì)心肌細(xì)胞的致自噬作用，Kobayashi等[15]將心肌細(xì)胞培養(yǎng)在加有1%牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，使用阿霉素(1 μmol·L-1)作用18 h后測(cè)定LC3-Ⅱ的水平。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)(WB)表明，阿霉素作用后LC3-Ⅱ水平顯著升高。但是LC3-Ⅱ及AVs的水平會(huì)隨著自噬小體的形成和降解發(fā)生變化，自噬流可以反映自噬小體轉(zhuǎn)移至溶酶體的量及在其中降解的程度，進(jìn)一步反映細(xì)胞自噬的活性。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較溶酶體抑制劑存在與否的條件下AVs或LC3-Ⅱ的含量變化來(lái)反映自噬流，為了解阿霉素引起LC3-Ⅱ的聚集是因?yàn)樽允闪鬟€是因?yàn)榈鞍捉到庀到y(tǒng)自身功能失調(diào)，根據(jù)是否加入溶酶體抑制劑巴弗洛霉素A1(BFAA1)將阿霉素作用的心肌細(xì)胞再次分組。結(jié)果表明，加入BFAA1的阿霉素作用組較未加入BFAA1的阿霉素作用組，LC3-Ⅱ增加更顯著，說(shuō)明阿霉素可通過(guò)加快心肌細(xì)胞自噬引起心臟損傷。

5 心肌錨定重復(fù)序列蛋白(CARP)、轉(zhuǎn)錄因子GATA4與心肌損傷

CARP是經(jīng)典的肌肉序列蛋白家族中的一類。在培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞中使用干擾性小核糖核酸(siRNA)抑制CARPmRNA轉(zhuǎn)錄，發(fā)現(xiàn)CARP減少的同時(shí)絲狀肌動(dòng)蛋白及肌間蛋白條紋數(shù)量均急劇下降，大量肌纖維被破壞致顯著的肌節(jié)紊亂[15]。CARP對(duì)阿霉素極為敏感，Chen等[16]將阿霉素作用于體外培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)即使0.5 μmol·L-1劑量的阿霉素足以對(duì)CARP的表達(dá)產(chǎn)生顯著的抑制。

GATA4屬于鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子GATA家族中的一員。GATA家族中的6個(gè)成員通過(guò)識(shí)別相應(yīng)基因片段并與之結(jié)合起到調(diào)節(jié)目的基因轉(zhuǎn)錄的作用。GATA1、2、3在調(diào)節(jié)血細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄中起到重要作用，GATA4、5、6在新生的心臟中表達(dá)，而GATA4在成熟的心臟中有較大的活性。GATA4作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對(duì)心肌細(xì)胞的分化、心肌肌節(jié)的合成及心肌細(xì)胞的存活起著重要的作用，但阿霉素可下調(diào)GATA4連接活性，引起心肌纖維破壞、肌節(jié)紊亂，進(jìn)而出現(xiàn)心肌收縮功能減弱影響心臟功能[17]。

Park等[18]發(fā)現(xiàn)柔紅霉素(DNR)可以抑制小鼠心肌細(xì)胞GATA4 mRNA的表達(dá)且DNR的這種作用依賴于p53基因，使用抑制劑-α(一種p53的抑制劑)可抑制DNR對(duì)GATA4的下調(diào)作用。

Chen等[16]在小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)使用siRNA敲除GATA4基因，CARP基因啟動(dòng)子的活性及CARP蛋白數(shù)量均下降，致大量心肌細(xì)胞肌節(jié)紊亂，使用載有GATA4基因的腺病毒轉(zhuǎn)染一部分敲除GATA4基因的小鼠心肌細(xì)胞使GATA4基因過(guò)表達(dá)，24 h后將相同劑量阿霉素分別作用于GATA4過(guò)表達(dá)組及GATA4無(wú)表達(dá)組，發(fā)現(xiàn)較GATA4無(wú)表達(dá)組，GATA4過(guò)表達(dá)組的CARP水平明顯增高，免疫組織化學(xué)顯示心肌細(xì)胞M線被很好的保留，證明GATA4過(guò)表達(dá)可抑制阿霉素致心肌肌節(jié)紊亂并猜測(cè)ANT可通過(guò)下調(diào)GATA4致CARP數(shù)量減少，進(jìn)而引起心肌細(xì)胞肌節(jié)紊亂。

研究發(fā)現(xiàn)GATA4與ANT致心肌細(xì)胞自噬也有關(guān)系。Kobayashi等[15]將阿霉素(1 μmol·L-1)作用于培養(yǎng)的新生鼠心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅱ在加入阿霉素的1～3 h就開始顯著增加，隨著阿霉素的加入，LC3-Ⅱ的數(shù)量一直持續(xù)上升，相反，GATA4的數(shù)量在最初作用的1～3 h減少最顯著，之后持續(xù)下降。進(jìn)一步研究，使心肌細(xì)胞GATA4基因過(guò)表達(dá)，在阿霉素作用下，LC3-Ⅱ數(shù)量下降，加入BFAA1的心肌細(xì)胞組也可見LC3-Ⅱ的聚集明顯減少。當(dāng)敲除心肌細(xì)胞GATA4基因后，可發(fā)現(xiàn)阿霉素致心肌細(xì)胞自噬流顯著增加。另一方面，當(dāng)GATA4過(guò)表達(dá)使心肌細(xì)胞自噬流減少時(shí)，Bcl-2蛋白顯著增加；GATA4基因敲除后，心肌細(xì)胞自噬流顯著增加，但近90%的Bcl-2蛋白隨之減少。由此猜測(cè)GATA4參與的ANT致心肌細(xì)胞自噬可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)起作用。

6 結(jié)語(yǔ)

ANT致心臟毒性是由多種機(jī)制共同作用引起。除了引起氧化應(yīng)激及鐵代謝失衡外，ANT可通過(guò)加快心肌細(xì)胞自噬作用并影響多種基因的表達(dá)，使其編碼的功能蛋白發(fā)生改變從而引起心肌細(xì)胞的功能失調(diào)，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡，造成心臟不可逆的損傷。

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(責(zé)任編輯：羅芳)

2017-02-12

R96

A

1009-8194(2017)06-0104-02

10.13764/j.cnki.lcsy.2017.06.041