實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四種病原體多重PCR方法的建立與應(yīng)用

祝巖波，徐增年，魏世錦，鄭 龍，尤紅煜，孟鈺榕，劉福英，梁曉亮，王俊霞*

技術(shù)方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物四種病原體多重PCR方法的建立與應(yīng)用

祝巖波1，徐增年1，魏世錦2，鄭 龍1，尤紅煜1，孟鈺榕1，劉福英1，梁曉亮3，王俊霞1*

多殺巴氏桿菌(Pasteurellamultocida)、支氣管鮑特桿菌(Bordetellabronchiseptica)、支原體(Mycoplasmapneumoniae)和肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的常見(jiàn)病原微生物，能引起許多哺乳動(dòng)物呼吸系統(tǒng)的隱性感染甚至死亡[1]。近幾年實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，以上四種病原微生物陽(yáng)性時(shí)有發(fā)生[2-4]。目前我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物等級(jí)及監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為多殺巴氏桿菌(GB/T 14926.5-2001)，支氣管鮑特桿菌(GB/T 14926.6-2001)，支原體(GB/T 14926.8-2001)，肺炎克雷伯桿菌(GB/T 14926.13-2001)。上述四種病原微生物采用的檢測(cè)方法是傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定方法，此種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且實(shí)驗(yàn)人員需要具備較高的專業(yè)素質(zhì)，因此急需建立一種更為簡(jiǎn)便，快速的檢測(cè)方法。目前分子生物學(xué)方法對(duì)于細(xì)菌、病毒的檢測(cè)已得到廣泛應(yīng)用，四種病原微生物的單一PCR方法已有報(bào)道，但同時(shí)檢測(cè)四種病原微生物的方法尚未建立[6，8-15]，本研究建立了能夠同時(shí)檢測(cè)上述四種病原微生物的多重PCR方法并且完成初步應(yīng)用，為其快速檢測(cè)和診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

本實(shí)驗(yàn)所用肺支原體(NCTC10540)由中國(guó)食品藥品檢定研究院惠贈(zèng)，多殺巴氏桿菌(K8123)購(gòu)自溫州康泰生物科技有限公司，支氣管鮑特桿菌(CGMCC1.2418)購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心，肺炎克雷伯桿菌(CMCC46117)購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心。金黃色葡萄球菌(ATCC6538)由石家莊市疾控中心惠贈(zèng)。乙型溶血性鏈球菌(CMCCB32210)、乙型副傷寒沙門氏菌(CMCCB50094)、大腸埃希菌(CMCC44102)、肺炎鏈球菌(CMCCB31001)購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.1.2 動(dòng)物樣本

隨機(jī)抽檢河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和山西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心45只清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的氣管及分泌物和鼻棉拭子，其中包含20只小鼠，5只大鼠，10只兔，5只豚鼠，5只地鼠，動(dòng)物購(gòu)買后于開(kāi)放環(huán)境中飼養(yǎng)數(shù)日。

1.1.3 引物

根據(jù)多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體和肺炎克雷伯桿菌的特異性區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，引物基因、引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度和文獻(xiàn)出處見(jiàn)表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 主要試劑與儀器

DHL瓊脂平皿，血瓊脂平皿，支原體培養(yǎng)基，均購(gòu)自北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生物有限公司；細(xì)菌生化鑒定管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；Mix購(gòu)自康為世紀(jì)；Tris購(gòu)自Solarbio公司；DNA Ladder購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖Agarose購(gòu)自BIOWEST公司；核酸染料ExRed購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；支原體ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自蘇州西山生物技術(shù)有限公司。

表 1 引物序列

再鑫儀器有限公司生物安全柜；上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；NanoDrop 基因公司ND-1000 Spectrophotometer；美國(guó)UVPGDS-8000凝膠成像系統(tǒng)；北京君意東方電泳設(shè)備有限公司JY600E電泳儀；美國(guó)GeneAmp 9700PCR；德國(guó) Heraeus高速冷凍離心機(jī)；無(wú)錫縣電化教具廠JLQ-S1菌落計(jì)數(shù)器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌DNA的提取

多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體和肺炎克雷伯桿菌四株標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇培養(yǎng)后，用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒按照使用說(shuō)明提取基因組DNA。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，測(cè)取各菌株的濃度，并將各菌株濃度稀釋為10 ng/μL。

1.3.2 氣管分泌物和鼻棉拭子DNA的提取

將動(dòng)物氣管浸泡在酵母浸出液中，或?qū)⒈敲奘米优菰诮湍附鲆褐姓鹗?，其余按天根?xì)菌基因組DNA提取試劑盒使用說(shuō)明提取基因組DNA。

1.3.3 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括：Mix 25 μL，引物濃度分別為多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體和肺炎克雷伯桿菌0.2 μmol/L，DNA各10 ng。反應(yīng)條件為94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共30 個(gè)循環(huán); 72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物在2.5% 瓊脂糖凝膠中，120 V 電泳30 min。

1.3.4 特異性檢測(cè)

用所建立的多重PCR體系分別擴(kuò)增金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、乙型副傷寒沙門氏菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌分離株來(lái)檢測(cè)所建方法的特異性。

1.3.5 敏感性檢測(cè)

將四種病原體的DNA按1:10的比例進(jìn)行稀釋，稀釋后濃度分別為10 ng/μL,1 ng/μL,100 pg/μL,10 pg/μL,1 pg/μL,100 fg/μL，同時(shí)設(shè)置陰性空白對(duì)照，檢驗(yàn)多重PCR的敏感性。

1.3.6 應(yīng)用

用四種病原體多重PCR方法檢測(cè)5種人工感染樣本和45例實(shí)驗(yàn)動(dòng)物氣管及分泌物和鼻棉拭子。

1.3.7 血清學(xué)方法

根據(jù)肺支原體ELISA檢測(cè)試劑盒操作檢測(cè)肺支原體的感染情況。

1.3.8 傳統(tǒng)培養(yǎng)方法

取氣管分泌物和鼻咽棉拭子分別涂在血平皿培養(yǎng)36～48 h和DHL瓊脂平皿18～24 h，根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)多殺巴氏桿菌(GB/T 14926.5-2001)，支氣管鮑特桿菌(GB/T 14926.6-2001)，肺炎克雷伯桿菌(GB/T 14926.13-2001)鑒定三種病原體的感染情況。

2 結(jié)果

2.1 特異性

用建立的多重PCR方法擴(kuò)增金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、乙型副傷寒沙門氏菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌，結(jié)果顯示僅第一管擴(kuò)增目的條帶，無(wú)其他陽(yáng)性產(chǎn)物(見(jiàn)圖1)。

2.2 敏感性

四種病原微生物多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體和肺炎克雷伯桿菌多重PCR敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肺炎克雷伯桿菌DNA最低檢測(cè)質(zhì)量均為10 pg，其他三種DNA最低檢測(cè)質(zhì)量均為1 pg，見(jiàn)圖2。四種病原微生物單重PCR的敏感性結(jié)果顯示肺炎克雷伯桿菌DNA最低檢測(cè)質(zhì)量均為10 pg，其他三種DNA最低檢測(cè)質(zhì)量均為1 pg，見(jiàn)圖3。

注：(M)100 bp DNA Ladder；(1)陽(yáng)性對(duì)照;(2)金黃色葡萄球菌；(3)乙型溶血性鏈球菌；(4)乙型副傷寒沙門氏菌;(5)大腸埃希菌；(6)肺炎鏈球菌。圖1 多重PCR特異性Note.(M)100 bp DNA Ladder;(1)Positive control；(2)Staphylococcus aureus；(3)β-hemolytic streptococcus;(4)Salmonella paratyphi;(5)Escherichia coli;(6)Streptococcus pneumoniae.Fig.1 Specificity of the multiplex PCR assay

注：(M)100 bp DNA ladder；(1～6)質(zhì)量分別為10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg。圖2 多重PCR敏感性Note.(M)100 bp DNA ladder;(1～6)The quantity was of 10 ng,1 ng,100 pg,10 pg,1 pg, and 100 fg, respectively.Fig.2 Sensitivity of the multiplex PCR assay

注：(M)100 bp DNA ladder；(1～6)質(zhì)量分別為10 ng、1 ng、100pg、10 pg、1 pg、100 fg；(A)支氣管鮑特桿菌；(B)支原體；(C)多殺巴氏桿菌；(D)肺炎克雷伯桿菌。圖3 單重PCR敏感性Note.(M)100 bp DNA ladder;(1～6)The quantity was 10 ng,1 ng,100 pg,10 pg,1 pg, and 100 fg,respectively；(A)Bordetella bronchiseptica；(B)Mycoplasma pneumoniae；(C)Pasteurella multocida；(D)Klebsiella pneumoniae.Fig.3 Sensitivity of the single PCR assay

2.3 應(yīng)用

使用多重PCR方法對(duì)人工感染的氣管及分泌物DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示與預(yù)期結(jié)果一致，并無(wú)非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增(見(jiàn)圖4)；用多重PCR體系對(duì)收集的45份動(dòng)物氣管及分泌物和鼻棉拭子DNA檢測(cè)，結(jié)果顯示9只小鼠同時(shí)擴(kuò)增出多殺巴氏桿菌和肺支原體陽(yáng)性的目的條帶，1只小鼠和5只兔擴(kuò)增出多殺巴氏桿菌陽(yáng)性的目的條帶(見(jiàn)圖5)。

注：(M)100 bp DNA ladder；(1)陽(yáng)性對(duì)照;(2)陰性對(duì)照；(3)加多殺巴氏桿菌；(4)加支氣管鮑特桿菌；(5)加支原體；(6)加肺炎克雷伯桿菌；(7)加多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體和肺炎克雷伯桿菌。圖4 多重PCR的人工感染標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Note.(M)100 bp DNA ladder;(1)Positive control；(2)Negative control；(3)Pasteurella multocida；(4)Bordetella bronchiseptica；(5)Mycoplasma pneumoniae；(6)Klebsiella pneumoniae；(7)The four bacteria.Fig.4 Results of the multiplex PCR detection of artificial positive samples

3 討論

多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體和肺炎克雷伯桿菌屬我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須排除的病原微生物。目前我國(guó)以上四種病原微生物的檢測(cè)仍采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)推薦的傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法和生化鑒定。該方法經(jīng)典、準(zhǔn)確，但操作繁瑣，費(fèi)時(shí)，實(shí)驗(yàn)條件限定和檢測(cè)人員的主觀判定使得該方法各檢測(cè)室之間易出現(xiàn)結(jié)果的差異。因此急需建立一種快速、準(zhǔn)確的新檢測(cè)方法。

本研究在參考前人單重PCR研究的基礎(chǔ)上[5-7]，參照GenBank中多殺巴氏桿菌(KMT1)、支氣管鮑特桿菌(Fla)、支原體(16S rRNA)和肺炎克雷伯桿菌(phoE)的基因序列，在其高度保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，建立多重PCR體系。通過(guò)對(duì)金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、乙型副傷寒沙門氏菌、大腸埃希菌、肺炎鏈球菌的擴(kuò)增表明，本實(shí)驗(yàn)建立的PCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng)；敏感性實(shí)驗(yàn)中肺炎克雷伯桿菌DNA最低檢測(cè)質(zhì)量均為10 pg，其他三種DNA最低檢測(cè)質(zhì)量均為1 pg，多重PCR與單重PCR的敏感性結(jié)果一致，結(jié)果表明該多重PCR方法具有很高的敏感性，多重PCR不會(huì)影響其單重的敏感性。

注：(M)100 bp DNA ladder；(1)陽(yáng)性對(duì)照;(2)陰性對(duì)照；(3～12)小鼠氣管分泌物和鼻棉拭子樣本;(13～17)兔氣管分泌物和鼻棉拭子樣本。圖5 多重PCR氣管及分泌物樣本檢測(cè)結(jié)果Note.(M)100 bp DNA ladder;(1)Positive control；(2)Negative control；(3～12)Tracheal secretion and cotton swab samples of mice；(13～17)Tracheal secretion and cotton swab samples of rabbits.Fig.5 Results of the multiplex PCR detection of tracheal secretion and cotton swab samples

考慮到樣本DNA提取物可能影響多重PCR反應(yīng)特異性，本研究將多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體和肺炎克雷伯桿菌分別混入到動(dòng)物氣管及分泌物中，提取總DNA，多重PCR方法擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)摻入的病原微生物，甚至是四種全部，并且沒(méi)有非特異性擴(kuò)增。為了驗(yàn)證本方法在實(shí)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原菌檢測(cè)中的應(yīng)用性，收集河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和山西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心20只小鼠，5只大鼠，10只兔，5只豚鼠，5只地鼠，共45只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的氣管及分泌物和鼻棉拭子，提取總DNA，使用多重PCR方法檢測(cè)四種病原微生物，同時(shí)根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)方法和血清學(xué)方法做對(duì)比，結(jié)果顯示45份樣本中顯示9只小鼠同時(shí)擴(kuò)增出多殺巴氏桿菌和肺支原體陽(yáng)性的目的條帶， 1只小鼠和5只兔擴(kuò)增出多殺巴氏桿菌陽(yáng)性的目的條帶，但傳統(tǒng)方法和血清學(xué)方法并未檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果，45份樣本中多重PCR方法優(yōu)于傳統(tǒng)和血清學(xué)方法，初步驗(yàn)證本方法的可行性。本文建立的多重PCR方法旨在呼吸系統(tǒng)疾病的檢測(cè)，便于對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行長(zhǎng)期的微生物監(jiān)測(cè)，達(dá)到質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。該多重PCR方法適用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的微生物學(xué)檢測(cè)，可初步應(yīng)用于無(wú)創(chuàng)呼吸系統(tǒng)疾病、墊料、常規(guī)的病原檢測(cè)和籠具環(huán)境的檢測(cè)。鼻棉拭子取材簡(jiǎn)便，利于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)檢測(cè)的大面積的篩查。下面的工作，將進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)樣本量驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。本方法有良好的重復(fù)性，操作簡(jiǎn)單、快速，成本較低，可以在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測(cè)中進(jìn)一步應(yīng)用。

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(1.河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，石家莊 050000； 2.柏鄉(xiāng)縣中心醫(yī)院， 石家莊 050000； 3.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊 050000)

目的 建立快速檢測(cè)多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體和肺炎克雷伯桿菌4種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原體的多重PCR方法。方法 根據(jù)GenBank基因設(shè)計(jì)出特異性引物；經(jīng)過(guò)多重PCR的優(yōu)化，特異性和敏感性的檢測(cè)，建立多重PCR體系。應(yīng)用該P(yáng)CR體系檢測(cè)人工感染樣本和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的氣管分泌物，并與傳統(tǒng)方法做對(duì)比。結(jié)果 多重PCR擴(kuò)增出多殺巴氏桿菌(356 bp)、支氣管鮑特桿菌(237 bp)、支原體(266 bp)和肺炎克雷伯桿菌(142 bp)的目的條帶。肺炎克雷伯桿菌敏感性為10 pg，多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體敏感性為1 pg，特異性檢測(cè)未從其他病原菌中檢測(cè)出目的條帶。應(yīng)用建立的多重PCR體系檢測(cè)人工感染樣本的不同組合，45只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物氣管檢測(cè)出15只多殺巴氏桿菌陽(yáng)性，9只肺支原體陽(yáng)性，但傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和血清學(xué)方法未檢測(cè)出陽(yáng)性標(biāo)本。結(jié)論 本文建立的多重PCR方法操作簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)多殺巴氏桿菌、支氣管鮑特桿菌、支原體和肺炎克雷伯桿菌4種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原體的快速檢測(cè)。

多殺巴氏桿菌；支氣管鮑特桿菌；支原體；肺炎克雷伯桿菌；多重PCR

Establishment and application of a multiplex PCR assay for four pathogens in laboratory animals

ZHU Yan-bo1， XU Zeng-nian1， WEI Shi-jin2， ZHENG Long1， YOU Hong-yu1， MENG Yu-rong1， LIU Fu-ying1， LIANG Xiao-liang3， WANG Jun-xia1*
(1.Key Laboratory of Laboratory Animals, Hebei province, Department of Laboratory Animals, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China; 2. Baixiang County Central Hospital, Shijiazhuang 050000; 3.Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000)

Objective The aim of this study is to establish a multiplex polymerase chain raction (PCR) to identify of four kinds of laboratory animal pathogens:Pasteurellamultocida,Bordetellabronchiseptica,MycoplasmapneumoniaeandKlebsiellapneumoniae. Methods Specific primers were designed based on GenBank data. The multiplex PCR system was established through optimization of multiple PCR and detection of its specificity and sensitivity. This technique was used to test artificially infected samples and tracheal secretions of experimental animals (rat, mouse, guinea pig, rabbit, hamster), and comparing the detection results by this method and traditional detection test. Results Target bands ofPasteurellamultocida(356 bp),Bordetellabronchiseptica(237 bp),Mycoplasmapneumoniae(266 bp), andKlebsiellapneumoniae(142 bp) were obtained, with a detection sensitivity ofKlebsiellapneumoniaeof 10 pg, and that of Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica and Mycoplasma pneumoniae of 1 pg by this newly developed multiplex PCR assay. No target bands were observed from the non-specific pathogens of artificially infected samples. The tracheal secretions taken from 45 experimental animals (mice and rabbits) were tested with this new PCR assay, among which 15 cases ofKlebsiellapneumoniaand 9 cases ofPasteurellamultocidawere detected as positive, while all the results of traditional method and serological test were negative. Conclusions A simple, rapid, specific and highly sensitive multiplex PCR system has been successfully established.It is valuable for detection ofPasteurellamultocida,Bordetellabronchiseptica,Mycoplasmapneumoniae,andKlebsiellapneumoniaein laboratory animals.

Pasteurellamultocida;Bordetellabronchiseptica;Mycoplasmapneumoniae;Klebsiellapneumonia; Multiplex PCR

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2015BAI07B02-05)。

祝巖波(1990-)，女，碩士研究生，專業(yè)：動(dòng)物學(xué)。E-mail:787211186@qq.com

王俊霞(1962-)，女，教授，研究方向：從事微生物檢驗(yàn)。E-mail:13333011022@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0080-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.016

2016-11-28