參芍口服液調(diào)控TLR4/MyD88通路改善糖尿病大鼠心肌炎癥損傷

張紅利，賈春新，李海鷗，周洪霞，張春來

專題研究

參芍口服液調(diào)控TLR4/MyD88通路改善糖尿病大鼠心肌炎癥損傷

張紅利1，賈春新1，李海鷗1，周洪霞1，張春來2*

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病主要的心血管并發(fā)癥之一，是糖尿病患者高心力衰竭發(fā)生率和死亡率的主要病因[1]。目前，DCM的發(fā)病機(jī)制及診治方面的研究尚有許多未知領(lǐng)域和難點(diǎn)。近年研究認(rèn)為，DCM是心肌在長期高血糖狀態(tài)下發(fā)生的一種慢性炎癥性疾病[2]。研究報道，糖尿病患者的血清和糖尿病動物模型的心肌組織中，多種炎癥因子的表達(dá)水平顯著升高[3],因此，DCM早期進(jìn)行抗炎治療是防治DCM的一個新靶點(diǎn)。TLR4作為炎癥反應(yīng)的重要受體，是免疫防御系統(tǒng)中的重要一員，是免疫反應(yīng)與慢性炎癥的橋梁[4]。既往有研究證實(shí)，TLR4參與了許多炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展，包括腎小球腎炎、神經(jīng)炎癥、炎癥性腸病等。但TLR4是否介導(dǎo)了DCM早期炎癥損傷的發(fā)生發(fā)展尚未有研究報道。

參芍口服液是在補(bǔ)陽還五湯的基礎(chǔ)上研制的速效、高效中藥制劑。課題組前期研究表明，參芍口服液可改善動脈粥樣硬化、減輕炎癥反應(yīng)、抗心肌缺血等[5,6]，但其作用于DCM發(fā)揮抗炎作用的確切機(jī)制并不明確。本實(shí)驗(yàn)通過建立2型糖尿病心肌病大鼠模型，觀察參芍口服液對DCM大鼠心肌早期炎癥損傷的影響，以期為DCM的防治提供新的方向。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

50只SPF級8周齡雄性Wistar大鼠，體重120～160 g，購自華北理工大學(xué)動物中心[SCXK(京)2015-0038]。動物飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)動物中心[SYXK(冀)2015-0038]屏蔽環(huán)境下，環(huán)境溫度：(22±2)℃，相對濕度：50%～60%，光照：12 h/12 h明暗交替，噪音<50 db；自由飲食水，并在試驗(yàn)過程中按實(shí)驗(yàn)動物使用的“3R”原則給以人道主義關(guān)懷，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器

高脂飼料(普通飼料78.8%，膽固醇1%，牛膽鹽0.2%，蛋黃粉10%，豬油10%)購自華北理工大學(xué)動物中心；鏈脲佐菌素購自Sigma公司；參芍口服液(丹參250 g，黃芪250 g，赤芍藥150 g，當(dāng)歸150 g，川芎75 g，桃仁125 g，紅花75 g，水蛭187.5 g，地龍250 g，清半夏125 g)由河北省唐山市工人醫(yī)院制劑室提供；TLR4 antibody、NF-κB P65 antibody購自Abcom公司；MyD88 antibody購自Santa Cruz公司。

血糖測量儀及試紙(美國強(qiáng)生公司)；Medlab生物信號采集處理系統(tǒng)；組織包埋機(jī)(德國萊卡公司，型號EG1150H)；組織切片機(jī)(德國萊卡公司，型號RM2245)；顯微鏡(日本奧林巴斯公司，型號BX53)；超薄切片機(jī)(德國萊卡公司，型號UC-6)；透射電子顯微鏡(日本日立公司，型號H7650)，全自動生化分析儀(日本日立公司，型號7600-110)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組與處理

50只Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組20只和實(shí)驗(yàn)組30只，對照組全程給予普通飼料，實(shí)驗(yàn)組全程給予高脂飼料。實(shí)驗(yàn)組大鼠按70 mg/kg一次性快速腹腔注射鏈脲佐菌素(溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH 4.5)，正常對照組按體重腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。注射后3 d、7 d分別測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，兩次FBG≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠入選標(biāo)準(zhǔn)。1周后將對照組隨機(jī)分為空白組(control group，生理鹽水8 mL/d)，正常干預(yù)組組(Con+HS group，參芍口服液8 mL/d)；實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)分為模型組(DCM group，生理鹽水8 mL/d)，低劑量組(DCM+LS group，參芍口服液4 mL/d)，高劑量組(DCM+HS group，參芍口服液8 mL/d)，每組各10只(實(shí)驗(yàn)中若出現(xiàn)死鼠，則予補(bǔ)充該組大鼠)。藥物劑量依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及既往文獻(xiàn)確定。持續(xù)灌胃干預(yù)6周，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(共12周)。

1.3.2 左心室插管測定心功能

給藥結(jié)束后(第12周末)，大鼠禁食12 h，測血糖，稱重，按照50 mg/kg注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉，仰位固定，頸正中切口，氣管插管，心前區(qū)去毛，暴露心臟，將單壓力導(dǎo)管插入左心室，連接Medlab生物信號記錄儀記錄左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒張末期壓力(left ventricular end diatolic pressure，LVEDP)、左心室最大收縮/舒張速率(maximum rate of myocardial contraction and maximum rate of myocardial diastole，±dp/dtmax)。

1.3.3 測定大鼠動脈血中CK、LDH、hsCRP含量

腹主動脈取血，將抽取的動脈血迅速注入含有酶抑制劑的抗凝管中，搖勻，12 000 r/min，4℃離心15 min，分離血漿，-80℃冰箱保存，全自動生化分析儀測定血漿CK、LDH、hsCRP水平。

1.3.4 HE染色及透射電鏡觀察大鼠心肌病理改變

動物處死后，進(jìn)行組織取材，一部分用生理鹽水洗去血液后浸于4%多聚甲醛中固定，后進(jìn)行脫水、透明、包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)；一部分修剪成米粒大小，浸于2.5%戊二醛溶液中，送至華北理工大學(xué)電鏡中心檢測，觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，每張切片觀察10個視野。

1.3.5 免疫組織化學(xué)法檢測TLR4、MyD88、NF-κB P65表達(dá)

取心肌組織石蠟切片，進(jìn)行脫蠟、修復(fù)、封閉后加入一抗TLR4 antibody、MyD88 antibody、NF-κB P65 antibody(均為1∶100)，4℃過夜；加二抗，DAB 顯色，封片，在同一條件下光鏡觀察并照相，隨機(jī)選擇10 個視野，采用Image Pro 6.0圖像分析系統(tǒng)測定樣本的累積光密度值(intergrated optical density，IOD)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的一般情況

實(shí)驗(yàn)過程中Con組及Con+HS組大鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏。DCM組大鼠則出現(xiàn)多飲、多食、多尿及消瘦的癥狀，精神低靡，反應(yīng)遲鈍，易激惹，毛發(fā)雜亂、污穢。Con+LS組及Con+HS組大鼠精神狀態(tài)則較模型組改善。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，DCM組大鼠血糖較Con組明顯升高，差異有顯著性(P< 0.05)。Con+LS組及Con+HS組血糖水平仍高于Con組(P< 0.05)且與DCM組相比差異無顯著性(P> 0.05)，參芍口服液干預(yù)的正常大鼠血糖水平與Con組相當(dāng)(P> 0.05)，表明參芍口服液不具有明顯的降糖作用。

DCM組大鼠體重明顯低于Con組，心體比則高于Con組(P< 0.05)。Con+LS組及Con+HS組體重、心體比較DCM組略有改善，但與Con組相比仍明顯異常(P< 0.05)且與DCM組比差異無顯著性(P> 0.05)。參芍口服液干預(yù)對正常大鼠體重、心體比無影響(P> 0.05)，見表1。

2.2 參芍口服液對DCM大鼠模型心功能的影響

與Con組比較，DCM組大鼠左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末期壓力(LVEDP)及左心室最大收縮/舒張速率(±dp/dtmax)絕對值下降(P< 0.05)。Con+LS組及Con+HS組LVSP、LVEDP、±dp/dtmax 絕對值則較DCM組升高(P< 0.05)。而參芍口服液對正常大鼠心功能差異無顯著性(P> 0.05)，見表2。

2.3 各組大鼠血漿心肌酶、hsCRP的變化及相關(guān)性

與CON組相比，DCM組血漿CK、LDH、hsCRP含量明顯升高(P< 0.05)，Con+LS組及Con+HS組則較DCM組降低(P< 0.05)，且hsCRP與CK、LDH呈正相關(guān)(r=0.753，r=0.819，P< 0.05)，見表3。

2.4 參芍口服液對DCM大鼠模型病理改變的影響

HE：Con組大鼠心肌纖維排列整齊、緊密，胞核均一，邊界清晰；DCM組大鼠心肌纖維斷裂、腫脹，排列紊亂、疏松，胞核不均，邊界不清晰，可見局灶性壞死；Con+LS組及Con+HS組大鼠上述病理改變在一定程度上有所改善，且參芍口服液對正常大鼠無影響，見圖1。

表1 各組大鼠的一般情況

注：與空白組相比，*P< 0.05。

Note.Compared with the control group，*P< 0.05.

表2 參芍口服液對各組大鼠心功能的影響

注：與空白組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05。

Note. Compared with the control group，*P< 0.05；Compared with the diabetic cardiomyopathy group，#P< 0.05.

表3 參芍口服液對各組大鼠心肌酶、hsCRP的影響

注：與空白組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05。

Note. Compared with the control group，*P< 0.05；Compared with the diabetic cardiomyopathy group，#P< 0.05.

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色(×400)Fig.1 Myocardial changes of the rat heart in the 5 groups. HE staining

圖2 各組大鼠心肌組織透射電鏡觀察(×8000)Fig.2 Electronmicrographs of rat cardiomyocytes in the 5 groups

電鏡：Con組心肌纖維排列整齊，含有大量肌絲，肌小節(jié)Z線清晰可見，胞質(zhì)中含有豐富的線粒體，呈圓形或橢圓形，嵴完整且排列有序；DCM組肌原纖維片狀壞死、溶解，胞核固縮、壞死，線粒體腫脹、變性溶解，嵴斷裂，形成空泡區(qū)；參芍口服液干預(yù)各組心肌病變減輕，且Con+HS組較Con+LS組改善明顯，見圖2。

2.5 參芍口服液對DCM大鼠心肌TLR4、MyD88、NF-κB p65表達(dá)的影響

TLR4、MyD88、NF-κB p65陽性表達(dá)信號為黃色至棕黃色顆粒，在DCM組中心肌細(xì)胞胞質(zhì)中可見大量棕黃色顆粒，其累積光密度(IOD)較Con組顯著升高(P< 0.05)。經(jīng)參芍口服液干預(yù)后，TLR4、MyD88、NF-κB p65表達(dá)減少，且Con+HS組下降較Con+LS組更為顯著。參芍口服液干預(yù)的正常大鼠心肌組織中MyD88、NF-κB p65表達(dá)較正常大鼠下降，但其累積光密度差異無顯著性(P> 0.05)，見圖3～6。

圖3 TLR4在各組中的表達(dá)(×400)Fig.3 Expression of TLR4 in rat cardiomyocytes in the 5 groups

圖4 MyD88在各組中的表達(dá)(×400)Fig.4 Expression of MyD88 in rat cardiomyocytes in the 5 groups

圖5 NF-κB p65在各組中的表達(dá)(×400)Fig.5 Expression of NF-κB p65 in rat cardiomyocytes in the 5 groups

注：與空白組相比，*P < 0.05；與模型組相比，#P < 0.05；與參芍口服液低劑量組相比，△P< 0.05。圖6 TLR4、MyD88、NF-κB p65在各組表達(dá)的累積光密度值Note. Compared with the control group，*P < 0.05；Compared with the diabetic cardiomyopathy group，#P < 0.05；Compared with the control+low dose Shenshao decoction group，△P < 0.05.Fig.6 Intergrated optical density of TLR4,MyD88,NF-κB in myocardium of rats in the 5 groups

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，免疫炎癥參與糖尿病心肌病早期病理過程，是DCM發(fā)生發(fā)展的重要病因之一[7,8]。Toll樣受體是作為先天免疫系統(tǒng)重要的一員，已證實(shí)在動脈粥樣硬化、病毒性心肌炎、擴(kuò)張型心肌病，心臟移植排斥反應(yīng)和膿毒癥所致的左心室功能障礙中可發(fā)揮重要作用[9]。TLR4是Toll樣受體家族中介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要受體之一[10]，張雨薇等[11]通過實(shí)驗(yàn)證明沉默TLR4基因可減輕STZ糖尿病小鼠的心肌損傷；他汀類藥物可通過抑制TLR4信號通路，阻斷炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子釋放，發(fā)揮對糖尿病大鼠心肌的保護(hù)作用[12]。李躍華等[13]發(fā)現(xiàn)MyD88依賴性NF-κB信號途徑在心肌肥大過程中發(fā)揮重要作用。故推測TLR4/MyD88通路可能在DCM早期炎癥損傷中也發(fā)揮重要作用。機(jī)體在長期高糖條件下產(chǎn)生AGEs、FFA等物質(zhì)作為內(nèi)源性配體激活TLR4，TLR4活化后其TIR結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象變化，可與MyD88的TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合[14]，最終使NF-κB/I-κB三聚體中的I-κB磷酸化而失活，NF-κBp65解離發(fā)生核移位、活化進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[15]，導(dǎo)致下游炎癥因子如IL-6、TNF等表達(dá)增強(qiáng)，產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致心肌損傷。本實(shí)驗(yàn)中，DCM組hsCRP明顯升高，且與心肌酶水平呈正相關(guān)，提示糖尿病心肌損害與炎癥反應(yīng)存在聯(lián)系。免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)一步顯示，DCM組大鼠的心肌組織中NF-κB隨著TLR4和MyD88的表達(dá)提高而上調(diào)，與預(yù)期結(jié)果一致，提示TLR4-NF-κB炎性信號通路參與了DCN早期炎癥損傷的發(fā)生與發(fā)展，且其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是通過MyD88依賴性途徑進(jìn)行的。

參芍口服液以活血化瘀為治療原則, 兼以補(bǔ)氣通絡(luò)，可以增加外周血流量，抑制炎癥、保護(hù)血管內(nèi)皮等[16]。薛忠文等[17]證實(shí)參芍口服液可降低動脈粥樣硬化大鼠主動脈IL-1β，IL-17A，IL-23的表達(dá)水平，通過抑制大鼠炎性反應(yīng)減輕主動脈粥樣斑塊的進(jìn)展。并有研究證實(shí)，參芍口服液可降低心肌梗死[18]及冠狀動脈粥樣硬化[5]大鼠外周血VCAM-1的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中參芍口服液干預(yù)后糖尿病大鼠炎性標(biāo)志物hsCRP與炎癥因子IL-6含量降低，且TLR4、MyD88、NF-κB的表達(dá)較模型組明顯下調(diào)，提示參芍口服液可能通過抑制TLR4炎癥反應(yīng)通路減輕了糖尿病大鼠心肌組織炎癥反應(yīng)的程度，近而發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠的心肌病理損傷減輕，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞排列整齊、緊密，斷裂、腫脹減少，透射電鏡可見心肌纖維呈束狀排列，壞死及溶解區(qū)少見，可見Z線；同時糖尿病大鼠的心功能也得到改善，因此得出參芍口服液可能通過抑制TLR4/MyD88介導(dǎo)的下游炎癥因子的表達(dá)，對DCM大鼠心肌炎癥損傷及功能起保護(hù)作用這一結(jié)論。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在糖尿病心肌病大鼠模型中，TLR4/MyD88依賴性信號通路高表達(dá)，并推測參芍口服液可能是通過抑制該通路來抑制NF-κB表達(dá)，繼而抑制免疫炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，提示參芍口服液可能通過抑制糖尿病大鼠心肌炎癥反應(yīng)從而達(dá)到保護(hù)心臟結(jié)構(gòu)及功能的作用，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究與證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)為參芍口服液治療糖尿病心肌病的作用機(jī)制提供了新的方向，同時也提出了對TLR4/MyD88依賴性信號通路進(jìn)行干預(yù)可能成為治療糖尿病心肌病的新靶點(diǎn)。

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(1.華北理工大學(xué)/河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 唐山 063000； 2.唐山市工人醫(yī)院，河北 唐山 063000)

目的 探討參芍口服液在糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)大鼠結(jié)構(gòu)功能損傷中的作用及其可能機(jī)制。方法 一次性腹腔注射大劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型。測定血漿心肌酶(CK、LDH)、超敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)的變化，左心室插管測定大鼠心功能，蘇木素-伊紅染色、透射電鏡觀察大鼠心肌病理改變，免疫組織化學(xué)法檢測Toll樣受體4(TLR4)、髓樣分化蛋白(MyD88)及核因子κB P65(NF-κB P65)表達(dá)。結(jié)果 治療6周后，DCM大鼠左心室舒張和收縮功能明顯改善；心肌纖維及線粒體腫脹、斷裂、壞死減少，結(jié)構(gòu)緊密，排列整齊；CK、LDH、hsCRP含量降低(P< 0.05)，且hsCPR與CK、LDH呈正相關(guān)(r=0.753，r=0.819，P< 0.05)；TLR4、MyD88、NF-κB P65表達(dá)明顯下調(diào)(P< 0.05)。而參芍口服液干預(yù)的正常大鼠上述指標(biāo)無明顯改變(P> 0.05)。結(jié)論 參芍口服液可減輕糖尿病心肌病大鼠心肌損傷，改善心臟舒張和收縮功能，其機(jī)制可能與抑制TLR4/MyD88信號通路誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。

參芍口服液；糖尿病心肌??；心功能；TLR4/MyD88；炎癥

Shenshao decoction improves myocardial inflammatory injury in diabetic rats by regulation of TLR4/MyD88 pathway

ZHANG Hong-li1， JIA Chun-xin1， LI Hai-ou1， ZHOU Hong-xia1， ZHANG Chun-lai2*
(1.North China University of Science and Technology/Hebei Key Laboratory for Chronic Diseases/Tangshan Key Laboratory for Preclinical and Basic Research on Chronic Diseases，Tangshan 063000，China； 2.Tangshan Worker’s Hospital, Tangshan 063000)

Objective To investigate the improving effects of Shenshao decoction on myocardial structure and function in diabetic cardiomyopathy，and its effect on expression of TLR4/MyD88-dependent pathway signal in diabetic cardiomyopathy. Methods Diabetes mellitus was induced in 8-week-old male Wistar rats by a single intraperitoneal injection of streptozotocin. The changes of plasma myocardial enzyme (CK, LDH) and high sensitive C reactive protein (hsCRP) were measured. Cardiac function was measured by left ventricular intubation. Hematoxylin and eosin staining and electron microscopy were used to observe the changes of myocardial morphology and ultrastructure in rats. Expression of Toll-like receptor 4(TLR4), myeloid differentiation protein 88(MyD88), and nuclear factor-κB P65(NF-κB P65) were tested by immunohistochemistry. Results After 6 weeks of treatment, the left ventricular diastolic and systolic functions were obviously improved;the degrees of myocardial fibers and mitochondrial damage were obviously relieved;the content of CK, LDH and hsCRP decreased (P< 0.05), and hsCPR was positively correlated with CK and LDH (r=0.823，r=0.819，P< 0.05).The expressions of TLR4, MyD88, NF-κB P65 were significantly decreased (P< 0.05).There was no significant difference in the above mentioned indicators between the control group and control+Shenshao decoction group (P> 0.05). Conclusions Shenshao decoction can reduce the myocardial injury in diabetic cardiomyopathy and improve cardiac diastolic and systolic functions.The mechanism may be related to attenuated inflammation by TLR4/MyD88 dependent signaling pathway.

Shenshao decoction; Diabetic cardiomyopathy; Cardiac function; TLR4/MyD88; Inflammation; Rats

張紅利(1989-)，女，碩士研究生。E-mail： hongli2618@sina.com

張春來，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail： 120zcl@sina.com

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0028-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.006

2017-02-08