腹壁撤退反射實驗測量方法概述

陳 穎，趙 妍，羅丹妮，黃 辰，周思遠

研究進展

腹壁撤退反射實驗測量方法概述

陳 穎，趙 妍，羅丹妮，黃 辰，周思遠*

內(nèi)臟高敏感是功能性消化不良、腸易激綜合征、功能性腹痛等功能性胃腸病的重要發(fā)病原因之一，在上述疾病動物模型的評價中，是否存在內(nèi)臟高敏感，是判斷模型成功的關(guān)鍵。目前應(yīng)用最廣的評價動物內(nèi)臟敏感性的方法為腹壁撤退反射實驗[1]，該方法通過擴張腸道，觀察動物的行為學(xué)反應(yīng)來進行評價，操作簡單易行，對模型動物傷害較小，不易對后繼的研究造成影響[2]。然而，在目前AWR實驗的實際操作中，測量方法存在標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，操作過程中的多種因素均可影響到實驗結(jié)果，可能導(dǎo)致對實驗動物內(nèi)臟敏感性的評價有誤，從而影響以內(nèi)臟高敏感為特點的動物疾病模型評估。因此本文對AWR的測量方法進行整理與分析，現(xiàn)綜述如下：

1 AWR操作的基本步驟

現(xiàn)有文獻中，AWR實驗的操作步驟大致如下：大鼠實驗前12 h[2-4]或18 h[6,7]或24 h[8,9]內(nèi)禁食不禁水，實驗前用少量乙醚麻醉大鼠，把固定在導(dǎo)管一端的氣囊經(jīng)石蠟油潤滑后，經(jīng)大鼠肛門插入一定深度，用膠布把導(dǎo)管和大鼠尾巴根部纏在一起，以固定氣囊。將大鼠放在不能轉(zhuǎn)身的透明塑料籠內(nèi)，待其適應(yīng)至完全平靜后，緩慢向氣囊內(nèi)注水或注氣以擴張腸道，分別觀察不同壓力值下腹部回縮反射，每次擴張持續(xù)一定時間，對每一壓力值進行重復(fù)測量，同時給予評分，以得分高低判斷內(nèi)臟敏感性程度。

2 不同測量方法之間的差異

2.1 擴張方式

實驗中常用的直腸擴張方式包括血壓計注氣、注射器注氣、注射器注水三種，以血壓計注氣最為常見。血壓計注氣的方式是按血壓計每10 mmHg[22,27]或5 mmHg[12,30,32]上升的速度注入空氣，這常在20,40,60,80 mmHg四個等級強度[7,10,11,13,14,16,18-20,28]的壓力下分別觀察動物的行為學(xué)反應(yīng)。注射器注氣可以將壓力表、注射器和導(dǎo)管分別經(jīng)三通管連接，由注射器注入空氣，多在20,40,60,80 mmHg[15,17,22,34]的壓力下展開觀察。另一種方法則采用注射器直接注入空氣，并在各體積下分別觀察動物的行為學(xué)反應(yīng)。注射器注水的方式多按0.2,0.4,0.6,0.8,1.2 mL[23,29]的規(guī)格依次緩慢注入生理鹽水[4,23]或26℃～28℃[4]溫水。

2.2 氣囊種類與制作方法

目前AWR實驗中使用的氣囊包括三類：橡膠指套、氣球和球囊。橡膠指套使用率最高，多采用外科醫(yī)用手套中號，選用中指段[1,3,13,14,28,30,33]。氣球多選用橡膠氣球[11-13,32]和硅油氣球[8]。以上兩種方法制作時用直尺在4.5 cm及6 cm處劃線標(biāo)記，從6 cm處剪斷，用4號手術(shù)絲線在4.5 cm標(biāo)記處與導(dǎo)管扎緊[2,3]，并用膠布加固，然后經(jīng)注氣檢測，扎口處無漏氣即可。球囊則多使用血管擴張球囊。

2.3 各實驗結(jié)果出現(xiàn)明顯差異時，所對應(yīng)的壓力值

通過對各實驗?zāi)Ｐ徒M與正常組的評價結(jié)果進行整理，我們發(fā)現(xiàn)：不同的實驗在同一擴張方式下，內(nèi)臟敏感性出現(xiàn)明顯差異時，所對應(yīng)的壓力值并不是相同的。如：經(jīng)血壓計注入空氣時，大部分實驗在40、60 mmHg[11,13,33]或20、40、60、80 mmHg[16,19,30]的壓力下，實驗結(jié)果出現(xiàn)明顯差異；若注射器、血壓計通過三通管連接，差異明顯的實驗結(jié)果所對應(yīng)的壓力值多為20、40、60、80 mmHg[18]。經(jīng)注射器直接注入空氣的方式，其評價結(jié)果在0.4 mL的壓力下表現(xiàn)出明顯差異[8]；而經(jīng)注射器注水的實驗，其結(jié)果多在0.8、1.2 mL[23]或0.2～1.0 mL[31]壓力下表現(xiàn)出明顯差異。

2.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)

目前，常用的判斷標(biāo)準(zhǔn)包括：腹部收縮[12,13,22,28,32]、AWR等級評分[1,5,7,10,11,14,18,21,31,33-36]和AWR 3分閾值[2,3,9,24-27,37-39]。腹部收縮是以大鼠腹部出現(xiàn)收縮時，所對應(yīng)的壓力或容量值為評價結(jié)果。AWR等級評分的評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，給予結(jié)直腸擴張刺激時大鼠無行為學(xué)反應(yīng)；1分，給予刺激時變得不穩(wěn)定，偶爾扭動頭部；2分，腹背部肌肉輕微收縮但腹部未抬離地面；3分，腹背部肌肉較強烈收縮并把腹部抬離地面；4分，腹部肌肉強烈收縮，腹部呈弓形并把腹部、會陰部抬離地面。為減少誤差，取相同壓力下重復(fù)評分的平均值作為該壓力下的評分值。另外，AWR 3分閾值是以大鼠腹部抬起和背部拱起為評價標(biāo)準(zhǔn)，用以評估大鼠內(nèi)臟敏感性的壓力或容量閾值。實驗中為減少誤差，不管采用何種測量方法，都多取重復(fù)測量的平均值作為最終判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 其他因素

該實驗使用導(dǎo)管以導(dǎo)尿管[1-5,8,9,25-27]為主，其余常用聚乙烯管[6,13-15,28,30,33]。導(dǎo)管直徑多數(shù)為2.7 mm[5,38]，或直接使用8F導(dǎo)尿管[2-4,9,26,27]。氣囊插入大鼠肛門的深度以6～8 cm[2,13,28,29,33,34]]居多，2 cm[18,31]次之。在每個相同壓力值下進行擴張的持續(xù)時間，絕大多數(shù)實驗為20 s[10,11,13,14,16-20]，其次為30 s[7,8,26,30-32]。每個相同壓力值的重復(fù)次數(shù)在絕大多數(shù)AWR實驗中，均為3次[2-6,9,10,34-38]。每次擴張的間隔時間，大部分實驗為4 min[19,22,30-33]，其次為5 min[2,3,12,16,20]。而氣囊插入大鼠肛門后，大鼠在容器里適應(yīng)至完全平靜的時間，在絕大多數(shù)實驗中為30 min[1,5,30-33,37]。此外，對盲觀察者的設(shè)置有具體說明的文獻和對其未提及的文獻數(shù)目相當(dāng)。其中盲觀察者人數(shù)設(shè)置少的為2人[2,6,19,32]，最多達3人[16]，其余文獻對具體數(shù)目均未作說明[3,8,12-15,33]。

3 討論

是否存在內(nèi)臟高敏感，是判斷功能性消化不良、腸易激綜合征、功能性腹痛等功能性胃腸病動物模型成功的關(guān)鍵。腹壁撤退反射評價，是目前應(yīng)用最廣的評價動物內(nèi)臟敏感性的方法，是一種包括多因素在內(nèi)的綜合操作方法，但目前鮮有較為公認(rèn)的測量細節(jié)，缺少統(tǒng)一的測量標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致AWR實驗操作不規(guī)范，進而影響內(nèi)臟敏感性評價結(jié)果的準(zhǔn)確性。

從文獻回顧的情況看，目前常用的擴張方法有以下三種：血壓計注氣、注射器注水、注射器注氣。其中使用最多的是用血壓計注入空氣，該方法的優(yōu)點體現(xiàn)在：1.操作簡便易行，方便實驗者更直觀地觀察壓力值，當(dāng)操作過程中發(fā)生漏氣時能迅速被觀察者察覺；2.氣囊內(nèi)壓力易排盡，避免了氣囊內(nèi)氣體對下一次測量的干擾。該方法的缺點在于壓力的變化受氣囊材質(zhì)和形狀的影響較大。經(jīng)注射器注水和經(jīng)注射器注入空氣的擴張方式，兩者的優(yōu)點均在于可等體積注入壓力。而注水法的缺點在于每次擴張結(jié)束時，氣囊內(nèi)的水無法排盡，可能引起對下一次測量結(jié)果的干擾。注氣法的缺點是漏氣后無法直觀發(fā)現(xiàn)，不易察覺。

而在同一擴張方式下，實驗結(jié)果出現(xiàn)明顯差異時，不同實驗者觀察到的壓力值并不相同。這種不同可能與AWR實驗整個操作過程中涉及到的多個因素密切相關(guān)。結(jié)合文獻與既往實驗研究，推測有以下幾個主要因素對不同實驗結(jié)果產(chǎn)生了干擾。

第一：氣囊的材質(zhì)和形狀。使用球囊時，實驗結(jié)果多在20、40、60、80 mmHg時表現(xiàn)出明顯差異[3,16,18]；使用橡膠氣球、橡膠外科醫(yī)用手套時，實驗結(jié)果多在40、60 mmHg時表現(xiàn)出明顯差異[11,13,19,33]；而使用硅油氣球時，該值為0.4 mL[8]。在以上四種氣囊中，球囊是聚乙烯材質(zhì)，而橡膠氣球、橡膠外科醫(yī)用手套、硅油氣球均為橡膠材質(zhì)，但三者的形狀與厚度均有差異。橡膠材料力學(xué)性質(zhì)復(fù)雜，胡斌等[40]發(fā)現(xiàn)在線性應(yīng)變階段，氣球內(nèi)部的壓強會隨著氣球體積的增大而上升，但當(dāng)壓強達到其峰值后，氣球內(nèi)部的壓強反而會隨著氣球體積的增大而減小。因此不同材質(zhì)氣球的壓強，并不都是隨著注入氣體的增多而相應(yīng)增大。不同材質(zhì)的氣球之間，隨注入的氣體量而產(chǎn)生的壓強變化存在著較大差異，故對AWR實驗結(jié)果造成的影響也不同。在直結(jié)腸擴張中，氣囊可能作為主要工具，對整個實驗的結(jié)果造成主要的影響，基于此，本團隊將在后續(xù)的研究中對不同材質(zhì)和形狀的氣囊進行實驗對比驗證，從中篩選出最適合作為氣囊的原料。

第二：插入的深度。氣囊插入肛門的深度不同，所刺激的腸道部位也不同。當(dāng)插入2 cm深時，刺激部位為直腸；插入6～8 cm時，刺激的是降結(jié)腸和直腸。大多數(shù)實驗選擇的深度為6～8 cm，即刺激結(jié)直腸部位。有研究表明，功能性胃腸病患者的腸腔內(nèi)環(huán)境，如碳水化合物吸收障礙導(dǎo)致的腔內(nèi)高滲和高酸，可能改變結(jié)直腸傳入神經(jīng)的興奮性和相對比例，從而誘發(fā)結(jié)直腸對擴張的高敏感[41]。故在AWR實驗中，刺激結(jié)直腸部位比刺激直腸部位對擴張更敏感，故選取6～8 cm更具科學(xué)性和可操作性。

第三：判斷標(biāo)準(zhǔn)。以腹部收縮為標(biāo)準(zhǔn)的評價方式，簡單直觀，但易受大鼠呼吸及排泄等生理反應(yīng)的影響，產(chǎn)生的結(jié)果存在主觀偏倚。采用AWR等級評分作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，要求實驗者熟練掌握并能準(zhǔn)確辨別出0～4分所對應(yīng)的行為學(xué)反應(yīng)，操作過程不但耗時，且反復(fù)測量易對大鼠結(jié)直腸造成傷害。AWR 3分閾值，是近年來很多學(xué)者為了避免主觀誤差，在傳統(tǒng)的AWR評價方法上進行的改良：僅以直腸擴張時大鼠腹部抬高和背部拱起這兩種比較明顯的行為特征為標(biāo)準(zhǔn)，評估大鼠的容量閾值[1,39]，該標(biāo)準(zhǔn)操作步驟簡潔，標(biāo)準(zhǔn)單一。

此外，每次擴張的持續(xù)時間、重復(fù)次數(shù)、每次擴張之間的間隔時間以及氣囊插入肛門后，大鼠在容器內(nèi)適應(yīng)至完全平靜的時間，是決定大鼠進行每次擴張時，是否處于完全平靜狀態(tài)的關(guān)鍵。若擴張時間過長，重復(fù)次數(shù)過多，間隔時間過短，則會造成大鼠恢復(fù)至平靜的時間越長，同時對大鼠造成不同程度的損傷；若擴張時間過短，重復(fù)次數(shù)過少，則不能全面準(zhǔn)確地觀察大鼠的實際反應(yīng)狀態(tài)，以上情況均會導(dǎo)致實驗結(jié)果不準(zhǔn)確。故找到以上因素起作用的最小臨界點，既可以避免由于大鼠狀態(tài)未歸于平靜的干擾，又可以節(jié)約實驗的操作時間，提高實驗效率。在實驗過程中若設(shè)置有盲觀察者，可減少主觀偏倚，使實驗結(jié)果更為客觀真實有說服力，增加了實驗設(shè)計的科學(xué)性與嚴(yán)謹(jǐn)性。

4 小結(jié)

綜上所述，建議對AWR實驗的操作方法為：大鼠實驗前12～24 h內(nèi)禁食不禁水，開始操作前用少量乙醚麻醉大鼠，將固定在8F導(dǎo)尿管一端的圓形橡膠氣球經(jīng)石蠟油潤滑后，經(jīng)大鼠肛門插入4.5 cm深，用膠布把導(dǎo)管和大鼠尾巴根部纏在一起，以固定氣囊。將大鼠放在不能轉(zhuǎn)身的透明塑料籠內(nèi)，待其適應(yīng)至平靜后，經(jīng)血壓計按10 mmHg的速度勻速加壓觀察3分閾值時對應(yīng)的壓力值。重復(fù)擴張3次，每次擴張持續(xù)20 s，取平均值作為評分值。此外，在實驗過程中操作者與評價者應(yīng)互相隔離，互不干擾，以減少主觀偏倚。對該方法的驗證將在今后的實驗中進一步深入闡釋，以期推動AWR實驗的標(biāo)準(zhǔn)化研究，形成規(guī)范的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

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(成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，成都 610075)

腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex, AWR)實驗，通過擴張腸道來評價動物的行為學(xué)反應(yīng)，是目前應(yīng)用最廣的評價動物內(nèi)臟敏感性的方法。然而，AWR實驗操作涉及因素多，目前鮮有較為公認(rèn)的操作規(guī)程。本文通過對涉及AWR實驗測量方法的文獻進行梳理，歸納出AWR操作的基本步驟，總結(jié)不同測量方法在擴張方式、氣囊種類等相關(guān)因素方面的差異，并對相關(guān)因素的具體操作提出建議，以期為后續(xù)使用該方法評價動物內(nèi)臟敏感性的研究者提供選擇方法，為實驗操作的標(biāo)準(zhǔn)化方案制定奠定必要基礎(chǔ)。

腹壁撤退反射實驗；測量方法；標(biāo)準(zhǔn)化

A summary of measurement methods for abdominal withdrawal reflex test

CHEN Ying， ZHAO Yan， LUO Dan-ni， HUANG Chen， ZHOU Si-yuan*
(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610075,China)

Abdominal withdrawal reflex (AWR) test, which evaluates the behavioral response of animals through expanding the intestinal tract, is the most widely used method to assess animal’s visceral sensitivity in recent years. However, as AWR experimental operation involves many factors, it’s hard to find a commonly recognized operating procedure. Through review of literature of AWR experimental measuring methods, this article summarizes the basic steps of AWR operation. Meanwhile, it scrutinizes the differences of various measuring methods in relevant factors, including expansion method and airbag method, with special operating suggestions to them. Hopefully, this article will provide an option to future researchers who will use this method to evaluate animal’s visceral sensitivity, and provide a necessary foundation for the standardization of the experimental operation.

Abdominal withdrawal reflex test; Measurement methods; Standardization

國家自然科學(xué)基金(81503665)。

陳穎(1991-)，女，碩士生。研究方向：循證醫(yī)學(xué)與針灸臨床療效與評價。E-mail: 343047239@qq.com

周思遠(1984-)，女，講師，博士生。研究方向：針灸治療消化系統(tǒng)疾病的效應(yīng)與機制研究。E-mail: zzsy6688@qq.com

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0089-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.018

2016-11-24