土鱉蟲(chóng)不同酶解提取物的體外抑菌活性研究

趙紅玲，鄧淑華，郝 婷，尹毛毛，尹志峰，王良友

(承德醫(yī)學(xué)院 中藥研究所 河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德 067000)

土鱉蟲(chóng)不同酶解提取物的體外抑菌活性研究

趙紅玲，鄧淑華，郝 婷，尹毛毛，尹志峰，王良友*

(承德醫(yī)學(xué)院 中藥研究所 河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德 067000)

采用不同酶酶解土鱉蟲(chóng)粉，用 Folin酚比色法測(cè)定不同酶解提取物的質(zhì)量得率和肽含量；然后以金黃色葡萄球菌、白葡萄球菌和大腸埃希氏桿菌為受試菌株，通過(guò)體外抑菌實(shí)驗(yàn)測(cè)定酶解提取物的抑菌活性。結(jié)果表明，土鱉蟲(chóng)胃蛋白酶酶解提取物的肽含量最高，達(dá)到36.5%；胃蛋白酶酶解提取物對(duì)3種受試菌株均有不同程度的抑制作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)分別為12.5 mg·mL-1和25.0 mg·mL-1。

土鱉蟲(chóng)；酶解；體外抑菌活性；抗菌肽

土鱉蟲(chóng)為鱉蠊科Eupolyphaga sinesisWallker的雌蟲(chóng)干燥體，是一種珍貴的蟲(chóng)藥資源，含有較多活性成分：蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、微量元素、生物堿和脂溶性維生素等[1-2]，在增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗炎、抗凝血、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、預(yù)防心血管疾病等方面具有較好的作用[3-7]，有較高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，已被開(kāi)發(fā)成食物原料，如營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的蛋白質(zhì)補(bǔ)充劑：中華地鱉酒、中華地鱉膠囊、地鱉蟲(chóng)氨基酸口服液等。

昆蟲(chóng)提取物具有抗生素活性，是潛在的天然抗生素，具有一定的開(kāi)發(fā)前景。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)昆蟲(chóng)體內(nèi)抗菌物質(zhì)的研究主要集中在凝集素、溶菌酶及抗菌肽[8-10]等。其中，蟲(chóng)類抗菌肽已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)之一，如從螞蟻、蜘蛛等毒素中提取抗菌蛋白，從絲光綠蠅、美洲大蠊等中分離抗菌肽物質(zhì)[11-14]，從金邊地鱉[15]、中華真地鱉[16]中采用乙酸乙酯等方法提取抑菌活性物質(zhì)，但關(guān)于土鱉蟲(chóng)抗菌肽的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，有效抑菌活性成分及作用機(jī)制也尚未明確。因此，作者采用不同蛋白酶酶解土鱉蟲(chóng)粉得到富含肽類的提取物，以金黃色葡萄球菌、白葡萄球菌和大腸埃希氏桿菌為受試菌株進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，測(cè)定最低抑菌濃度 (MIC)和最低殺菌濃度(MBC)，評(píng)價(jià)土鱉蟲(chóng)酶解提取物的體外抑菌活性，為進(jìn)一步研究土鱉蟲(chóng)活性成分及應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 藥材與受試菌株

土鱉蟲(chóng)藥材購(gòu)自同仁堂大藥房，經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所趙春穎教授鑒定，符合2010版藥典規(guī)定。土鱉蟲(chóng)干燥體粉碎，過(guò)80目篩，備用。

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(26001-26)、白葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(26069-5)、大腸埃希氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(44113-10)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 試劑與儀器

營(yíng)養(yǎng)肉湯(批號(hào)20150701)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(批號(hào)20150508)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛血清白蛋白、胃蛋白酶(EC.3.4.23.1)、胰蛋白酶(EC.3.4.21.4)、糜蛋白酶(EC.3.4.21.1)，Sigma公司； Folin酚檢測(cè)試劑盒(編號(hào)C505031)，Sangon Biotech公司；陽(yáng)性對(duì)照藥氨芐西林膠囊(批號(hào) 19855)，香港聯(lián)邦制藥廠有限公司。

HH-400型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；JA2003型電子天平，上海天平儀器廠；KQ-500B型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；SHINVA型手提式壓力蒸汽滅菌器，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；一次性培養(yǎng)板，浙江拱東醫(yī)療科技有限公司；倒置顯微鏡，重慶光學(xué)儀器廠；Spectrum-752型紫外分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；無(wú)菌平皿。

1.3 方法

1.3.1 土鱉蟲(chóng)酶解提取物的制備[17]

稱取10 g土鱉蟲(chóng)粉4份，分別置于500 mL圓底燒瓶中。一份加入200 mL人工胃液、0.6 g胃蛋白酶，于37 ℃水浴恒溫振蕩器中酶解3 h；一份加入200 mL人工結(jié)腸液、0.6 g胰蛋白酶，于37 ℃水浴恒溫振蕩器中酶解3 h；一份加入200 mL人工結(jié)腸液、0.6 g糜蛋白酶，于37 ℃水浴恒溫振蕩器中酶解3 h；一份加入200 mL人工胃液、0.6 g胃蛋白酶，于37 ℃ 水浴恒溫振蕩器中酶解3 h后，用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)酶解液pH值至7.5，再加入0.6 g胰蛋白酶，于37 ℃酶解3 h。反應(yīng)結(jié)束后均于100 ℃水浴滅活15 min，4 000 r·min-1離心15 min，取上清液，冷凍，干燥，稱重，計(jì)算質(zhì)量得率。

分別稱取上述 4種土鱉蟲(chóng)酶解提取物干粉1.000 g，每份加滅菌蒸餾水5 mL溶解，配制成0.200 g·mL-1的酶解提取物溶液，備用。

1.3.2 土鱉蟲(chóng)酶解提取物肽含量的測(cè)定(Folin酚比色法)[18]

肽含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：在分析天平上精確稱取0.010 g結(jié)晶牛血清白蛋白，用蒸餾水溶解并定容至100 mL，配制成0.100 mg·mL-1的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液；根據(jù)試劑盒說(shuō)明配制工作液，充分混勻。分別精密量取0 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL、50 μL、60 μL、70 μL、80 μL、90 μL、100 μL蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液置于離心管中，加水至200 μL；加入1 mL工作液，混勻，室溫靜置10 min；加入100 μL Folin酚試劑，迅速混勻，室溫靜置30 min；用分光光度計(jì)測(cè)定750 nm處吸光度。以吸光度(A750)為縱坐標(biāo)、蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(c)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

肽含量的測(cè)定：分別精密量取4種土鱉蟲(chóng)酶解提取物溶液，置于100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為供試品溶液，按上法測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算肽含量。

1.3.3 土鱉蟲(chóng)酶解提取物體外抑菌實(shí)驗(yàn)

水利工程施工建設(shè)要盡量避免在冬季或溫度較低的深秋環(huán)境下進(jìn)行，根本原因在于，氣候條件惡劣會(huì)影響軟土地基施工環(huán)節(jié)的深層攪拌樁處理。由此可見(jiàn)，水利施工技術(shù)人員要在處理深層攪拌樁前，密切關(guān)注施工區(qū)域的天氣變化情況，綜合考量環(huán)境因素。

菌液的配制：分別將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株、白葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株和大腸埃希氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中37 ℃增菌培養(yǎng)18 h，備用。

體外抑菌實(shí)驗(yàn)(打孔法)[19]：按比濁法將菌液用培養(yǎng)基稀釋至細(xì)菌濃度為10-7個(gè)·mL-1的菌懸液，用無(wú)菌吸管吸取菌懸液100 μL到瓊脂平板上，以無(wú)菌載玻片將菌懸液涂布均勻，再用直徑為6 mm的無(wú)菌打孔器打孔，每皿打4孔，其中2孔加入0.200 g·mL-1酶解提取物溶液100 μL，1孔為空白對(duì)照，1孔為陽(yáng)性對(duì)照氨芐西林(0.002 g·mL-1)，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，以有無(wú)抑菌圈初步判斷有無(wú)抑菌活性。每種酶解提取物均進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

MIC的測(cè)定[20]：將有抑菌圈的酶解提取物溶液，采用倍比稀釋法分別用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行8個(gè)濃度的倍比稀釋。取預(yù)處理過(guò)的無(wú)菌24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度對(duì)應(yīng)設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，每孔加入1 mL稀釋酶解提取物溶液。將菌液用培養(yǎng)基稀釋1 000倍，每孔加入50 μL稀釋菌液，其中2孔只加培養(yǎng)液和50 μL稀釋菌液作為空白對(duì)照，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)18 h，取出，用倒置顯微鏡觀察細(xì)菌生長(zhǎng)狀況，以無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為MIC。

MBC的測(cè)定：平板高溫滅菌20 min，將已冷卻至50～60 ℃的普通瓊脂培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平板上(培養(yǎng)基厚度4～8 mm)，凝固后備用。選擇在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)物100 μL接種于普通瓊脂平板培養(yǎng)基。以無(wú)菌載玻片均勻涂布，標(biāo)記平板，倒置。于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)18 h，取出，計(jì)數(shù)菌落，以菌落數(shù)少于5個(gè)(2個(gè)復(fù)孔的平均值)的最低濃度為MBC。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用軟件SPSS20.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 肽含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)

圖1 肽含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖1可以看出，蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液在0～0.100 mg·mL-1范圍內(nèi)與A750線性關(guān)系良好，線性回歸方程為：A750=4.4464c+0.0618，R=0.9994。

圖2 酶解提取物的質(zhì)量得率及肽含量

從圖2可以看出，仿生酶酶解提取物的質(zhì)量得率最高，達(dá)到68.7%；胃蛋白酶酶解提取物的肽含量最高，達(dá)到36.5%；不同酶酶解提取物的肽含量高低依次為胃蛋白酶>仿生酶>糜蛋白酶>胰蛋白酶。

2.3 酶解提取物的體外抑菌活性評(píng)價(jià)

4種酶解提取物的抑菌效果如表1所示。

表1 4種酶解提取物的抑菌效果

Tab.1 Antibacterial efficiency of four enzymolysis extracts

酶解提取物濃度g·mL-1金黃色葡萄球菌白葡萄球菌大腸埃希氏桿菌胃蛋白酶0．200+++胰蛋白酶0．200---糜蛋白酶0．200---仿生酶0．200---氨芐西林0．002+++

注：“+”表示有抑菌圈，抑菌活性呈陽(yáng)性；“-”表示無(wú)抑菌圈，抑菌活性呈陰性。

從表1可以看出，0.200 g·mL-1的胰蛋白酶酶解提取物、糜蛋白酶酶解提取物、仿生酶酶解提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、白葡萄球菌、大腸埃希氏桿菌沒(méi)有抑菌活性，而胃蛋白酶酶解提取物(0.200 g·mL-1)和陽(yáng)性對(duì)照氨芐西林(0.002 g·mL-1)對(duì)3種受試菌株均顯示出不同程度的抑菌活性。

將產(chǎn)生抑菌圈的胃蛋白酶酶解提取物進(jìn)一步倍比稀釋，進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，測(cè)定抑菌參數(shù)MIC和MBC，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 胃蛋白酶酶解提取物對(duì)3種受試菌株的MIC和MBC

從表2可知，土鱉蟲(chóng)胃蛋白酶酶解提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，MIC和MBC分別為12.5 mg·mL-1和25.0 mg·mL-1；對(duì)白葡萄球菌和大腸埃希氏桿菌的抑制作用相似，MIC和MBC分別為25.0 mg·mL-1和50.0 mg·mL-1。

3 結(jié)論

對(duì)土鱉蟲(chóng)酶解提取物的肽含量和體外抑菌活性進(jìn)行了測(cè)定和評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，不同酶酶解提取物肽含量的高低依次為：胃蛋白酶>仿生酶>糜蛋白酶>胰蛋白酶，胃蛋白酶酶解提取物的肽含量高達(dá)36.5%。體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示僅有胃蛋白酶酶解提取物對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸埃希氏桿菌)及陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌及白葡萄球菌)的抑制作用均呈陽(yáng)性，且具有一定的量效關(guān)系，其中對(duì)金黃色葡萄球菌最為敏感，MIC和MBC分別為12.5 mg·mL-1和25.0 mg·mL-1。

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InVitroAntibacterial Activity of Different Enzymolysis ExtractsfromEupolyphagasinesisWallker

ZHAO Hong-ling,DENG Shu-hua,HAO Ting,YIN Mao-mao,YIN Zhi-feng,WANG Liang-you*

(KeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineResearchandDevelopmentofHebeiProvince,InstituteofTraditionalChineseMedicine,ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China)

WeenzymolyzedEupolyphaga sinesisWallkerpowderbyusingdifferentenzymes,anddeterminedthequalityyieldandpeptidecontentindifferentenzymolysisextractsbyFolinphenolcolorimetry.Then,usingStaphylococcus aureus,Staphylococcus albus,andEscherichia coliastestingstrains,wedeterminedtheantibacterialactivityofenzymolysisextractbyin vitroantibacterialexperiment.Resultsindicatedthatthepeptidecontentinpepsinenzymolysisextractwasthehighestof36.5%.Pepsinenzymolysisextracthaddifferentdegreesofantibacterialeffectsagainstthreetestingstrains,inwhichtheantibacterialeffectsagainstStaphylococcus aureuswasthebestwithMICof12.5mg·mL-1andMBCof25.0mg·mL-1.

Eupolyphaga sinesisWallker;enzymolysis;in vitroantibacterialactivity;antibacterialpeptide

河北省海外高層次人才“百人計(jì)劃”項(xiàng)目(E201200002)，河北省中醫(yī)藥管理局中藥類科研計(jì)劃項(xiàng)目(2017189)，承德醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201616)

2017-04-06

趙紅玲(1977-)，女，蒙古族，遼寧鎮(zhèn)賚人，助理研究員，研究方向：生物活性多肽藥物，E-mail：zhldxy@163.com；通訊作者：王良友，副教授。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.08.012

R284.2

A

1672-5425(2017)08-0059-04

趙紅玲，鄧淑華，郝婷，等.土鱉蟲(chóng)不同酶解提取物的體外抑菌活性研究[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(8)：59-62.