脛神經和腓總神經損傷修復后相應脊髓節(jié)段神經元細胞Bcl-2、Bax蛋白表達差異的實驗研究

孫光霞, 林耀發(fā), 張 強, 宗海洋,周 軍, 謝 錚, 邵彎彎, 林浩東, 侯春林

(上海長征醫(yī)院, 1. 醫(yī)療科; 2骨科, 上海, 200003)

脛神經和腓總神經損傷修復后相應脊髓節(jié)段神經元細胞Bcl-2、Bax蛋白表達差異的實驗研究

孫光霞1, 林耀發(fā)2, 張 強2, 宗海洋2,周 軍2, 謝 錚2, 邵彎彎2, 林浩東2, 侯春林2

(上海長征醫(yī)院, 1. 醫(yī)療科; 2骨科, 上海, 200003)

目的 比較大鼠下肢同一平面脛神經、腓總神經損傷修復后相應脊髓節(jié)段神經元細胞Bcl-2、Bax蛋白表達差異。方法 雄性SD大鼠90只隨機分為3組: A組為對照組, B組為脛神經切斷縫合組, C組為腓總神經切斷縫合組。分別于術后1、3、7、14、28 d取大鼠L4～6節(jié)段脊髓進行HE染色，計算脊髓前角運動神經元數量，采用免疫組化檢測Bcl-2、Bax蛋白表達差異，并計算Bcl-2/Bax比值。結果 A組術后脊髓組織未見明顯異常, B、C組術后可見脊髓組織結構紊亂，神經元細胞水腫、壞死。術后1、3、7、14 d, B、C組脊髓前角運動神經元數目均小于A組(P< 0.01)。術后3、7、14、28 d, B組脊髓前角運動神經元數目顯著多于C組(P< 0.01)。B、C組Bcl-2蛋白表達出下降后上升的趨勢，分別于術后3、7 d下降至低谷; B、C組Bax蛋白表達呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢，均于術后3 d上升至高峰; B、C組Bcl-2/Bax比值呈現(xiàn)出先下降后上升趨勢，術后3、7、14、28 d, B組Bcl-2/Bax比值顯著高于C組(P< 0.01)。結論 大鼠下肢同一平面脛神經和腓總神經損傷后都會導致近端脊髓神經元細胞出現(xiàn)凋亡，但是和腓總神經損傷相比，脛神經損傷后對近端神經元退變死亡的影響較小。

脛神經; 腓總神經; 神經損傷; 神經修復; Bcl-2; Bax

周圍神經損傷再生修復一直是國內外研究的熱點。不同部位的周圍神經損傷修復后的功能恢復差異較大，如坐骨神經損傷后，脛神經的功能恢復常優(yōu)于腓總神經[1-4]。造成不同神經再生潛力差異的機制并不明確，可能與相應靶器官、神經結構以及神經元的分布規(guī)律有關[5]。研究[6]表明周圍神經損傷后遠端發(fā)生Wallerian變性的同時，近端也會發(fā)生逆行性潰變，導致神經元細胞凋亡。神經元的退變、凋亡也會影響神經軸突再生和功能恢復[7]。本研究擬建立大鼠下肢同一平面脛神經和腓總神經切斷縫合模型，觀察相應脊髓節(jié)段神經元細胞的形態(tài)、數量，以及Bcl-2、Bax蛋白的表達情況，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

成年雄性SD大鼠90只，體質量(200±20) g, 由上海西普爾-必凱動物實驗有限公司提供。隨機分為3組: A組為正常對照組(n=30), B組為切縫脛神經組(n=30), C組為切縫腓總神經組(n=30)。根據術后存活時間分為1、3、7、14、28 d組，每組6只。

1.2 主要試劑、儀器

手術顯微鏡(上海精密儀器儀表有限公司，中國); 顯微外科器械(寧波市成和顯微外科器械公司，中國); 光學顯微鏡(Olympus公司，日本); Bax、Bcl-2免疫組化試劑盒(Dako公司，丹麥)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備: B、C組大鼠以2.5%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔內注射麻醉。俯臥位固定，無菌條件下取右側股后正中切口，鈍性分離肌肉，于大鼠右側臀肌間隙暴露坐骨神經，順著外膜組織鈍性分離脛神經和腓總神經; B組在距梨狀肌下緣0.8 cm處切斷脛神經, C組于同一水平切斷腓總神經。在手術顯微鏡下以11-0尼龍縫合線行神經端端吻合，術后給予適量抗生素預防感染。A組僅暴露坐骨神經，不做特殊處理。

1.3.2 取材: 動物存活相應時間后，再次腹腔注射麻醉，仰臥位固定。取胸部正中切口，縱行切開胸骨，暴露胸腔及心臟，小心剪開心包，于心尖處剪1個小口，經左心房插管至主動脈，結扎固定導管位置，再于右心耳處剪開1個小口放血，快速灌注0.01 mol/L PBS 250 mL, 待右心耳流出的液體變清亮后繼續(xù)緩慢灌注4%的多聚甲醛1 h。待確認大鼠硬化固定后，從腰后正中入路切開皮膚，逐層切除腰后肌肉，暴露大鼠腰椎。仔細咬除椎板后，完整取出L4-6節(jié)段的脊髓節(jié)段約5 mm, 立即置于液氮中保存。

1.3.3 運動神經元計數: 于液氮灌中取出L4-6節(jié)段脊髓組織, OCT包埋、切片，厚約20 μm, 每間隔5張留取1張，裱片, HE染色，梯度乙醇脫水、封固、觀察。每只大鼠隨機選取3張切片，直接在顯微鏡下放大200倍進行脊髓前角運動神經元胞體計數，在不同時間點每張切片選取10個高倍視野進行神經元計數。

1.3.4 凋亡相關基因Bcl-2、Bax蛋白檢測: 采用免疫組化試劑盒進行檢測。每只大鼠隨機選取5張切片，采用圖像分析軟件進行半定量分析，以陽性產物的平均光密度度值作為Bax、Bcl-2的表達的定量指標，并計算Bcl-2/Bax比值。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行分析。數據以均數±標準差表示。測量所得結果用重復測量的方差分析(ANOVA)進行組間比較。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 HE染色

術后不同時間，A組均可觀察到大、中型神經元胞體，呈星型，團簇狀分布于脊髓前角。胞體體積大于周圍膠質細胞，核大而圓，呈嗜堿性深染，核仁明顯，胞漿內可見尼氏體。術后1、3、7 d均可見到B、C組脊髓前角組織結構紊亂、水腫，神經元細胞數量明顯減少，可見凋亡細胞，胞體明顯縮小、變形，胞核致密深染，胞漿深染，呈深紅色，細胞周圍有較多空暈存在。術后14、28 d脊髓前角組織結構較前逐漸恢復，神經元細胞數量逐漸增多，凋亡細胞數量減少，膠質細胞增生。B組術后14、28 d脊髓組織恢復較C組良好(圖1、2)。

圖1 B組術后7d脊髓前角HE染色 200倍

圖2 C組術后7d脊髓前角HE染色 200倍

2.2 運動神經元計數

B組脊髓前角運動神經元數目在術后1 d出現(xiàn)減少，術后3 d降至最低，隨后逐漸開始增多，至術后28 d接近正常; C組脊髓前角運動神經元數目在術后1 d出現(xiàn)減少，術后7 d降至最低，隨后逐漸開始增多，術后28 d計數仍小于術后1 d值。

術后1、3、7、14 d, B組脊髓前角運動神經元數目顯著少于A組(P<0.01); 術后28 d, 2組比較無顯著差異 (P>0.05); C組與A組術后1、3、7、14、28 d比較有顯著差異(P<0.01); 術后3、7、14、28 d, B組脊髓前角運動神經元數目顯著多于C組(P<0.01), 術后1 d相比無顯著差異(P>0.05), 見表1。

表1 脊髓前角運動神經元計數

與A組相比, **P<0.01; 與C組相比, ##P<0.01。

2.3 Bcl-2、Bax蛋白表達變化

Bcl-2、Bax染色定位于胞漿，陽性染色呈棕黃色，細胞核不著色。A組未見明顯陽性染色。B、C組Bcl-2蛋白表達呈現(xiàn)先下降、后上升趨勢，分別于術后3、14 d下降至低谷; B、C組Bax蛋白表達呈現(xiàn)先上升、后下降趨勢，均于術后3 d上升至高峰。術后3、7、14、28 d, B組Bcl-2/Bax值均顯著高于C組(P< 0.01), 見表2及圖3、4、5、6。

表2 脊髓前角Bcl-2/Bax比值

與C組相比, **P< 0.01。

3 討 論

作者前期動物實驗研究[8]發(fā)現(xiàn)，獼猴下肢同一平面脛神經損傷修復后再生速度明顯快于腓總神經，脛神經支配的靶肌肉功能恢復也優(yōu)于腓總神經，證實了不同周圍神經損傷后再生潛力存在差異性。

神經細胞作為一個形態(tài)和功能的整體，胞體與軸突之間聯(lián)系十分密切。神經纖維的軸漿運輸對神經元的生存以及正常生理功能的維持均起十分重要的作用，因此軸突損傷必然會累及神經元[9]。研究[6]表明，周圍神經損傷后其近側端發(fā)生逆行性潰變，神經元也會發(fā)生不同程度的變性甚至死亡，目前認為神經元的這種死亡為凋亡。而神經元的退變、死亡也會影響神經軸突的再生和功能恢復[7]。軸突損傷后，除產生上述變性反應外，也會產生再生性改變，在形態(tài)上表現(xiàn)為生長錐形成，相應神經元胞體合成代謝增強，如多胺生成酶暫時上調，從而使腐胺、精胺、亞精胺促進軸突生長[10]。因此周圍神經損傷后神經元細胞體是否存活以及神經元的功能狀態(tài)是神經損傷后功能恢復與否的關鍵性因素之一。只有受損神經元胞體的存活且有再生能力，才能夠調控軸突成功再生。如果變性期神經元死亡過多，將無法合成充分的營養(yǎng)物質供軸突修復再生需要。目前研究[11]認為周圍神經損傷后神經元胞體死亡與動物年齡、軸突損傷部位、損傷性質以及神經元的類型有關。但不同周圍神經損傷后相應的脊髓前角運動神經元退變死亡程度是否存在差異并不明確。

圖3 B組術后7dBcl-2蛋白表達 400倍

圖4 C組術后7dBcl-2蛋白表達 400倍

圖5 B組術后7dBax蛋白表達 400倍

圖6 C組術后7dBax蛋白表達 400倍

細胞凋亡進程可以分為誘導期、效應期和降解期。在誘導期，細胞接受各種信號，從而引發(fā)各種不同的效應。進入效應期后，經過一些決定細胞存活(死亡)的分子調控點，細胞進入不可逆的程序化死亡。這些調控分子包括一系列原癌基因和抑制癌基因的產生，其中Bcl-2家族起著決定性的作用，降解期則產生可見的凋亡現(xiàn)象。Bcl-2基因是一種原癌基因，通過細胞催化抗氧化作用、抑制鈣離子跨膜流動、離子通道蛋白和吸附/錨定蛋白、與Bax形成異源二聚體、抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-3)的活化等阻斷細胞凋亡的早期環(huán)節(jié)來發(fā)揮作用[12]。Bcl-2蛋白是一種與細胞器，尤其是線粒體膜相關的穩(wěn)定蛋白，主要位于線粒體外膜、內質網膜和核膜，其可保護膜的穩(wěn)定性，減少細胞內、核內Ca2+濃度的改變，從而阻止凋亡信號的傳導。Bcl-2基因的表達及其蛋白增加可抑制細胞凋亡，提高細胞存活能力。Bax基因與Bcl-2基因具有高度的同源序列, Bcl-2和Bax可相互作用為二聚體。Bax基因所編碼的膜相關蛋白是一種強有力的細胞死亡促進因子。Bax增高，促進細胞凋亡并抑制Bcl-2的抗凋亡作用[13]。Bcl-2蛋白的活化受Bax的調節(jié), Bax的表達可以增加線粒體的通透性，釋放Cytc入細胞質，激活caspase-3, 從而引發(fā)細胞凋亡。同時, Bcl-2/Bax的比值在細胞凋亡中起關鍵作用，比值高，細胞存活率高; 比值低，細胞存活率低。測定Bcl-2/Bax的比值有助于判斷是否發(fā)生凋亡[14]。因此，本研究也采用Bcl-2/Bax的比值來比較脛神經和腓總神經損傷后近端神經元的凋亡發(fā)生情況。

本研究發(fā)現(xiàn)，脛神經和腓總神經損傷后，脊髓前角組織均出現(xiàn)結構紊亂、細胞數目減少，并出現(xiàn)細胞凋亡現(xiàn)象。脛神經損傷損傷修復后，脊髓前角運動神經元數目早期出現(xiàn)減少，于術后3 d下降至最低值，隨后逐漸增加，至術后28 d時與正常組無顯著差異。腓總神經損傷修復后，脊髓前角運動神經元減少呈現(xiàn)較為緩慢的變化，逐漸下降，至術后7 d下降至最低值，隨后緩慢增加，至術后28 d仍低于正常組。術后3、7、14、28 d, B組脊髓前角運動神經元數目多于C組。脛神經和腓總神經損傷修復后，脊髓前角Bcl-2和Bax表達出現(xiàn)動態(tài)變化過程[15-17]。Bcl-2表達趨勢為先下降后上升, Bax表達趨勢是先上升后下降。Bcl-2/Bax比值在脛神經和腓總神經損傷修復組均呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，在脛神經損傷修復組術后3 d下降至最低，在腓總神經損傷修復組術后7 d下降至最低。術后3、7、14、28 d, B組Bcl-2/Bax值均高于C組。結合脊髓前角運動神經元計數和Bcl-2/Bax比值，可發(fā)現(xiàn)脛神經損傷后對近端神經元退變死亡的影響較小，這可能是同一平面的脛神經和腓總神經損傷修復后脛神經功能恢復相對較好的原因[18-19]。

綜上所述，大鼠下肢同一平面的脛神經和腓總神經損傷后都會導致近端脊髓神經細胞出現(xiàn)凋亡，但是脛神經損傷后導致的神經細胞凋亡數較少，即脛神經損傷后對近端神經元退變死亡的影響較小，這可能是不同周圍神經損傷后再生潛力存在差異的機制之一。

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Expression of Bcl-2 and Bax proteins in the neurons of spinal cord segment after tibial nerve and common peroneal nerve injuries in rats

SUN Guangxia1, LIN Yaofa2, ZHANG Qiang2, ZONG Haiyang2, ZHOU Jun2, XIE Zheng2, SHAO Wanwan2, LIN Haodong2, HOU Chunlin2

(1. Medical Department; 2. Department of Orthopedics, Shanghai Changzheng Hospital, Shanghai, 20003)

Objective To explore the expressions of Bcl-2 and Bax proteins in the neurons of spinal cord after tibial nerve and common peroneal nerve injuries in rats. Methods A total of 90 male SD rats were randomly divided into three groups, the group A was as control group, group B as suture of tibial nerve cut group, and group C as suture of the common peroneal nerve cut group. The L4-6segment spinal cord of the rats were removed for HE staining and immumohistochemical staining on 3, 7, 14, 28 days after the operation. The number of motor neurons in the spinal anterior horn were calculated. The expressions differences of Bcl-2 and Bax proteins were detected by immuno-histochemistry, and values of Bcl-2/Bax were calculated. Results The number of motor neurons in the anterior horn of spinal cord in group B were less than that in group C on 1, 3, 7, 14, 28 days after the operation (P< 0.01). The expression of Bcl-2 protein in group B and group C showed an upward and then declining trend. It decreased to the lowest on the postoperative 3 d in group B and 7 d in group C, respectively. The expressions of Bax protein in group B and C showed an upward and then declining trend, and it increased to the highest on the postoperative 3 d in groups B and C. The values of Bcl-2/Bax in groups B and C were showed an decreased and then increased trend and it was lower in group B than group C on the postoperative 3, 7, 14, 28 d(P< 0.01). Conclusion Injuries of tibial nerve and common peroneal nerve of the rats would lead the apoptosis of motor neurons in the spinal cord, but compared with the injury of common peroneal nerve, tibial nerve injury would lead less apoptosis of motor neurons.

tibial nerve; common peroneal nerve; nerve injury; nerve repairmen; Bcl-2; Bax

2017-03-20

國家自然科學基金(81572146)

林浩東

R 741

A

1672-2353(2017)15-005-05

10.7619/jcmp.201715002