豆渣固定化培養(yǎng)乳酸菌的條件優(yōu)化及其對乳酸菌的保護(hù)作用

夏秀東,劉小莉,王 英,李愛茹,周劍忠*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇 南京 210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院,江蘇 南京 210095)

豆渣固定化培養(yǎng)乳酸菌的條件優(yōu)化及其對乳酸菌的保護(hù)作用

夏秀東1,劉小莉1,王 英1,李愛茹2,周劍忠1*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇 南京 210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院,江蘇 南京 210095)

以豆渣為乳酸菌固定化載體,利用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對影響乳酸菌固定化培養(yǎng)的3個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化,同時(shí)研究了體外模擬消化系統(tǒng)脅迫對發(fā)酵豆乳中活乳酸菌數(shù)量的影響。結(jié)果表明：固液比1∶40、接種量3%、培養(yǎng)時(shí)間24 h為豆渣固定化培養(yǎng)乳酸菌的最佳條件,在此組合條件下豆渣載體上固定吸附的最大活菌數(shù)為1.07×1010cfu/g;經(jīng)體外模擬胃腸消化系統(tǒng)后,豆渣固定化乳酸菌發(fā)酵豆乳中的活菌數(shù)顯著高于游離乳酸菌發(fā)酵豆乳中的活菌數(shù)。說明豆渣可以作為一種新型固定化乳酸菌的材料,且能夠增強(qiáng)乳酸菌對消化系統(tǒng)脅迫的抵抗能力。

豆渣;固定化;乳酸菌;條件優(yōu)化;胃腸道脅迫

豆渣是豆腐、豆奶等豆制品生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物,富含膳食纖維、蛋白質(zhì)、脂肪、糖類和異黃酮等營養(yǎng)物質(zhì)和功能性成分,因其富含營養(yǎng)物質(zhì)、無色無味而可以作為功能性食品被利用[1]。有多項(xiàng)研究表明豆渣具有減肥、抗氧化、降血脂、降血壓、維持腸道菌群平衡等功效[2]。每加工1 t大豆就有2～3 t豆渣產(chǎn)生,我國每年有超過2800萬t豆渣產(chǎn)生[3]。目前豆渣還沒有得到充分利用,只有一少部分被用作飼料和肥料,絕大部分被丟棄,這不僅造成資源的浪費(fèi)，而且還因隨意堆放和丟棄造成環(huán)境污染。

聯(lián)合國糧農(nóng)組織定義益生菌為達(dá)到一定數(shù)量時(shí)對宿主健康有益的微生物,其中乳酸菌是最常見的益生菌。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)益生菌數(shù)量達(dá)到106以上時(shí)才能對人體健康產(chǎn)生顯著效果[4]。然而,多數(shù)益生菌在經(jīng)過消化系統(tǒng)時(shí),由于受到消化道的機(jī)械、強(qiáng)酸、酶解以及抑菌殺菌成分的脅迫的影響而無法起到益生效果,因此,如何讓益生菌安全到達(dá)腸道且定殖成為現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)之一。細(xì)胞固定化技術(shù)是一種將游離細(xì)胞通過物理或化學(xué)的方法控制在某一特定區(qū)域內(nèi),起到保護(hù)細(xì)胞,穩(wěn)定或提高其活性且有利于反復(fù)使用的技術(shù)[5]。其利用的原理是應(yīng)用物理或化學(xué)的方法將活細(xì)胞以很高的密度固定于特定載體上,以形成高密度的和高活性的生物催化系統(tǒng)。固定化細(xì)胞往往具有細(xì)胞密度高、催化活力強(qiáng)、可重復(fù)利用、抗逆性較強(qiáng)等特點(diǎn)[6-7]。固定化載體的選擇非常重要,應(yīng)該具有比較大的表面積、易重復(fù)利用、操作穩(wěn)定性強(qiáng)、可增強(qiáng)固定化細(xì)胞的生物活性、孔隙度易于控制、固定化的過程簡單易行和安全、不影響產(chǎn)品的質(zhì)量等特點(diǎn)[9]。

我們以豆渣為植物乳桿菌的固定化載體,對細(xì)胞固定化過程中的培養(yǎng)時(shí)間、固液比、接種量進(jìn)行了優(yōu)化,并研究了固定化乳酸菌發(fā)酵豆乳中的乳酸菌對消化系統(tǒng)脅迫的抗逆性,旨在為以豆渣為載體的細(xì)胞固定化研究及其應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和黃豆 植物乳桿菌70810，由本實(shí)驗(yàn)室分離自泡菜;黃豆，購于蘇果超市。

1.1.2 MRS液體培養(yǎng)基 其配方為蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸鈉5.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、K2HPO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、吐溫80 1.0 mL、蒸餾水1000 mL,其pH值為6.2～6.4；在121 ℃下滅菌20 min。

MRS固體培養(yǎng)基:在MRS液體培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 高速粉碎機(jī)，購自天津市賽斯特儀器有限公司;恒溫鼓風(fēng)干燥箱，購自上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，購自常州國華電器有限公司;DS-1型高速組織搗碎機(jī)，購自上海標(biāo)本模型廠;蒸汽消毒器，購自上海三申醫(yī)療器械有限公司;雙人超凈工作臺，購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;1/1000電子天平，購自浙江凱豐集團(tuán)有限公司; LRH系列生化培養(yǎng)箱，購自上海一恒科技有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 豆渣固定化植物乳桿菌

1.2.1.1 豆渣的預(yù)處理 預(yù)處理流程[10]如下:黃豆經(jīng)自來水清洗后以豆水比為1∶8的比例浸泡過夜；用豆?jié){機(jī)磨碎后再用紗布過濾，得到豆渣；用清水清洗豆渣5～6次，直至水清,于70 ℃干燥箱中烘干至恒重；用高速粉碎機(jī)將豆渣進(jìn)一步粉碎，過120～140目篩,用自封袋封口，保存后-20 ℃條件下，備用。

1.2.1.2 植物乳桿菌70810的活化 將保存于-80 ℃、甘油管中的植物乳桿菌取出，于冰上緩慢解凍,然后滅菌；用接種環(huán)蘸取菌種于MRS固體培養(yǎng)基上劃線,于33 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h；將活化后的細(xì)菌再進(jìn)行1～2次活化,然后挑取單克隆于液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。

1.2.1.3 植物乳桿菌的固定化 稱取適量已經(jīng)處理好的豆渣，加入MRS液體培養(yǎng)基中,于121 ℃滅菌鍋中滅菌20 min;將活化好的植物乳桿菌以一定的體積分?jǐn)?shù)接種到含豆渣的MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行固定化培養(yǎng)；待固定化過程結(jié)束后將含有固定化植物乳桿菌的豆渣用無菌水清洗至水清,瀝干其中的水分,待用[11-12]。

1.2.2 超聲篩選實(shí)驗(yàn)[13-14]取1 g含有固定化植物乳桿菌的豆渣，加入到20 mL (0.85%)無菌生理鹽水中,設(shè)定不同功率、不同溫度、不同處理時(shí)間，對固定于豆渣上的植物乳桿菌進(jìn)行超生脫落實(shí)驗(yàn)；最后采用梯度稀釋的方法對細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3 培養(yǎng)時(shí)間、固液比和接種量對豆渣固定活菌數(shù)的影響 將活化細(xì)菌以2%的接種量接種到豆渣和MRS培養(yǎng)基比例為1∶20的培養(yǎng)基中,于33 ℃恒溫箱中分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h，然后取樣,進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù),獲取最佳培養(yǎng)時(shí)間。

將活化細(xì)菌以2%的接種量接種于豆渣與MRS比例分別為1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100的培養(yǎng)基中,在33 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù),獲取最佳固液比。

將活化細(xì)菌以1%、2%、3%、4%、5%的接種量分別接種到豆渣與MRS比例為1∶50的培養(yǎng)基中,于33 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù),獲得最佳接種量。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化設(shè)計(jì) 正交實(shí)驗(yàn)各因素及其水平的選取如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素及其水平

1.2.5 發(fā)酵豆乳的制備[15]分別將豆渣固定化的和游離的植物乳桿菌70810在4 ℃條件下以12000×g的轉(zhuǎn)速離心15 min,將沉淀接種于1.2.1.1中制備的豆乳中,于37 ℃條件下培養(yǎng)至豆乳凝固。

1.2.6 體外模擬消化系統(tǒng)脅迫實(shí)驗(yàn) 體外模擬胃腸道消化系統(tǒng)的方法參照Rui等[16]的方法。模擬消化系統(tǒng)的食物、唾液、胃液、膽汁和胰液的質(zhì)量比為2.5∶1∶1∶1∶1,利用HCl和NaOH調(diào)節(jié)模擬消化系統(tǒng)的pH值。將25 g發(fā)酵豆腐加入10 mL α-淀粉酶溶液中(0.2 mg/20 mmol/L磷酸緩沖液, pH 7.0),均質(zhì)后置于37 ℃搖床(55 r/min)中模擬口腔消化3 min。將模擬口腔消化后的溶液用HCl將pH調(diào)節(jié)為2.0,加入15 mL含胃蛋白酶的模擬胃液(3.2 mg/0.1 mol/L HCl),于37 ℃、55 r/min的搖床中消化60 min。然后,用NaOH調(diào)節(jié)樣品pH為7.0,加入10 mL膽酸和胰液(0.4 mg/10 mmol/L磷酸緩沖液, pH 7.0),于37 ℃、150 r/min的搖床中消化120 min。分別取未消化樣品(P0)、模擬口腔消化樣品(P1)、模擬胃液消化1、5、20、60 min樣品(P2)和模擬腸道消化1、5、30、120 min樣品(P3)進(jìn)行分析。利用稀釋平板法統(tǒng)計(jì)各樣品中活乳酸菌數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析，應(yīng)用SPSS 10軟件進(jìn)行作圖和one-way ANOVA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波對豆渣載體上活菌脫落的影響

利用超聲波的“空化”效應(yīng)是將固定化細(xì)胞從載體上脫落下來最常用的方法之一,這一方法簡單易行。但是超聲的功率、時(shí)間、初始溫度等會顯著影響細(xì)菌脫落的效果和活細(xì)菌數(shù),因此要對超聲條件進(jìn)行優(yōu)化[17]。由圖1可以看出,隨著超聲波的功率增加、超聲溫度升高和超聲時(shí)間延長，從豆渣上脫落下來的活菌數(shù)均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。這主要是因?yàn)槌暪β实?、初始溫度低、超聲處理時(shí)間短時(shí)細(xì)菌脫落不充分,而超聲功率過高、初始溫度過高、超聲時(shí)間過長則會導(dǎo)致細(xì)菌破裂死亡。綜合考慮各因素，功率160 W、時(shí)間10 min、初始溫度20 ℃為最佳超聲條件。

圖1 超聲條件對固定化乳酸菌脫落效果的影響

2.2 培養(yǎng)時(shí)間、固液比和接種量對豆渣固定活菌數(shù)的影響

培養(yǎng)時(shí)間、固液比和接種量是影響細(xì)胞固定化最重要的3個(gè)因素。由圖2結(jié)果可見：隨著固液比和接種量的增加，固定化細(xì)胞數(shù)并未出現(xiàn)一直增加的趨勢,而是當(dāng)固液比和接種量增加到一定程度后固定化細(xì)胞數(shù)維持在一個(gè)相對穩(wěn)定的水平；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,豆渣固定化細(xì)菌數(shù)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。這可能是由于隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)被消耗,再加上細(xì)菌密度過高后抑制細(xì)菌生長的物質(zhì)積累，導(dǎo)致細(xì)菌生長受到限制甚至解體死亡。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間、固液比和接種量對豆渣固定活菌數(shù)的影響

2.3 固定化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可見：3個(gè)因素對固定化效果的影響大小為固定化時(shí)間(C)>接種量(A)>固液比(B)；豆渣固定化植物乳桿菌的最佳條件為A2B2C1,即接種量為3%,豆渣與MRS比例為1∶40,培養(yǎng)時(shí)間為12 h。綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將最佳培養(yǎng)時(shí)間延長至24 h，其他最佳條件不變。按修改后的最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，得到的豆渣載體上吸附固定的活菌數(shù)為1.07×1010cfu/g,這一結(jié)果高于表2中任何一個(gè)正交處理組合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.4 消化系統(tǒng)脅迫對發(fā)酵豆乳中乳酸菌的影響

為了研究游離和豆渣固定化乳酸菌發(fā)酵豆乳中植物乳桿菌70810對消化系統(tǒng)脅迫的耐受能力,對兩種發(fā)酵豆乳在模擬口腔、胃液和腸道的條件下進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示：在未消化階段(P0階段)，游離和豆渣固定化發(fā)酵豆乳中植物乳桿菌70810的數(shù)量分別為(9.11±0.13)和(9.15±0.17)log cfu/mL,兩者間沒有顯著性差異；經(jīng)口腔消化(P1)后，游離和豆渣固定化乳酸菌發(fā)酵豆乳中的植物乳桿菌70810數(shù)量分別為(9.13±0.15)和(9.10±0.21) log cfu/mL,與P0階段的沒有顯著性差異,說明口腔消化對游離和固定化植物乳桿菌數(shù)量沒有顯著影響。

表2 固定化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

經(jīng)胃液消化1 min后，游離和豆渣固定化乳酸菌發(fā)酵豆乳中的植物乳桿菌70810數(shù)量均較P1階段顯著減少,且后者的減少幅度更大；隨著消化時(shí)間的延長，游離乳酸菌發(fā)酵豆乳中植物乳桿菌70810數(shù)量的減少速度明顯高于豆渣固定化乳酸菌發(fā)酵豆乳中的；經(jīng)模擬胃液消化60 min后,游離乳酸菌發(fā)酵豆乳中植物乳桿菌70810數(shù)減少到(6.11±0.15)log cfu/mL,比P1階段結(jié)束時(shí)減少了2.08 log cfu/mL,而豆渣固定化乳酸菌發(fā)酵豆乳中植物乳桿菌70810數(shù)量仍達(dá)(7.47±0.13)log cfu/mL,與P1階段相比僅減少了0.93 log cfu/mL。

經(jīng)腸道消化(P3)后，發(fā)酵豆乳中的植物乳桿菌70810數(shù)進(jìn)一步減少,消化1 min后游離乳酸菌發(fā)酵豆乳中的植物乳桿菌70810數(shù)減少了1.03 log cfu/mL,明顯高于豆渣固定化乳酸菌發(fā)酵豆乳中植物乳桿菌70810的減少數(shù)(0.78 log cfu/mL)。隨著腸道消化時(shí)間的延長,發(fā)酵豆乳中的植物乳桿菌70810數(shù)進(jìn)一步減少,腸道消化120 min后游離乳酸菌發(fā)酵豆乳中的植物乳桿菌70810數(shù)僅為(4.05±0.13)log cfu/mL,而豆渣固定化乳酸菌發(fā)酵豆乳中的植物乳桿菌70810數(shù)為(6.11±0.15)log cfu/mL,比前者高2.06 log cfu/mL。

3 討論

豆渣是生產(chǎn)豆奶、豆腐等大豆制品剩余的農(nóng)副產(chǎn)品,含有50%～55%的膳食纖維。豆渣比表面積較大,有利于菌體吸附;豆渣的機(jī)械強(qiáng)度高,為細(xì)菌在其上的生長繁殖和最終的固定化提供了優(yōu)良的載體;豆渣的吸附性很強(qiáng),可在其表面吸附大量的菌體,有利于形成高密度的菌體環(huán)境;豆渣來源廣泛,價(jià)格低廉,可降低生產(chǎn)成本;豆渣孔隙豐富,有利于發(fā)酵傳質(zhì)。植物乳桿菌在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素、雙乙酰、胞外多糖等有益于人體健康的代謝產(chǎn)物,這些物質(zhì)可以增強(qiáng)人體免疫力,改善人體腸道菌群,具有抗菌、消炎、抗癌、降低膽固醇、降血脂等功效[19-20]。而豆渣固定化植物乳桿菌所形成的高菌密度和高酶活性必然會增強(qiáng)這些有益功效,所以豆渣作為益生菌的固定化載體有著廣闊的應(yīng)用前景[21]。

表3 體外模擬胃腸道消化脅迫對發(fā)酵豆乳中乳酸菌數(shù)量的影響

注：P0為未消化階段;P1為模擬口腔消化階段;P2為模擬胃液消化階段;P3為模擬腸道消化階段。同列數(shù)據(jù)后不同的小寫字母代表處理間存在顯著性差異。

胃液的酸度是影響益生菌進(jìn)入腸道前最主要的影響因素。表3結(jié)果顯示,經(jīng)模擬胃液消化后游離和豆渣固定化乳酸菌發(fā)酵豆乳中的植物乳桿菌70810數(shù)在很短的時(shí)間內(nèi)(5 min內(nèi))急劇減少,爾后減少速度有所減緩,但是豆渣固定化乳酸菌發(fā)酵豆乳中的植物乳桿菌70810數(shù)始終顯著高于游離乳酸菌發(fā)酵豆乳中的。膽酸和胰液是影響益生菌進(jìn)入腸道后活性的另外兩個(gè)重要因素。在本實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)模擬腸道消化后，游離和豆渣固定化乳酸菌發(fā)酵豆乳中的植物乳桿菌70810活菌數(shù)在短時(shí)間內(nèi)急劇減少,爾后持續(xù)減少,但是含固定化乳酸菌的發(fā)酵豆乳中的活菌數(shù)均顯著高于游離乳酸菌發(fā)酵豆乳中的活菌數(shù)。以上結(jié)果與Sidira等和Mokarram等的研究結(jié)果一致,這是因?yàn)楣潭ɑ牧蠈σ嫔斜Ｗo(hù)作用[22-23]。

4 結(jié)論

固定化載體對細(xì)胞的固定作用受培養(yǎng)時(shí)間、固液比、接種量等因素的影響。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為24 h,固液比為1∶40,接種量為3%時(shí)豆渣載體上固定吸附的活菌數(shù)最多,為1.07×1010cfu/g。豆渣固定化植物乳桿菌70810有著更強(qiáng)的抵抗逆境的能力,從而能更好地發(fā)揮其益生效果。

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[23] Mokarram R R, Mortazavi S A. The influence of multi stage alginate coating on survivability of potential probiotic bacteria in simulated gastric and intestinal juice 422 [J]. Food Research International, 2009, 42(8): 1040-1045.

(責(zé)任編輯:黃榮華)

Optimization of Conditions for Immobilized Culture and Protection of Lactic Acid Bacteria on Soybean Dreg (Okara)

XIA Xiu-dong1, LIU Xiao-li1, WANG Ying1, LI Ai-ru2, ZHOU Jian-zhong1*

(1. Institute of Agro-product Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Soybean dreg (okara) was used as the carrier for the immobilized culture of lactic acid bacteria (LAB), three factors affecting the immobilized culture of LAB were optimized through single-factor test and orthogonal experiment, and the effects of simulated in-vitro digestion system stress on the quantity of live LAB in fermented soymilk were also studied. The optimum conditions for the immobilized culture of LAB on okara were obtained as follows: solid-liquid ratio 1∶40, inoculum size 3%, and culture time 24 h. Under these optimum conditions, the maximum quantity of live LAB immobilized and adsorbed by okara was 1.07×1010cfu/g. Meanwhile, under the stress of simulated in-vitro stomach and intestine digestion system, the quantity of live LAB in the fermented soymilk inoculated with okara-immobilized LAB was significantly higher than that in the fermented soymilk inoculated with free LAB. The above results indicate that okara can be used as a new-type material to immobilize LAB, and it can strengthen the resistance of LAB to digestion system stress.

Okara; Immobilization; Lactic acid bacteria; Condition optimization; Gastrointestinal stress

2017-05-27

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(31501460)。

夏秀東(1985─),男,博士,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。*通訊作者:周劍忠。

Q939.117

A

1001-8581(2017)09-0089-05