微衛(wèi)星DNA分析國內(nèi)24個近交系小鼠遺傳狀況

李銀銀，吳紹亮，王 洪，蕭曉琴，張雙悅，郭 萌，李長龍，呂建祎， 劉 欣，陳振文，杜小燕*

研究報告

微衛(wèi)星DNA分析國內(nèi)24個近交系小鼠遺傳狀況

李銀銀1，吳紹亮2，王 洪3，蕭曉琴4，張雙悅4，郭 萌1，李長龍4，呂建祎4， 劉 欣4，陳振文4，杜小燕1*

近交系小鼠具有遺傳均一性的特點，以及對各種反應(yīng)的一致性、可再現(xiàn)性、敏感性等均比較好的特點，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)各項研究中。其遺傳的同源性、穩(wěn)定性和可辨性使不同地區(qū)的研究結(jié)果具有更高的可比性。對近交系小鼠的遺傳質(zhì)量控制，直接影響著動物實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和科學(xué)性[1]。而遺傳檢測是保證實驗動物遺傳質(zhì)量的重要措施。對近交系的遺傳監(jiān)測檢測主要是通過測定其基因的純合性和表型品系內(nèi)的一致性，證實該品系是否保持原來的遺傳特性，是否發(fā)生基因突變或基因污染[2]。目前我國實驗動物遺傳檢測國標(biāo)中主要對生化位點檢測近交系遺傳狀況的方法有較為詳細的規(guī)定，對分子生物學(xué)的方法如微衛(wèi)星DNA標(biāo)記(microsatellite marker)等方法沒有推薦的位點和操作標(biāo)準(zhǔn)。微衛(wèi)星一般由1～6 bp核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成，重復(fù)10～60次左右，廣泛存在于真核細胞基因組中。平均每10 kb就出現(xiàn)一個STR(short tandem repeat)[3]。微衛(wèi)星因數(shù)量多、分布廣、多態(tài)性豐富、呈共顯性遺傳方式以及檢測快速方便等優(yōu)點而備受推崇[4]，已作為衡量人類和動物基因組整體穩(wěn)定性的良好指標(biāo)，且在近交系小鼠遺傳監(jiān)測中得到廣泛應(yīng)用。國內(nèi)關(guān)于利用微衛(wèi)星方法檢測近交系小鼠的報道也有很多，涉及到的品系包括BALB/c、C57BL6、TA1、TA2、T739、SCID、M615、C3H和DBA等，選取的微衛(wèi)星位點也從幾個至幾十個不等[5-8]。為了進一步開展近交系小鼠遺傳檢測的標(biāo)準(zhǔn)化研究，本試驗選取分布于小鼠20條染色體上的30個微衛(wèi)星位點對國內(nèi)包括常用品系和基因修飾品系共24個近交系小鼠品系進行遺傳檢測，以期對近交系小鼠微衛(wèi)星檢測技術(shù)進行較系統(tǒng)的研究，為該方法在近交系小鼠遺傳質(zhì)量檢測中的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

選取國內(nèi)較常用的近交系小鼠品系和部分基因修飾小鼠品系共24個近交系小鼠品系，分別來自北京(4家單位)、天津、上海、廣州4個地區(qū)，均為清潔級或SPF級。樣品來源、編號、品系名稱、性別及動物數(shù)目等信息見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠基因組DNA的制備

取上述24個小鼠品系動物的肝臟組織或者鼠尾0.1 g，加入DNA裂解抽提緩沖液2 mL，加入20 mg/mL蛋白酶K 20 μL，RNA酶10 μL，45℃～55℃消化過夜，酚-氯仿法提取組織DNA，沉淀后，加入TE緩沖液進行溶解。經(jīng)Nanodrop 2000 C微量分光光度計檢測吸光度A260/A280比值在1.8～2.0之間，檢測樣品合格。取DNA原液適量稀釋成50～100 ng/μL作為DNA模版，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 微衛(wèi)星位點的選擇與引物的合成

本研究所用30個微衛(wèi)星位點從相關(guān)文獻中選取[9]，位點的選擇盡量均勻分布于小鼠的1～20號染色體上，且具有較高的多態(tài)性。熒光引物委托上海生工有限公司合成。位點PCR條件前期已經(jīng)過優(yōu)化。其中30個位點名稱、引物標(biāo)記熒光名稱、等位基因數(shù)及等位基因范圍如表2中所示。

1.2.3 PCR擴增

PCR反應(yīng)體系：總反應(yīng)體系20 μL，其中：10×PCR buffer 2 μL，dNTP Mg2+plus(100 μmol/L)1.2 μL，上下游引物(100 μmol/μL)各0.1 μL，Taq 酶(5 U/μL) 0.1 μL，50～100 ng/μL基因組DNA 1 μL，雙蒸水(ddH2O)15.5 μL。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；不同位點54℃～64℃不同溫度退火30 s；72℃延伸30 s；35個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸 8 min；擴增產(chǎn)物于4℃保存。[9]

1.2.4 PCR產(chǎn)物STR掃描

擴增產(chǎn)物應(yīng)用STR掃描儀進行掃描，一次掃描可以同時掃描三個微衛(wèi)星位點，三個位點分別用三種熒光 FAM、HEX、TAMRA進行標(biāo)記[10]，這三個位點對同一個小鼠樣品的PCR擴增產(chǎn)物按照1∶3∶5 體積比混合后取1 μL上樣，進行STR掃描。

掃描結(jié)果由GeneMarker V2.2.0軟件判讀141個樣本在30個微衛(wèi)星位點的擴增片斷大小。每個位點的等位基因根據(jù)擴增片斷大小從大到小順序排列記錄為A、B、C、D等，每個樣本的基因型即可記錄為AA、BC、AC等形式。[9]

表1 24個小鼠近交品系樣品來源、編號、品系名稱、性別、數(shù)目

表2 30個微衛(wèi)星位點名稱、引物標(biāo)記的熒光名稱、在24個近交系中檢測到的等位基因數(shù)及等位基因范圍

2 結(jié)果

2.1 STR掃描結(jié)果

PCR產(chǎn)物在STR掃描儀上掃描，不同熒光標(biāo)記顯示不同顏色的掃描圖形。FAM熒光標(biāo)記的顯示出藍色峰形，HEX熒光標(biāo)記的顯示出綠色峰形，TAMRA標(biāo)記的顯示出黑色峰形。同一個DNA樣品用三個不同位點擴增的PCR產(chǎn)物即可同時檢測，在30 bp左右大小間隔。顯示如圖1。在24個近交品系中基因分型得到的等位基因數(shù)和等位基因片段大小見表2。在品系間30個位點都呈現(xiàn)了多態(tài)性，位于小鼠17號染色體上的D17Nds3位點具有10個等位基因，D6Mit102、D13Mit3、D5Mit48三個位點分別具有9、8、8個等位基因，同樣具有較高的多態(tài)性。等位基因數(shù)目最少的是D9Mit21、D4Mit23、D14Mit3等3個位點，只有2個等位基因型。

注：(A)D4Mit235位點的TAMRA標(biāo)記的峰形 圖;(B)D2Mit15位點的HEX標(biāo)記的峰形 圖;(C)D9Mit23位點的FAM標(biāo)記的峰形圖。圖1 三個不同位點不同熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物同 時檢測的峰形圖Note.(A)TAMRA of D4Mit235；(B)HEX of D2Mit15；(C)FAM of D9Mit23.Fig.1 The peak forms of PCR products in a 3-plex fluorescent-PCR of 3 loci

2.2 各品系小鼠微衛(wèi)星檢測結(jié)果

30個微衛(wèi)星位點引物對141只近交系小鼠樣本的PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)STR掃描后都出現(xiàn)了典型的波形。通過判讀STR掃描結(jié)果，對不同樣品進行等位基因分型。其等位基因分型結(jié)果如表3中所示。從表中可以看出，在24個近交品系中，有16個品系17個群體(分別是NCPC/2、db/db、615、NOD/LtJ、CBA/J、DBA/1(北京4)、129(北京3)、129(北京4)、TA1、MRL/LPR、C3H/HeJ、BALB/c、SCID、DBA/2、SCID-BG、A2A-2-B6和EGFP-B6品系，占總檢測品系數(shù)的66.7%)在30個位點上均表現(xiàn)為純合基因型，在6只樣品間呈單態(tài)性。而其余品系的9個群體(分別是 SAMP8、DBA/1(北京3)、TA2、NOD-SCID、BALB/c-NU、C57BL/6J、FVB、EYFP-B6和C系-FVB)，在個別位點上出現(xiàn)了雜合基因型，或/且在6只樣品間呈多態(tài)性，例如BALB/c-NU在D13Mit3位點上有2只動物基因型為雜合的BC型，而且在6只動物間是多態(tài)性的。

表3 24個品系30個微衛(wèi)星位點等位基因STR掃描結(jié)果

動物內(nèi)出現(xiàn)多態(tài)的品系數(shù)目Numbersofpolymorphicstrains2020203522品系StrainsD5Mit48D17Nds3D19Mit3D16Mit9D7Mit12D18Mit19D8Mit14D15Mit15D17Mit11D18Mit9位點多態(tài)數(shù)目NumbersofpolymorphiclociNCPC/2EEFFBBBBBBBBCCCCBBDD0db/dbCCGGDDDDCCDDBBAAFFAA0615CCAADDBBEEDDAAAABBBB0NOD/LtJCCJJDDDDDDBBBBDDDDDD0CBA/JBBCCDDDDBBBBBBAABBDD0SAMP8CCDDCCBBCCEEBBDDBBAA2DBA/1?北京3CC(DD)JJ(EE)DDDDCC(AA)BB(DD)BBDDDD(FF)DD19DBA/1?北京4CCJJDDDDCCBBBBDDDDDD0129?北京3GGEEBBDDEEEEAAAACCCC0129?北京4GGEEBBDDEEEEAAAACCCC0TA1DDFFAADDEEDDCCEEFFAA0TA2DD(CC)EE(JJ)DDDDAA(CC)DD(BB)BBDDFF(DD)DD19NOD?SCIDHHFFDDDDEEDDCCDDAADD1MRL/LPRAAAADDDDBBEECCDDBBDD0C3H/HeJCCBBDDCCEEAACCAABBDD0BALB/c?NUDDHHDDDDEEAC(AA+CC)AAAAEEDD2BALB/cEEHHDDDDEECCAAAAFFDD0SCIDFFIIDDDDEEAAAAAAFFDD0C57BL/6JCCEEDDAAEEDDBBAABBAA1DBA/2CCHHDDDDCCAABBDDFFDD0SCID?BGDDIIDDDDEEAAAAAAFFDD0FVBDDJJDDDDEEBBCCDDAAAA1A2A?2?B6CCEEDDAAEEDDBBBBBBAA0EGFP?B6BBEEDDAAEEDDBBAABBAA0EYFP?B6CCEEDDAAEEDDBBAABBAA1C系?FVBDDJJDDDDEEBBCCEEAAAA1動物內(nèi)出現(xiàn)多態(tài)的品系數(shù)目Numbersofpolymorphicstrains2200230020

注：AA(CC)表示多態(tài)位點，括號內(nèi)為多態(tài)等位基因型；基因型前面的數(shù)字表示多態(tài)樣品數(shù)目，沒有數(shù)字表示只有一個多態(tài)樣品。

Note. AA(CC) means the polymorphic loci and the letters between the brackets represent the polymorphic alleles. The number before allele represents the times that polymorphic loci occurs. No number after allele means only one sample is polymorphic.

3 討論

目前使用微衛(wèi)星位點對小鼠遺傳檢測的研究較多，張樹輝等[11]用42個位點對9種近交系小鼠DNA的多態(tài)性進行了研究，謝建云等[12]用24個位點檢測14個品系近交系小鼠，王洪等[5]用20個位點檢測11種近交系小鼠，結(jié)果都證實了分子遺傳標(biāo)記比生物化學(xué)法更準(zhǔn)確、可靠，可用于常規(guī)檢測近交系小鼠遺傳質(zhì)量[13]。與已有研究相比，本實驗所選的微衛(wèi)星位點數(shù)和檢測的近交系品系數(shù)量均比較多，而且本研究用的30個微衛(wèi)星位點，分布在小鼠的1～20號染色體上，在本實驗中對近交系小鼠進行檢測的結(jié)果說明，能夠較好的反映近交系小鼠的遺傳特性。在這30個微衛(wèi)星基因位點上，共檢測到135條條帶，即135個等位基因型，比用封閉群檢測得到的等位基因型數(shù)量少[9]，但是等位基因片段的范圍有所擴大，如在D6Mit102位點由131～177擴大到123～173片段大小。

從理論上講，品系間多態(tài)性越好的位點越適合進行品系鑒定，從表3的結(jié)果也可以看出，用這30個位點可以對24個品系進行區(qū)分，如用D6Mit102位點就可以將FVB、TA1、NOD/LtJ、C57BL/6J、MRL/LPR、SAMP8、BALB/c、NOD-SCID、C3H/HeJ等9種品系從分子水平進行鑒定，因為這些品系在該位點具有特有的基因型。用具有10個等位基因型的D17Nds3位點也可以對多個品系進行鑒定。即使對基因修飾動物與背景動物也可以用這微衛(wèi)星進行鑒別，例如以3個基因修飾近交品系A(chǔ)2A-2-B6、EGFP-B6、EYFP-B6在D13Mit3和D6Mit8這兩個位點的基因型和背景品系C57BL/6J不同，由此將它們和背景動物區(qū)分開來。

從位點特性分析的結(jié)果顯示，有一些位點是容易發(fā)生突變或呈現(xiàn)多態(tài)性的，有20個位點在至少1個品系的動物間出現(xiàn)了多態(tài)性，最高的為D7Mit281位點，在5個品系動物間均出現(xiàn)了多態(tài)性的特征，分別是FVB、C系-FVB、TA2、DBA/1(北京3)、C57BL/6J。其次是D6Mit102和D13Mit3位點分別在4個品系的動物間出現(xiàn)了多態(tài)性的特征，D6Mit9和D18Mit19兩個位點分別在3個品系的動物間出現(xiàn)了多態(tài)性的特征，這些位點在用微衛(wèi)星進行近交系遺傳質(zhì)量檢測時要引起注意和適當(dāng)選擇。

本研究所用30個微衛(wèi)星位點是本團隊進行封閉群小鼠群體遺傳分析時篩選到的位點[9]，從表3中可以看出，在24個所檢測的品系(來源于26個群體)中，大多數(shù)品系內(nèi)的6只動物間都保持了單一基因型的特征，但是有幾個品系在品系內(nèi)有兩個基因型，出現(xiàn)同一品系內(nèi)部存在多態(tài)性的結(jié)果，表明該品系在保種育種過程中可能出現(xiàn)基因污染，或傳代過程中可能發(fā)生變異。如TA2和DBA/1(北京3)在多個位點上是多態(tài)的，且這兩個品系中都是同一只動物出現(xiàn)多態(tài)的等位基因型，表明這品系內(nèi)的這只動物可能發(fā)生了遺傳突變或基因污染。因此，在篩選微衛(wèi)星位點進行小鼠遺傳檢測時，要綜合考慮近交系動物本身的特征來進行選擇。在以B6為背景的突變系中，A2A-2-B6品系在D10Mit12、D15Mit15兩個位點與背景不同，EGFP-B6品系在D10Mit12、D13Mit3、D5Mit48這3個位點與背景不同，而EYFP-B6品系在D10Mit12位點與背景不同，在D13Mit3位點出現(xiàn)6個樣品中有一個與背景不同。表明這些突變系可能與背景存在微衛(wèi)星多態(tài)性差異。在以FVB為背景的突變系小鼠中，C系-FVB品系在D7Mit281和D15Mit15兩個位點中也出現(xiàn)多態(tài)性。這些位點既可以參考作為基因修飾動物與背景動物的鑒別，也說明這幾個位點可能在制備基因修飾動物的過程中可能發(fā)生變異的概率較大，不易維持原有等位基因。而在不同單位來源的同一品系可能由于亞系出現(xiàn)而產(chǎn)生差異，如來自北京3和北京4兩個單位的DBA/1出現(xiàn)多態(tài)性，可能就是長期分開繁殖而產(chǎn)生了差異。

綜上所述，本研究所選取的30個位點可參考用于國內(nèi)常用和基因修飾近交系小鼠的遺傳檢測，對其遺傳質(zhì)量進行適當(dāng)?shù)脑u價，也可針對多個品系進行品系檢測鑒定。

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(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)系,北京 100069； 2.山東省臨沭縣人民醫(yī)院,山東 臨沂 276700； 3.中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050； 4.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系,北京 100069)

目的 利用微衛(wèi)星位點對國內(nèi)24種近交系小鼠進行遺傳狀況分析。方法 用前期篩選的富含多態(tài)性和等位基因數(shù)多的30個小鼠微衛(wèi)星位點，合成熒光標(biāo)記引物，對近交系小鼠基因組DNA進行PCR的擴增，經(jīng)STR掃描對各近交系小鼠品系進行基因分型。結(jié)果 在24個近交系小鼠品系中，有16個品系在品系內(nèi)在30個位點上均具有相同基因型。而在不同品系間同一位點具有多態(tài)性，可初步對不同品系進行鑒別區(qū)分。其余品系內(nèi)個別動物存在多態(tài)性。結(jié)論 所選位點可以參考用于近交系小鼠遺傳質(zhì)量檢測分析，并進行初步品系檢測鑒定。

近交系小鼠；遺傳質(zhì)量分析；微衛(wèi)星DNA

Genetic quality analysis of 24 domestic inbred mouse strains by microsatellite DNA

LI Yin-yin1， WU Shao-liang2， WANG Hong3， XIAO Xiao-qin4， ZHANG Shuang-yue4， GUO Meng1， LI Chang-long4， LV Jian-yi4， LIU Xin4， CHEN Zhen-wen4， DU Xiao-yan1*
(1.Department of Laboratory Animal, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069,China； 2.People's Hospital of Linshu County, Shangdong Linyi 276700； 3.Institute of Laboratory Animal Resources, National Insitute for Food and Drug Control, Beijing 100050； 4.Department of Genetics, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069)

Objective To analyze the genetic quality of 24 domestic inbred strains mice using microsatellite loci panel. Methods Previously selected 30 microsatellite loci of mouse with high polymorphism and more allele numbers were used to synthesize corresponding fluorescently-labeled primers. Then the genomic DNA samples of each mouse were amplified by PCR and the products were analyzed by STR scanning to genotype the inbred strains of mice. Results Out of the 24 inbred strains, 15 inbred strains showed the same genotype within one strain at 30 loci. Among different strains, microsatellite loci indicated polymorphism which could be used to distinguish different strains. However, the rest 9 strains demonstrated polymorphism within strains. Conclusions Our stuoly provides a useful microsatellite panel to detect genetic quality of inbred mice and distinguish different strains with the optimized microsatellite loci.

Inbred strains; Mice; Genetic quality; Microsatellite DNA

國家科技支撐計劃(2015BAI07B01)；國家自然科學(xué)基金(31372272，31572341)。

李銀銀(1989-)，女，碩士研究生，專業(yè)：實驗動物學(xué)。E-mail： yyl7590@163.com

杜小燕(1971-)，女，博士，副教授，研究方向：實驗動物教學(xué)和研究。E-mail： duduyan@ccmu.edu.cn

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0043-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.009

2016-11-29