固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜法檢驗(yàn)人血漿中的地芬諾酯

欒玉靜郝廣賓金昌鋒王愛華任昕昕

（1 公安部物證鑒定中心 北京 100038；

2 北京市現(xiàn)場物證檢驗(yàn)工程技術(shù)研究中心 北京 100038；3 濟(jì)南市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所 山東 濟(jì)南 250115）

固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜法檢驗(yàn)人血漿中的地芬諾酯

欒玉靜1,2郝廣賓3金昌鋒3王愛華1,2任昕昕1,2

（1 公安部物證鑒定中心 北京 100038；

2 北京市現(xiàn)場物證檢驗(yàn)工程技術(shù)研究中心 北京 100038；3 濟(jì)南市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所 山東 濟(jì)南 250115）

應(yīng)用固相萃取結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜（SPE-LC/ MS）的方法檢驗(yàn)人血漿中地芬諾酯。采用SPE提取血漿，用LC-MS/MS方法測定。人血漿中地芬諾酯在1ng/mL～500ng/mL范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r=0.9992），最低檢出限為0.1ng/mL，回收率為78.1%～92.1%，日內(nèi)日間精密度均小于9.5%。該實(shí)驗(yàn)方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，能滿足人血漿中地芬諾酯的檢驗(yàn)。

地芬諾酯 固相萃取 液相色譜-質(zhì)譜 中毒

1 引言

地芬諾酯，又名苯乙哌啶，氰苯哌酯，化學(xué)名稱是1-（3，3-二苯基-3-氰基丙基）-4-苯基-4-哌啶甲酸乙酯（化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示）[1]。當(dāng)口服苯乙哌啶超過40~60mg·d-1時，有嗎啡樣欣快感、愉悅感，長期服用后可形成依賴，因而常被吸毒人員作為海洛因暫時替代品吸食濫用。由于地芬諾酯濫用者往往是大劑量或與多種藥物合并使用，極易發(fā)生過量中毒或中毒致死。此外，由于地芬諾酯有甜味，往往會有兒童因誤食中毒案件發(fā)生，且呈逐年上升的趨勢[2]。

隨著對傳統(tǒng)毒品海洛因打擊力度的增加和戒毒工作的全面展開，地芬諾酯濫用的報道越來越多，國內(nèi)外關(guān)于地芬諾酯的檢測研究大多是對臨床上藥物片劑的分析[3-5]，也有生物檢材的檢測報道[6-7]，但方法靈敏度低，檢出限高。因此，建立生物檢材中地芬諾酯的檢驗(yàn)方法已成為法醫(yī)毒物分析領(lǐng)域亟需解決的問題，不僅可為刑事相關(guān)案件中地芬諾酯的檢驗(yàn)提供方法，也可為臨床救治及監(jiān)控提供基礎(chǔ)[8]。液相色譜質(zhì)譜法是目前法庭科學(xué)常用的檢驗(yàn)生物檢材中毒物的方法。本文通過固相萃取結(jié)合液相色譜質(zhì)譜法建立人血漿中地芬諾酯的檢驗(yàn)方法，解決了地芬諾酯中毒案件中的檢驗(yàn)難題，為公安機(jī)關(guān)執(zhí)法辦案提供有效證據(jù)。

圖1 地芬諾酯的結(jié)構(gòu)

2 材料與方法

2.1 主要儀器與設(shè)備

UPLC-XevoTM TQ MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，包括Mass Lynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Waters公司）；SORVALLR 高速離心機(jī)（美國SORVALL公司）；BP210s電子分析天平（0.1mg~220g）（德國Satorius公司）；Vortex Genie-2 渦旋混合器（美國Scientific Industries公司）；EYELA CM-100高速振蕩器（日本東京理化器械株式會社）；Millpore Simplicity純水制備系統(tǒng)（美國Millpore公司）；10~100μL，20~200μL，10~1000μL，1~10mL自動移液槍（法國GILSON公司）；OasisR MCX固相萃取小柱（60mg，3cc）（美國Waters公司）；0.22μm有機(jī)過濾膜（北京八方公司）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品、試劑與生物樣本

地芬諾酯標(biāo)準(zhǔn)品（國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，純度大于99.9%），乙腈、甲醇和甲酸（色譜純，F(xiàn)isher），鹽酸、氨水（分析純，北京化學(xué)試劑公司），去離子水（Milipore），空白人血漿（北京復(fù)興醫(yī)院）。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品儲備液的配制

精密稱取地芬諾酯標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg，置于10mL棕色容量瓶中，加少量甲醇溶解并稀釋至刻度，得到1.0mg/mL地芬諾酯儲備液，置于4℃冰箱存放備用。實(shí)驗(yàn)過程中根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，精密吸取儲備液，用甲醇逐級稀釋所需濃度即可。

2.4 樣品處理

取1.0mL血漿樣品于10mL試管中，加入0.2 mL甲醇，混旋20s，然后加1%鹽酸溶液 4mL，充分混懸，離心上清液待過柱。取固相萃取MCX柱，依次以3mL甲醇、3mL水活化，然后加入樣品的離心上清液，流速為1.0 mL/min~1.5 mL/min，再依次加入3 mL水、3mL甲醇和3mL乙腈淋洗，4000轉(zhuǎn)/秒離心5 min，再以3 mL、5%氨水-乙腈洗脫，收集洗脫液，供儀器檢測。

2.5 儀器檢測條件

表1 梯度洗脫條件

表2 MS/MS條件

3 結(jié)果與討論

3.1 線性關(guān)系考察

取空白人血漿1.0mL，在其中添加地芬諾酯儲備液，使待測樣品濃度分別為1、5、50、100、200、500ng/mL，按照2.4樣品處理方法進(jìn)行提取，LC-MS/MS測定。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)作線性回歸?；貧w方程為：y=6.185X-1.657；r2=0.9992。結(jié)果表明，地芬諾酯在濃度為1~500ng/mL范圍內(nèi)峰面積與濃度呈線性相關(guān)。最低檢出限（S/N=3）是0.1ng/mL，檢測限（S/ N=10）是1.0g/mL。

3.2 方法專屬性考察

取空白血，加入一定量的地芬諾酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照2.4進(jìn)行樣品制備，按照2.5進(jìn)行分析檢測，同時做空白血的對照試驗(yàn)，將兩者的圖譜進(jìn)行比較（見圖2和圖3）。結(jié)果在地芬諾酯出峰時間段內(nèi)，空白檢材均未出現(xiàn)明顯的色譜峰，表明生物檢材中內(nèi)源性雜質(zhì)不會對地芬諾酯的測定造成干擾，說明方法具有較高的專屬性。

3.3 回收率和精密度考察

取空白人血漿1.0mL，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液，制備成地芬諾酯濃度為5.0、50.0、500.0ng/mL的制備樣品，每個濃度平行做5個樣品，一天內(nèi)早中晚分別檢測3次，連續(xù)5天進(jìn)行檢驗(yàn)，得到3種濃度的回收率和日內(nèi)日間精密度（見表3）。

圖2 空白血的LC/MS/MS 色譜圖

圖3 血漿中地芬諾酯的LC/MS/MS色譜圖

表3 地芬諾酯的回收率和精密度(n=5)

3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將上述制備樣品分別于0、1、5、10、24h進(jìn)行測定，以地芬諾酯峰面積進(jìn)行計算，RSD為0.72%。結(jié)果表明，樣品在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.5 固相萃取條件的選擇

MCX萃取柱是一種離子交換柱，其基本的原理是靜電吸引，即化合物上的帶電荷基團(tuán)與鍵合硅膠上的帶電荷基團(tuán)之間的吸引。MCX萃取柱本身帶有電荷，為了使樣品中的地芬諾酯吸附到MCX萃取柱上，一定要選擇合適的樣品pH值。本文選用1%鹽酸對生物樣本進(jìn)行稀釋，它不僅可以使樣品中的地芬諾酯處于帶電狀態(tài)，且有沉淀蛋白的作用。

洗脫液的選擇：研究對甲醇:氨水（95:5）、乙腈:氨水（95:5）、三氯甲烷:異丙醇:氨水（78:30:2）3種洗脫溶液進(jìn)行了比較。在1mL血中添加100ng地芬諾酯，平行萃取3份，按照2.5進(jìn)行檢測，記錄回收率，結(jié)果表明后兩種洗脫溶劑洗脫的萃取物相對干凈，回收率較高（見表4）。由于三氯甲烷與水的互溶性差，不適用于液相系統(tǒng)，用三氯甲烷:異丙醇:氨水（78:30:2）進(jìn)行洗脫后，需要揮去有機(jī)溶劑重新定容，步驟相對繁瑣，所以本文選用與水互溶性好的乙腈:氨水（95:5）作為洗脫液。

表4 不同洗脫液回收率

本研究建立了固相萃取結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜法方法測定人血漿中地芬諾酯的方法。該方法回收率高、重現(xiàn)性好、檢測限低、操作簡單快速，適用于臨床和涉及地芬諾酯案件中地芬諾酯的檢測。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:842-843.

[2]孫靜,秦侃.復(fù)方地芬諾酯不良反應(yīng)引起的兒童用藥安全性問題并文獻(xiàn)分析[J].海峽藥學(xué),2016(6):131-134.

[3]姚克榮,王玉,紀(jì)宇,等.HPLC法同時測定復(fù)方地芬諾酯片中鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品含量[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究, 2006(6):386-388.

[4]孫麗,王敬偉.HPLC法測定鹽酸地芬諾酯的含量[J].黑龍江醫(yī)藥,2009(3):249-250.

[5]何建鋒,郭瑞鋒,郄冰冰.高效液相色譜法同時測定復(fù)方地芬諾酯片中兩組分含量[J].藥物鑒定,2010(5):22-23.

[6]李嘉琳,孫愛麗,徐水英,等.LC-MS/MS法測定人血清中地芬諾酯的濃度及其臨床應(yīng)用[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2010(7):1678-1681.

[7]廖洪梅,魏曉飛,許其華.地芬諾酯的GC/MS分析檢驗(yàn)[J].刑事技術(shù),2008(4):56-57.

[8]欒玉靜,董穎,王瑞花.地芬諾酯中毒及檢驗(yàn)方法研究進(jìn)展[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2013(4):294-296.

（責(zé)任編輯：孟凡騫）

DF795.1

A

2095-7939（2017）04-0075-03

10.14060/j.issn.2095-7939.2017.04.014

2017-01-13

公安技術(shù)交流培訓(xùn)計劃項目（編號：2015PX03）。

欒玉靜（1979-），女，山東龍口人，公安部物證鑒定中心副研究員，博士，主要從事毒物檢驗(yàn)鑒定工作。