離子交換樹脂提取純化桿菌肽的工藝優(yōu)化

冷 鳳，張 煒，田 威，張雪霞*

(1.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016；2.華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司微生物藥物國(guó)家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050015)

離子交換樹脂提取純化桿菌肽的工藝優(yōu)化

冷 鳳1，2，張 煒2，田 威1*，張雪霞2*

(1.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016；2.華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司微生物藥物國(guó)家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050015)

首先比較了732、HZ016、D152、HD-2、D061、D001-CC、D296、D301等8種不同類型的離子交換樹脂對(duì)發(fā)酵液中桿菌肽的吸附和解吸效果，選出適合提取純化桿菌肽的樹脂；然后以交換容量和洗脫收率為指標(biāo)，對(duì)交換pH值、交換流速和洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，大孔強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂D061對(duì)桿菌肽的純化效果較好；最佳工藝條件為：交換pH值5.0～6.0，交換流速2.5 BV·h-1，先用0.5%氨水以流速0.5 BV·h-1洗脫2倍樹脂體積，再用3.5%氨水洗脫3倍樹脂體積，在此條件下，洗脫液中桿菌肽A含量可達(dá)66.2%，桿菌肽洗脫收率可達(dá)91%以上。所得洗脫液串聯(lián)凝膠型001X4陽離子交換樹脂柱進(jìn)行脫鹽處理，再經(jīng)過脫色、萃取、結(jié)晶、干燥等精制步驟可得到生物效價(jià)高于74 U·mg-1的醫(yī)藥級(jí)桿菌肽原料藥。該工藝簡(jiǎn)單可行，收率穩(wěn)定，純化效率高，為工業(yè)化生產(chǎn)桿菌肽奠定了理論基礎(chǔ)。

發(fā)酵液；桿菌肽；離子交換樹脂；提取純化；工藝優(yōu)化

桿菌肽(bacitracin)，又名崔西桿菌素、枯草菌肽和亞枯草菌素，是一種多肽類抗生素。桿菌肽有多種異構(gòu)體，包括桿菌肽A、A1、B1、B2、B3、C1、C2、C3、D、E、F、G等不同組分[1]，其中桿菌肽A的生物活性最高。桿菌肽最初的產(chǎn)生菌為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)[2]，目前桿菌肽主要由特雷斯氏枯草桿菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生。桿菌肽的抑菌作用較強(qiáng)，能夠較好地抑制革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)，如金黃色葡萄球菌、鏈球菌[3]。由于桿菌肽全身用藥時(shí)具有腎毒性，在臨床上應(yīng)用受到限制，僅限于治療由耐受青霉素的G+菌引起的耳、鼻、喉、眼、皮膚及口腔等局部感染[4]。美國(guó)藥典對(duì)醫(yī)藥級(jí)桿菌肽各組分含量有嚴(yán)格的規(guī)定，其中桿菌肽A含量不低于40%，桿菌肽B1、B2、B3、A含量之和不低于70%，桿菌肽F含量不高于6%。國(guó)產(chǎn)品由于達(dá)不到國(guó)外藥典標(biāo)準(zhǔn)，多用作動(dòng)物飼料添加劑，大多應(yīng)用于仔豬、生長(zhǎng)豬、種豬、肉雞、蛋雞及鴨，在牛、羊等反芻動(dòng)物以及火雞、鴕鳥等特種動(dòng)物上也可使用[5]，在水產(chǎn)動(dòng)物中也有良好的作用效果[6]。此外，桿菌肽還可用作生物表面活性劑、食品防腐劑及生物學(xué)的研究手段[7]。

國(guó)內(nèi)關(guān)于桿菌肽在畜禽飼養(yǎng)方面應(yīng)用的文獻(xiàn)較多，但是關(guān)于提取工藝方面的報(bào)道很少。郭淑琴等[8]用離子交換法提取桿菌肽，所得產(chǎn)品生物效價(jià)僅為54U·mg-1。劉詠[9]用膜分離技術(shù)精制桿菌肽鋅鹽，所得產(chǎn)品生物活性也較低。國(guó)外對(duì)桿菌肽純化工藝研究較多，有吸附法[10]、沉淀法[11]、離子交換法[12-13]和有機(jī)溶劑萃取法[14-15]等。這些方法大多存在所得產(chǎn)品生物效價(jià)低、總收率低、使用大量有毒試劑對(duì)環(huán)境造成污染等缺點(diǎn)。

作者比較了不同類型的離子交換樹脂對(duì)發(fā)酵液中桿菌肽的吸附和解吸效果，篩選出適合提取純化桿菌肽的樹脂；并通過對(duì)交換條件和洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝條件，擬為工業(yè)化生產(chǎn)桿菌肽提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

桿菌肽發(fā)酵液由華北制藥集團(tuán)研發(fā)中心發(fā)酵崗位提供。

苯乙烯系陽離子交換樹脂732、HZ016，上海華震科技有限公司；大孔弱酸型陽離子交換樹脂D152、HD-2，陰離子交換樹脂D296、D301，天津波鴻樹脂科技有限公司；大孔強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂D061、D001-CC，凝膠型陽離子交換樹脂001X4，天津南開大學(xué)樹脂廠；乙腈(色譜純)，美國(guó)Merck公司；桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品、去離子水，自制；其它試劑均為市售國(guó)產(chǎn)分析純。

pH計(jì)，梅特勒-托利多公司；循環(huán)水式多用真空泵、SXJQ-1型機(jī)械攪拌儀，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；高效液相色譜儀，日本島津公司；BS-30A型自動(dòng)收集器，上海滬西分析儀器有限公司；恒溫電磁攪拌器，上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A為0.05 mol·L-1KH2PO4和0.05 mol·L-1K2HPO4·3H2O的水溶液，B為80 mL乙腈和1 040 mL甲醇混合溶液，A∶B=40∶60(體積比)；流速：1.2 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：桿菌肽A 254 nm，桿菌肽F 300 nm。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵液的預(yù)處理

向桿菌肽發(fā)酵液中加入2%珍珠巖，攪拌10 min，真空抽濾，得桿菌肽濾液，采用HPLC法測(cè)定其效價(jià)，備用。

1.3.2 離子交換樹脂的篩選

1.3.2.1 離子交換樹脂的預(yù)處理與再生

新購(gòu)樹脂置于燒杯中，用乙醇浸泡12 h，用去離子水反復(fù)洗滌至上清液無色無異味。用4倍樹脂體積的1 mol·L-1HCl溶液浸泡4 h，傾去上清酸液，用去離子水反復(fù)洗滌至中性；再用4倍樹脂體積的1 mol·L-1NaOH溶液浸泡4 h，傾去上清堿液，用去離子水反復(fù)洗滌至中性，備用。離子交換樹脂的物理參數(shù)見表1。

表1 離子交換樹脂的物理參數(shù)

Tab.1 Physical parameters of ion exchange resins

1.3.2.2 樹脂靜態(tài)吸附率和解吸率的測(cè)定

取預(yù)處理好的8種濕樹脂各10 mL置于250 mL三角瓶中，加入120 mL桿菌肽濾液于室溫下電磁攪拌過夜，達(dá)到吸附平衡后采用HPLC法測(cè)定吸附殘液效價(jià)，計(jì)算靜態(tài)吸附率。將吸附飽和的樹脂濾去殘液，用去離子水洗滌后，分別加入3%氨水80 mL靜置過夜，取上清液測(cè)定桿菌肽效價(jià)，并計(jì)算解吸率。

1.3.2.3 樹脂D061和D001-CC的吸附動(dòng)力學(xué)曲線

取處理好的濕樹脂D061和D001-CC各10 mL置于500 mL三角瓶中，加入200 mL桿菌肽濾液于室溫下電磁攪拌，每隔10 min取樣一次，采用HPLC法測(cè)定吸附殘液效價(jià)，計(jì)算吸附率，繪制2種樹脂的吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.3.3 交換pH值的選擇

pH值是影響離子交換平衡的一個(gè)重要因素。pH值會(huì)影響溶液中物質(zhì)的帶電性，也會(huì)影響離子交換樹脂的交換容量。取7份桿菌肽濾液各200 mL，分別調(diào)節(jié)pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。取7份處理好的濕樹脂D061各10 mL，置于500 mL三角瓶中，分別加入不同pH值的桿菌肽濾液，室溫下電磁攪拌進(jìn)行交換，直至達(dá)到平衡，采用HPLC法測(cè)定吸附殘液效價(jià)，計(jì)算樹脂靜態(tài)交換容量。

1.3.4 交換流速的選擇

取5份處理好的濕樹脂D061各100 mL，裝5根相同的離子交換柱，柱子徑高比為1∶6。調(diào)節(jié)桿菌肽濾液pH值為6.0，上樣，分別控制流速為1.0 BV·h-1、1.5 BV·h-1、2.0 BV·h-1、2.5 BV·h-1、3.0 BV·h-1，當(dāng)出口液桿菌肽濃度接近上樣液濃度5%時(shí)停止上樣，計(jì)算不同流速下樹脂D061的動(dòng)態(tài)交換容量。

1.3.5 洗脫液濃度的選擇

調(diào)節(jié)桿菌肽濾液pH值為6.0，以最佳交換流速上5根D061樹脂柱至平衡。用去離子水以2.0 BV·h-1流速洗2倍柱體積，洗去水溶性雜質(zhì)和色素。分別配制濃度為0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%氨水以0.5 BV·h-1流速洗脫樹脂柱，柱底端串聯(lián)凝膠型001X4陽離子交換樹脂柱進(jìn)行脫鹽，采用HPLC法測(cè)定洗脫液中桿菌肽效價(jià)低于40 U·mL-1時(shí)停止洗脫。比較洗脫效果及洗脫收率。

1.3.6 洗脫流速的選擇

調(diào)節(jié)桿菌肽濾液pH值為5.5，以最佳交換流速上4根D061樹脂柱至平衡，用去離子水洗2倍柱體積，配制3.5%氨水，分別控制流速為0.25 BV·h-1、0.5 BV·h-1、1.0 BV·h-1、1.5 BV·h-1進(jìn)行洗脫。用自動(dòng)收集器收集洗脫液，每瓶25 mL，采用HPLC法測(cè)定洗脫液中桿菌肽效價(jià)。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子交換樹脂的篩選結(jié)果

2.1.1 樹脂靜態(tài)吸附率和解吸率測(cè)定結(jié)果(圖1)

圖1 樹脂對(duì)桿菌肽的靜態(tài)吸附率和解吸率

由圖1可知，各種類型的離子交換樹脂對(duì)桿菌肽的吸附能力和解吸能力大小順序?yàn)镈061>D001-CC>HZ016>732>D152>HD-2>D301>D296。樹脂D061和D001-CC的靜態(tài)吸附率和解吸率都較高，原因是二者都為強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂，桿菌肽易與樹脂上陽離子進(jìn)行交換，其次二者都有大孔吸附性，桿菌肽較易進(jìn)入樹脂內(nèi)部發(fā)生交換。因此，初步選擇D061和D001-CC從吸附動(dòng)力學(xué)角度做進(jìn)一步的比較。

2.1.2 樹脂D061和D001-CC的吸附動(dòng)力學(xué)曲線(圖2)

圖2 樹脂D061和D001-CC的吸附動(dòng)力學(xué)曲線

由圖2可知，D061和D001-CC的吸附率相差不大，但是D061的吸附速度比D001-CC快;而且從圖1可知D061的解吸率比D001-CC要略高一些，因此選擇樹脂D061提純發(fā)酵液中的桿菌肽。

2.2 交換pH值的確定

樹脂D061對(duì)不同pH值桿菌肽濾液的靜態(tài)交換容量見圖3。

圖3 樹脂D061對(duì)不同pH值濾液的靜態(tài)交換容量

由圖3可知，桿菌肽濾液pH值在5.0～6.0之間時(shí)，樹脂D061的靜態(tài)交換容量較高。因此，確定最佳交換pH值為5.0～6.0。

2.3 交換流速的確定

交換流速對(duì)樹脂D061動(dòng)態(tài)交換容量的影響見圖4。

圖4 交換流速對(duì)樹脂D061動(dòng)態(tài)交換容量的影響

由圖4可知，對(duì)樹脂D061而言，交換流速不超過2.5 BV·h-1時(shí)，交換流速對(duì)動(dòng)態(tài)交換容量的影響不大；流速過快(3.0 BV·h-1)，動(dòng)態(tài)交換容量明顯降低。綜合考慮，確定最佳交換流速為2.5 BV·h-1。

2.4 洗脫液濃度的確定

由于D061是大孔強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂，交換條件偏弱酸性，宜選用弱堿性的氨水作為洗脫劑[16]。不同濃度氨水的洗脫情況見表2。

由表2可知，1.5%、2.5%氨水對(duì)樹脂D061的洗脫收率低，拖尾嚴(yán)重；而4.5%氨水濃度過高，會(huì)破壞原料，收率也較低；當(dāng)氨水濃度為3.5%時(shí)，不僅解吸集中，洗脫收率還較高。另外發(fā)現(xiàn)，0.5%氨水雖然沒有解吸能力，但是可以洗下一些雜質(zhì)和色素。因此，確定解吸流程為：先用0.5%氨水洗脫2倍樹脂體積，再用3.5%氨水洗脫3倍樹脂體積。

表2 不同濃度氨水的洗脫情況

Tab.2 Elution conditions by different concentrations of ammonia

2.5 洗脫流速的確定

洗脫流速對(duì)效價(jià)影響見圖5，洗脫流速對(duì)桿菌肽A含量和洗脫收率的影響見表3。

圖5 洗脫流速對(duì)效價(jià)的影響

表3 洗脫流速對(duì)桿菌肽A含量及洗脫收率的影響

由圖5可知，洗脫流速慢，洗脫收率高，桿菌肽濃度集中；隨著洗脫流速的加快，桿菌肽濃度不集中，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。流速為0.25 BV·h-1時(shí)洗脫收率最高，解吸也最集中，但是由于流速較慢，洗下的雜質(zhì)較多，HPLC圖譜上顯示主峰純度并不好，其純化效果較流速0.5 BV·h-1要低。綜合考慮，確定最佳洗脫流速為0.5 BV·h-1。

2.6 樹脂D061提取純化桿菌肽的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照實(shí)驗(yàn)篩選出的優(yōu)化條件進(jìn)行3批50 L發(fā)酵罐的小試實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證工藝的可行性和穩(wěn)定性。用2.5 L D061樹脂柱從發(fā)酵液中提取純化桿菌肽，調(diào)節(jié)桿菌肽濾液pH值為6.0，以流速2.5 BV·h-1上樣；用5 L去離子水洗滌樹脂柱，用0.5%氨水以洗脫流速0.5 BV·h-1洗脫2倍樹脂體積，用3.5%氨水洗脫3倍樹脂體積；洗脫液串聯(lián)凝膠型001X4陽離子交換樹脂柱進(jìn)行脫鹽，再經(jīng)過脫色、萃取、結(jié)晶、干燥等后續(xù)精制步驟，得到桿菌肽原料藥粉末，測(cè)定其生物效價(jià)。計(jì)算洗脫收率和提取總收率，結(jié)果見表4。

表4 小試工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

Tab.4 Verification experiment results of lab scale process(n=3)

由表4可知，采用樹脂D061提取純化桿菌肽，在最佳工藝條件下，洗脫收率可達(dá)91%以上，所得終產(chǎn)品生物效價(jià)超過74 U·mg-1，提取總收率超過60%。

3 結(jié)論

采用大孔強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂D061提取純化桿菌肽發(fā)酵液，確定最佳交換條件為：桿菌肽濾液pH值5.0～6.0，流速2.5 BV·h-1；最佳洗脫條件為：先用0.5%氨水以流速0.5 BV·h-1洗脫2倍樹脂體積，再用3.5%氨水洗脫3倍樹脂體積。HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，面積歸一化法計(jì)算洗脫液中主峰桿菌肽A的含量可達(dá)66.2%，達(dá)到純化目的，洗脫收率可達(dá)91%以上，所得終產(chǎn)品的生物效價(jià)超過74 U·mg-1，物料體積縮小5～7倍，大大節(jié)省后續(xù)精制步驟中有機(jī)溶劑的使用量，為桿菌肽的精制打下基礎(chǔ)，也為工業(yè)化生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)桿菌肽原料藥提供理論依據(jù)。

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Optimization in Extraction and Purification of Bacitracin by Ionic Exchange Resin

LENG Feng1,2,ZHANG Wei2,TIAN Wei1*,ZHANG Xue-xia2*

(1.ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China;2.NewDrugResearch&DevelopmentCompanyofNCPC,NationalEngineeringResearchCenterofMicrobialMedicine,HebeiIndustryMicrobialMetabolicEngineering&TechnologyResearchCenter,Shijiazhuang050015,China)

Wefirstlycomparedtheadsorptionanddesorptionefficienciesofeightkindsofionicexchangeresins，namely732,HZ016,D152,HD-2,D061,D001-CC,D296,andD301onbacitracininfermentationbroth，andselectedthesuitableresinforextractionandpurificationofbacitracin.Then,weoptimizedexchangepHvalue,exchangeflowrate,andelutionconditionsbyusingexchangecapacityandelutionyieldasindexes.ResultsshowedthatmacroporousstrongacidcationexchangeresinD061wasthebestonetoextractandpurifybacitracin.Theoptimalprocessconditionswereasfollows:exchangepHvaluewas5.0～6.0,exchangeflowratewas2.5BV·h-1,eluting2timesoftheresinvolumewith0.5%ammoniawithflowrateof0.5BV·h-1firstly,theneluting3timesoftheresinvolumewith3.5%ammonia.Underaboveconditions,thecontentofbacitracinAineluentreached66.2%,andelutionyieldreachedover91%.Afterdesalinationbygeltypecationexchangeresin001X4,andfollowingpurificationstepssuchasdecolorization,extraction,crystallization,anddrying,weobtainedpharmaceuticalgradebacitracinwiththetiterof74U·mg-1.Theprocessiseasyandfeasiblewithstableyieldandhighpurificationefficiency,whichlaysatheoreticalfoundationforindustrialproductionofbacitracin.

fermentationbroth;bacitracin;ionicexchangeresin;extractionandpurification;processoptimization

河北省科技條件建設(shè)項(xiàng)目(169676404G)

2017-04-25

冷鳳(1981-)，女，黑龍江海林人，工程師，研究方向：微生物來源藥物的分離、純化、結(jié)晶，E-mail：214824557@qq.com；通訊作者：田威，副教授，E-mail：tianweiww@sina.com；張雪霞，教授級(jí)高級(jí)工程師，E-mail：zhangxuexiazxx@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.08.013

TQ028

A

1672-5425(2017)08-0063-05

冷鳳，張煒，田威，等.離子交換樹脂提取純化桿菌肽的工藝優(yōu)化[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(8)：63-67.