不同寄主來源輪枝孢菌的交互致病性1

張園園，張貴，張鍵，張光，周洪友，趙君*

（1.內蒙古農業(yè)大學農學院，呼和浩特010018；2.烏拉特前旗農業(yè)技術推廣中心，內蒙古烏拉特前旗014400）

不同寄主來源輪枝孢菌的交互致病性1

張園園1，張貴1，張鍵1，張光2，周洪友1，趙君1*

（1.內蒙古農業(yè)大學農學院，呼和浩特010018；2.烏拉特前旗農業(yè)技術推廣中心，內蒙古烏拉特前旗014400）

為了明確不同寄主來源的輪枝孢菌是否存在交互致病性，對來源于向日葵、棉花、茄子、生菜和馬鈴薯5種不同寄主植物上的10株輪枝孢菌的生物學特性，如菌落形態(tài)、生長速度、生理小種、交配型和致病力分化進行研究，并利用大麗輪枝孢菌不同生理小種和交配型的特異引物對供試大麗輪枝孢菌菌株進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）檢測。結果表明，不同寄主來源的輪枝孢菌在菌落形態(tài)和生長速度上存在顯著差異。PCR檢測結果表明：除了來自生菜的大麗輪枝孢菌Ls16-1為1號生理小種外，其余8株不同寄主來源的大麗輪枝孢菌均為2號生理小種；所有供試大麗輪枝孢菌菌株的交配型均為MAT1-2-1型。此外，采用紙缽撕底蘸根法將不同寄主來源的輪枝孢菌分別接種向日葵、棉花、茄子和馬鈴薯。結果顯示，不同寄主來源的菌株對上述不同寄主均表現出不同程度的致病力，但都對自身分離寄主的致病性表現最強。綜上表明，不同寄主來源的輪枝孢菌對不同寄主存在交互致病性，但均對其分離寄主的致病性表現最強。

輪枝孢菌；交互致病性；生理小種；交配型

SummaryVerticillium spp.is a group of soil-borne pathogen causing a yellow wilt disease on different kinds of hosts, such as cottons,potatoes,sunflowers and egg-plants,etc.So far,Verticillium dahliae and Verticillium alboatrum have been the most dominant species isolated from different diseased hosts.

In this study,V.dahliae from sunflower,cotton,eggplant,lettuce and potato and V.alboatrum from potato were selected to study the colonial morphology,growth speed,and pathogenic specificity.Their race and mating types were also identified by specific primers.

The results showed that variable colonial morphology and growth speed were observed in all the tested isolates.Four different kinds of colonial morphologies were classified based on the amount of aerial mycelium and the number of microsclerotia.However,the difference on the morphology of conidiophores and conidia was not obvious among all the tested isolates.The growth speed was also variable after 10 d of culture on potato D-glucose agar(PDA)medium.The strain Ls17-6 from lettuce grew the fastest,while Hn-1 from cotton grew the slowest.The difference of growth speed was alsoobserved among the isolates obtained from the same host.For example,Hn-1 isolated from cotton was significantly lower compared with the other two isolates.All the tested isolates were characterized as race 2,except for Ls16-1 isolated from lettuce as race 1;the mating type of all the tested strains was MAT1-2-1.The pathogenic specificity was studied using root dipping inoculation way.Twenty-one days post-inoculation(dpi),the pathogenicity of isolates always showed the highest virulence on its own host.For example,Sx5 which was isolated from sunflower showed the highest disease index of 52.50, followed by the isolate V991 from cotton with the disease index of 41.25.The same result was also obtained on cotton.For example,the isolate V991 showed the highest pathogenicity,and Icd3-33 also from cotton listed in the second position among all the tested isolates.

In conclusion,the pathogenicity of Verticillium spp.on the different hosts is variable,but shows the strongest pathogenicity in the specific host.Besides,the isolates from lettuce always showed the lowest virulence on all the tested hosts,indicating lettuce may be used as a rotation host for other crops to control the yellow wilt in the future.

引起植物黃萎病的病原菌統(tǒng)稱為黃萎病菌，包括大麗輪枝孢菌（Verticillium dahliae Kleb.）、黑白輪枝孢菌（Verticillium alboatrum Reinke&Berthold）、三體輪枝孢菌（Verticillium tricorpus Isaac）、云狀輪枝孢菌（Verticillium nubilum Pethybr.）、鱷梨根腐病原菌（Verticillium theobromae Turc.）[1]，以及大麗輪枝孢菌長孢變種（Verticillium dahliae var.longisporum Stark）、變黑輪枝孢菌（Verticillium nigrescens Pethybr.）等[2-3]；但是引起作物黃萎病的病原菌只有大麗輪枝孢菌和黑白輪枝孢菌2種[4-5]。目前，黃萎病菌在馬鈴薯（Solanum tuberosum）[6]、向日葵（Helianthus annuus L.）[7]、茄子（Solanum melongena L.）[8]、花椰菜（Brassica oleracea L.）、陸地棉（Gossypium hirsutum L.）[9]、生菜（Lactuca sativa var. ramosa）[10]等寄主上造成的危害均有報道。如我國云南省茄子黃萎病呈現出逐年加重的趨勢，嚴重時產量損失達80%以上[8]；我國新疆棉花黃萎病發(fā)病田占棉花總播種面積的58.2%，其中病情指數達5.0以上的棉田占28.1%[9]；我國內蒙古地區(qū)向日葵黃萎病的發(fā)生面積占向日葵總播種面積的7%左右[11]，而在寧夏部分地區(qū)的發(fā)生面積占向日葵播種面積高達46.9%[12]，嚴重影響向日葵的產量和品質；美國南部地區(qū)馬鈴薯黃萎病嚴重影響馬鈴薯塊莖的質量，造成馬鈴薯減產[6]。

盡管黃萎病菌的寄主范圍十分廣泛，但是它在不同寄主上表現出的致病力不同，如從可可（Theobroma cacao L.）和草莓（Fragaria spp.）上分離得到的大麗輪枝孢菌對可可和草莓的致病力強于對其他寄主植物的致病力[13-14]；從胡椒（Piper nigrum L.）、薄荷（Mentha haplocalyx L.）和煙草（Nicotiana tabacum L.）等寄主植物上分離到的大麗輪枝孢菌[4,10,13-14]以及從紫花苜蓿（Medicago sativa L.）和啤酒花（Humulus lupulus L.）寄主植物上分離得到的黑白輪枝孢菌對寄主都表現出一定的寄生?；訹15-16]。此外，從朝鮮薊（Cynara scolymus L.）、甜椒（Capsicum annuum var.grossum）、油橄欖（Olea europaea L.）、辣椒（Capsicum annuum L.）、陸地棉、茄子、薄荷、生菜、馬鈴薯、草莓、番茄（Lycopersicon esculentum L.）、西瓜（Citrullus lanatus L.）上分離到的輪枝孢菌也有交互侵染的報道[4]。但是，向日葵黃萎病菌（大麗輪枝孢菌）在馬鈴薯、茄子、棉花等輪作作物上的致病力分化研究尚未有報道。

已有研究結果表明，不同寄主來源的大麗輪枝孢菌只有1號和2號2個生理小種。USAMI等[17]和SCHAIBLE等[18]分別對番茄和生菜的大麗輪枝孢菌遺傳多樣性進行了研究，開發(fā)出1號和2號生理小種的特異引物，并利用這些引物鑒定表明，生菜和番茄大麗輪枝孢菌都存在著1號和2號生理小種的分化[17-19]。由于大麗輪枝孢菌的1號生理小種只在缺少抗病基因的寄主上具有致病性，而2號生理小種能夠克服抗病基因所介導的抗病性[20-21]，因此，國際上利用Ve1基因設計引物，通過聚合酶鏈式反應來檢測寄主基因組中是否含有Ve1基因，從而快速鑒別侵染這些寄主的大麗輪枝孢菌的生理小種類型。同時，國外還利用含有Ve1基因的番茄品種“ACE VF”與不含Ve1基因的番茄品種“Early pak 7”、含有Vr1基因的生菜品種“Momotaro”與不含有Vr1基因的生菜品種“Oogata-fukuju”作為生理小種的鑒別寄主，分別鑒定了番茄和生菜中大麗輪枝孢菌的生理小種類型[19]。

子囊菌的有性生殖由配位型基因MAT來調控。配位型基因編碼的蛋白往往是一種能夠調控與有性交配相關基因表達的轉錄因子[22]。大麗輪枝孢菌是一種具有MAT1-1-1和MAT1-2-1 2種交配型（mating type）的異宗配合真菌[17]。如果2株大麗輪枝孢菌菌株要進行有性生殖，它們必須分別攜帶有MAT1-1和MAT1-2配位基因[23-25]。ATALLAH等[26]的研究結果表明，在美國加利福尼亞州采集的生菜大麗輪枝孢菌種群中MAT1-1-1所占的比例僅為30%，其余菌株的交配型均為MAT1-2-1，表明在大麗輪枝孢菌群體中存在著MAT1-1-1和MAT1-2-1 2種交配型。

本研究以分離自向日葵、馬鈴薯、茄子、生菜以及棉花的輪枝孢菌為研究材料，通過對比不同寄主來源輪枝孢菌的形態(tài)學特征，確定不同寄主來源的輪枝孢菌的生理小種及交配型，評價輪枝孢菌在向日葵、馬鈴薯、茄子、棉花等寄主之間的交互侵染能力，進而明確其在不同寄主間是否存在致病力分化現象，旨在填補我國向日葵黃萎病菌的研究空白，也為不同作物黃萎病綜合防控措施中輪作對象的選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：Sx5（Verticillium dahliae）由內蒙古農業(yè)大學農學院分子植物病理室向日葵病害菌種庫保存；Pt1（Verticillium dahliae）、Pt2（Verticillium dahliae）、Pt3（Verticilium alboatrum）由內蒙古農業(yè)大學農學院周洪友教授提供；V991（Verticillium dahliae）、Hn-1（Verticillium dahliae）、Icd3-33（Verticillium dahliae）由西北農林科技大學肖恩時研究員提供；Xn由內蒙古農業(yè)大學農學院景嵐教授提供。以來源于生菜的輪枝孢菌菌株為參考菌株，由美國加利福尼亞大學戴維斯分校SUBBARAO教授惠贈，其中：菌株Ls16-1（Verticilliumdahliae）是1號生理小種，交配型是MAT1-2-1型；菌株Ls17-6（Verticillium dahliae）是2號生理小種，交配型是MAT1-2-1型。上述菌株中除了Pt3為黑白輪枝孢菌（Verticillium alboatrum）外，其余9株均為大麗輪枝孢菌（Verticillium dahliae）。供試輪枝孢菌菌株的具體信息如表1所示。

表1 輪枝孢菌菌株代碼及其寄主信息Table 1Codes of Verticillium isolates and their hosts

供試的寄主材料均為市售品種，其中：向日葵品種為食葵雜交種“LD5009”；棉花品種為“石抗”；茄子品種為“快圓茄”；馬鈴薯品種為“夏坡地”。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato D-glucose agar,PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、水1 000 mL。麥麩培養(yǎng)基：麥麩經蒸餾水浸潤后分裝于300 mL的罐頭瓶中，121℃高溫滅菌30 min。

供試試劑：10×Taq緩沖液、dNTPs、Taq酶和DL2000分子質量標準（均購于北京天根生物科技有限公司）；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）引物（由北京厚生博泰科技有限公司合成）。

供試儀器：TC-25H PCR擴增儀（杭州博日科技有限公司生產）。

1.2 方法

1.2.1 不同寄主來源的輪枝孢菌菌落形態(tài)和生長速度的測定

將10個不同寄主來源的輪枝孢菌菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，25℃活化7～10 d，在菌落邊緣的幼嫩菌絲處用直徑為9 mm的滅菌打孔器打出菌餅，接種在PDA培養(yǎng)基中央，25℃恒溫培養(yǎng)，觀察其菌落形態(tài)。利用十字交叉法測量并記錄培養(yǎng)5、10、15和18 d的菌落直徑。每個處理重復5次。

1.2.2 不同寄主來源的輪枝孢菌生理小種的鑒定

用CTAB法提取大麗輪枝孢菌的基因組DNA[27]，采用特異引物對不同寄主來源的大麗輪枝孢菌進行PCR擴增。大麗輪枝孢菌1號生理小種的特異引物對[24]如下。vdr1：5'-TGAAGTAGCCGATAGCTTT GTCTTGCCCG-3'；vdr2：5'-TGTCTGGATTAATCGCC GCAATAGAGACG-3'。2號生理小種的特異引物對[19]如下。vd2F：5'-ACTTAACGAAAGCATGCGC-3'；vd2R：5'-CTTGACTTGCCGGCTCC-3'。

PCR反應體系（25 μL）：ddH2O 19 μL，10×Taq緩沖液2.5 μL，dNTPs（各2.5 mmol/L）1.25 μL，引物對（10 μmol/L）各0.5 μL，Taq酶（2.5 U/μL）0.25 μL，模板DNA 1 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，退火45 s（其中引物vdr1/vdr2的退火溫度為59℃，vd2F/vd2R的退火溫度為58℃），72℃延伸45 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過觀察是否擴增出與正對照相同位置的條帶來確定其生理小種的類型。1.2.3不同寄主來源輪枝孢菌交配型的鑒定

大麗輪枝孢菌的交配型鑒定[3,25]可分別通過MAT1-1-1型的特異引物（Alf3：5'-CGATCGCGATATCG GCAAGG-3'；MAT11r：5'-CAGTCAGATCCAACCTGC TGGCC-3'）和MAT1-2-1型的特異引物（HMG21f：5'-CGGCCGCCCAATTCGTACATCC-3'；MAT21r：5'-CATGCCTTCCATGCCATTAGTAGCC-3'）[18]完成。DNA提取方法和PCR反應體系（除MAT1-1-1和MAT1-2-1的退火溫度均為57℃外）同1.2.2節(jié)。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測：MAT1-1-1型目的片段大小約為600 bp；MAT1-2-1的片段大小約為300 bp。

1.2.4 不同寄主來源輪枝孢菌致病力的測定

將不同寄主來源的輪枝孢菌經PDA平板活化5～7 d后，從菌落邊緣挑取菌塊接入麥麩培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)7～14 d。用無菌水沖洗麥麩培養(yǎng)基，4層滅菌紗布過濾后獲得分生孢子液。用血球計數板計數，將分生孢子液的濃度調至1×107mL－1后備用。

用70%的乙醇浸泡向日葵、棉花、茄子種子5 min后，用無菌水沖洗2～3遍，播種到裝有滅菌土的營養(yǎng)缽（高10 cm，直徑10 cm）中；馬鈴薯塊莖切塊后也播種到裝有滅菌土的營養(yǎng)缽中。當向日葵、棉花、茄子幼苗長到2～4片真葉時，將準備好的分生孢子液采用紙缽撕底蘸根法[28]進行人工接種。其中：對于向日葵、棉花、茄子，每個菌株分別接種5缽，每缽4株幼苗，1缽幼苗作為空白對照；對于馬鈴薯寄主，每個菌株接種10缽幼苗（每缽2株），2缽幼苗作為空白對照。接種后的幼苗置于22～23℃溫室條件下繼續(xù)培養(yǎng)。分別記錄接種后第7、14、21和28天時各寄主植物的發(fā)病等級[29]，并計算病情指數。以21 d的病情指數繪制表格。

黃萎病發(fā)病程度分級標準[29]如下。0級：健株，無癥狀；1級：25%（含25%）以下的葉片表現褪綠、黃化、萎蔫、枯死等癥狀；2級：25%～50%（含50%）的葉片表現癥狀，植株矮化；3級：50%～75%（含75%）的葉片表現癥狀，植株矮化；4級：75%以上的葉片表現出嚴重癥狀，植株枯萎死亡。

病情指數=[∑(各級病株數×相應級別)/(調查總株數×4)]×100。試驗重復3次。

1.3 數據分析

利用SAS 9.0軟件對所有數據進行統(tǒng)計分析，采用鄧肯新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同寄主來源輪枝孢菌菌落形態(tài)的比較

所有供試菌株培養(yǎng)7 d后的菌落近圓形，其菌絲特別是氣生菌絲的生長量與微菌核形成數量呈現明顯的差異。由圖1可見：以Ls16-1、Ls17-6和Pt3為代表的菌株其菌落能夠產生茂密的白色氣生菌絲，但沒有微菌核產生；而菌株Sx5、V991、Hn-1、Icd3-33和Xn的菌落既能產生白色氣生菌絲又能產生一定數量的微菌核，其中，菌株Sx5、V991、Hn-1能夠形成比較密集的氣生菌絲，菌株Icd3-33和Xn能形成稀疏的氣生菌絲和一定量的微菌核；而菌株Pt1和Pt2能夠產生大量的微菌核和少量、稀疏的氣生菌絲。不同寄主來源的輪枝孢菌菌株產生的分生孢子形態(tài)相似，均為無色、單孢、橢圓形、近橢圓形；分生孢子梗均呈現輪枝狀排列。

圖1 不同寄主來源的輪枝孢菌菌株的菌落形態(tài)Fig.1Colonial morphology of Verticillium spp.isolated from different hosts

2.2 不同寄主來源輪枝孢菌菌落生長速度的比較

由圖2可見：不同寄主來源的輪枝孢菌菌株的生長速度在培養(yǎng)10 d后差異顯著。其中：來自生菜的Ls17-6菌株生長速度最快，菌落直徑為4.15 cm；其次是來源茄子的菌株Xn，菌落直徑為3.86 cm；來自棉花的菌株Hn-1的生長速度最慢，菌落直徑僅為2.99 cm。培養(yǎng)到第15天時，從茄子上分離到的輪枝孢菌菌株Xn的生長速度明顯加快，菌落直徑為4.71 cm；其次是來源于生菜的菌株Ls17-6，菌落直徑為4.65 cm；從棉花上分離到的輪枝孢菌菌株Hn-1的生長速度最慢，菌落直徑僅有3.69 cm。當培養(yǎng)到第18天時，來自不同寄主的各菌株之間生長速度差異無統(tǒng)計學意義。

從圖2也可以看出，采集于不同地點的相同寄主來源的輪枝孢菌，其生長速度也表現出一定的差異。其中：來自棉花的3個菌株在培養(yǎng)5、10和15 d時的生長速度均表現出明顯的差異，相對于其他2個菌株，菌株Hn-1的生長速度一直為最慢；而來自生菜的2個菌株在培養(yǎng)第10天時就表現出差異，其中LS17-6的生長速度略快于LS16-1；來源于馬鈴薯的3個菌株的生長速度也在培養(yǎng)第10天時出現一定的差異，菌株Pt2的生長速度略快于其他2個菌株，而來自馬鈴薯的黑白輪枝孢菌Pt3的生長速度和相同寄主的大麗輪枝孢菌Pt1的生長速度相同，差異無統(tǒng)計學意義。

2.3 不同寄主來源輪枝孢菌生理小種的鑒定

利用國際通用的輪枝孢菌的生理小種1和生理小種2的特異引物對不同寄主來源輪枝孢菌的生理小種進行鑒定，結果如圖3所示。除了生菜黃萎病菌Ls16-1為1號生理小種外，其余8株不同寄主來源的黃萎病菌均為2號生理小種。

2.4 不同寄主來源輪枝孢菌的交配型鑒定

利用大麗輪枝孢菌的交配型MAT1-1-1和MAT1-2-1的特異引物對不同寄主來源大麗輪枝孢菌的交配型進行鑒定。結果表明，所有不同寄主來源的大麗輪枝孢菌均為MAT1-2-1交配型（圖4）。說明MAT1-2-1交配型是不同寄主來源大麗輪枝孢菌的優(yōu)勢交配型。

2.5 不同寄主來源輪枝孢菌的致病力測定

為了比較不同寄主來源的輪枝孢菌菌株在不同寄主植物的交互侵染能力，采用傷根接種法進行人工接種，并調查了接種7、14、21和28 d后的植株發(fā)病情況，計算病情指數。其中，接種21 d后不同寄主的病情指數如表2所示。結果表明，不同寄主來源的輪枝孢菌菌株對不同寄主植物的致病力存在統(tǒng)計學上的顯著差異（P＜0.05）。根據不同寄主對供試菌株的抗性反應，對不同寄主來源的輪枝孢菌的致病力進行測定，結果歸納如下。

圖2 不同寄主來源輪枝孢菌菌株生長速度比較Fig.2Comparison of the growth speed of Verticillium spp.isolated from different hosts

圖3 不同寄主來源大麗輪枝孢菌生理小種的PCR鑒定Fig.3Race type identification of Verticillium dahliae isolated from different hosts by PCR

圖4 不同寄主來源大麗輪枝孢菌MAT1-2-1交配型的PCR鑒定Fig.4Identification of mating type MAT1-2-1 in Verticillium dahliae isolated from different hosts by PCR

向日葵寄主：接種2周后，下部葉片首先開始出現癥狀，葉尖或葉緣局部黃化，隨著組織失調、青萎，開始向葉脈組織發(fā)展，最后變褐、干枯，莖基部和葉柄微管束呈褐色。后期發(fā)病株的全部葉片都有顯著病變，干枯矮化。所有供試輪枝孢菌菌株都能侵染向日葵品種“LD5009”，但發(fā)病程度呈現出一定的差異。其中，來自向日葵的菌株Sx5對向日葵品種“LD5009”表現出最強的致病力，病情指數高達52.50，其次為棉花菌株V991，病情指數為41.25。來源于生菜的菌株Ls16-1和Ls17-6表現出最弱的致病力，病情指數分別為16.67和25.00。來自茄子的菌株Xn在向日葵上表現出的致病力居中，病情指數為40.00。來自馬鈴薯的3個菌株在向日葵上表現出的致病力僅次于向日葵SX5、棉花V991和茄子菌株Xn，這3株馬鈴薯菌株的病情指數介于33.75和38.75之間，相互間差異不顯著。而來自棉花的3個菌株在向日葵上呈現出致病力分化現象，其中菌株V991在向日葵寄主上表現出的致病力高于其他2份菌株。

棉花寄主：接種1周后，植株下層葉片出現褪綠黃化病斑，隨著病情的發(fā)展可形成枯葉、光稈，維管束則部分褐變，植株矮化、萎蔫。所有供試菌株均能夠侵染棉花品種“石抗”。其中：來源于棉花的菌株V991的致病力最強，病情指數為80.00；其次為來源于棉花的另一個菌株Icd3-33，病情指數為62.50。來自馬鈴薯的3株菌Pt1、Pt2和Pt3在棉花上的病情指數分別為55.00、57.50和40.00，其致病力僅次于來自棉花的菌株Icd3-33。來自棉花的菌株Hn-1在棉花上表現出的致病力最弱，病情指數僅為12.50。在馬鈴薯的3個供試菌株中，黑白輪枝孢菌Pt3的致病力在棉花上最弱，病情指數為40.00。來源于茄子的黃萎病菌Xn在棉花上也表現出相對較弱的致病力，病情指數為41.67。與向日葵寄主測定結果相似，來源于生菜的菌株Ls16-1和Ls17-6的致病力最弱，其病情指數分別為15.00和10.00。

茄子寄主：接種1周后，葉緣及葉脈間出現褪綠黃化病斑，病斑不斷擴大和聯合，顏色也由黃色變?yōu)楹稚?，并不斷由下部向上部發(fā)展至整株；有時只半邊葉或半邊植株發(fā)病，即俗稱的“半邊瘋”。所有供試菌株在茄子寄主上表現出的病情指數都低于50.00。其中：從茄子寄主分離到的菌株Xn對茄子的致病力最強，病情指數為43.75；其次為來自生菜的1號生理小種菌株Ls16-1，病情指數為36.67，而來自生菜的2號生理小種Ls17-6的病指僅為22.50。來自馬鈴薯的Pt1、Pt2和Pt3菌株在茄子寄主上的表現和前面2個寄主截然不同，其中黑白輪枝孢菌Pt3表現出的致病力最強，病情指數為36.67。致病力表現最弱的菌株是來自棉花的V991，其病情指數僅為14.58，而這一菌株在棉花、向日葵和馬鈴薯上都表現出極強的致病力。

表2 不同寄主來源的輪枝孢菌對不同寄主的致病力測定結果Table 2Cross pathogenicity test of Verticillium spp.isolated from different hosts

馬鈴薯寄主：接種2周后，葉片的側脈之間變黃，逐漸轉褐，有時葉片稍往上卷，自頂端或邊緣起枯死；輕病植株生長緩慢，下部葉片變褐干枯，嚴重的整個植株萎蔫枯死，剖莖可見維管束變成褐色。來自馬鈴薯的黑白輪枝孢菌Pt3表現出最強的致病力，病情指數為54.17；其次為來自茄子的菌株Xn，病情指數為47.08；表現最弱的為生菜菌株Ls16-1以及棉花黃萎病菌株Hn-1，其病情指數均為25.00。

3 討論

本試驗不同寄主來源的10株輪枝孢菌按菌落形態(tài)可初步分為4種培養(yǎng)類型：第1類以菌株Ls16-1、Ls17-6和Pt3為代表，能夠產生茂密的白色氣生菌絲，但沒有微菌核產生；第2類以菌株Sx5、V991、Hn-1為代表，能夠形成比較密集的氣生菌絲和一定數量的微菌核；第3類以菌株Icd3-33和Xn為代表，只能形成稀疏的氣生菌絲和一定量的微菌核；第4類以菌株Pt1和Pt2為代表，能夠產生大量的微菌核和少量、稀疏的氣生菌絲。在PDA培養(yǎng)基上生長到10 d時，不同寄主來源的供試菌株的生長速度差異顯著；而不同培養(yǎng)型菌株的生長速度與其致病力沒有明顯的相關性。這與任杰等[30]的研究結果一致，即不同培養(yǎng)型的向日葵黃萎病菌存在致病力的分化，且菌株的致病力強弱與其生長速度沒有相關性。

已有的研究表明，生理小種的種群結構與其地理位置有相關性。GURUNG等[19]研究發(fā)現，所有來自美國沃森維爾地區(qū)的黃萎病菌株均為2號生理小種，而所有來自薩利納斯地區(qū)的黃萎病菌株均為1號生理小種。而本研究結果表明，除SUBBARAO教授惠贈的美國生菜大麗輪枝孢菌菌株LS16-1為1號生理小種外，其余8株不同寄主且不同地域來源的大麗輪枝孢菌均為2號生理小種：說明大麗輪枝孢菌的寄主類型、采樣地點與其生理小種類型無明顯相關性。由于我國不同寄主植物來源的輪枝孢菌的優(yōu)勢小種都是2號生理小種，且所有供試菌株的交配型均被鑒定為MAT1-2-1交配型，說明無性生殖是我國不同寄主輪枝孢菌的主要繁殖方式。這一結論與USAMI等[17]對329株生菜黃萎病菌的研究結果一致，即：311株病菌為1號生理小種，占供試菌株的94.52%；328株病菌為MAT1-2-1交配型，占供試菌株的99.69%。

目前對大麗輪枝孢菌（V.dahliae）以及黑白輪枝孢菌（V.alboatrum）寄主?；砸延袕V泛的報道[1,7,10,31-32]。有研究指出，來自番茄和蘿卜（Raphanus sativus L.）的黃萎病菌均可侵染薄荷，但來自馬鈴薯、茄子、黃秋葵（Abelmoschus esculentus L.）和甜瓜（Cucumis melo L.）的黃萎病菌株則對薄荷沒有致病性。同樣，棉花黃萎病菌株雖然不能侵染豇豆（Vigna unguiculata L.）、甜瓜和西瓜，但對棉花、番茄和紅花（Carthamus tinctorius L.）具有不同程度的致病性[33]。本實驗的研究結果和上述研究結果一致，如向日葵黃萎病菌株Sx5既可以侵染向日葵，也可以侵染棉花、茄子和馬鈴薯，但在不同寄主上的致病性卻不盡相同。供試菌株對各自寄主均表現出最強的致病力，而對寄主以外的其他寄主則表現出不同程度的致病力，說明從不同寄主上分離到的黃萎病菌具有一定的寄生專化性，但在其他不同的寄主上存在著致病力分化的現象。這與BHAT等[10]在番茄、茄子、甜椒和十字花科植物上發(fā)現的黃萎病菌存在寄生?；缘慕Y果一致。不同寄主來源的黃萎病菌在不同寄主上表現出致病性分化的現象，可能是長期進化過程中菌株與寄主植物之間相互作用的結果。類似這種黃萎病菌-寄主植物相互作用的模式已經在馬鈴薯、向日葵、棉花上進行了相關報道[34-35]。

在本研究中，我國不同寄主來源的輪枝孢菌生理小種是單一類型，即2號生理小種，以及單一的交配型MAT1-2-1。本實驗室通過對全國各地分離到的向日葵黃萎病菌生理小種和交配型進行鑒定后發(fā)現，所有向日葵黃萎病菌生理小種都是2號小種且交配型都是MAT1-2-1型（待發(fā)表），說明無性繁殖可能是目前我國不同作物黃萎病菌的主要繁殖方式，這也預示我國黃萎病菌的遺傳變異程度較小。而不同寄主來源的輪枝孢菌能夠進行交互侵染，且在其分離寄主上表現出強致病性，該結果為今后作物黃萎病綜合防控措施中輪作對象的選擇提供了一定的理論依據。

4 結論

通過對向日葵、棉花、茄子、生菜和馬鈴薯5種不同寄主來源的大麗輪枝孢菌（V.dahliae）和馬鈴薯的黑白輪枝孢菌（V.alboatrum）在不同寄主上交互侵染力進行研究發(fā)現，除來源于生菜的大麗輪枝孢菌外，其他供試菌株對各自寄主都表現出最強的致病性，對寄主以外的其他寄主表現出不同程度的致病性：說明大麗輪枝孢菌具有一定程度的寄生?；?。除生菜黃萎病菌株LS16-1為1號生理小種外，其余8株不同寄主來源的大麗輪枝孢菌均被鑒定為2號生理小種：說明大麗輪枝孢菌的寄主來源、采集樣點和其生理小種類型沒有明顯的相關性。由于我國不同寄主植物大麗輪枝孢菌的優(yōu)勢小種都是2號生理小種，且所有供試菌株的交配型均被鑒定為MAT1-2-1交配型：說明無性繁殖可能是供試的不同寄主大麗輪枝孢菌的主要繁殖形式。

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ZHANG Yuanyuan1,ZHANG Gui1,ZHANG Jian1,ZHANG Guang2,ZHOU Hongyou1,ZHAO Jun1*(1.College of Agronomy, Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China;2.Wulateqianqi Agricultural Department,Wulateqianqi 014400,Inner Mongolia,China)

Verticillium spp.;cross pathogenicity;race type;mating type

S 432.44

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2016.09.281

國家向日葵產業(yè)技術體系項目(CARS-16)；國家公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201103016）。

趙君(http://orcid.org/0000-0001-7207-9289)，E-mail:zhaojun@imau.edu.cn

（First author）：張園園(http://orcid.org/0000-0003-4656-2001)，E-mail:1092403865@qq.com

2016-09-28；接受日期（Accepted）：2016-12-16