扶正化瘀方對(duì)慢性肝損傷大鼠慢加急性肝衰竭形成的預(yù)防作用*

汪增秀廉亞男譚善忠，△孫薇薇沈建軍肖 倩梁重鋒蔣淑蓮

（1.南京市第二醫(yī)院，江蘇 南京 210003；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210006）

扶正化瘀方對(duì)慢性肝損傷大鼠慢加急性肝衰竭形成的預(yù)防作用*

汪增秀1廉亞男1譚善忠1，2△孫薇薇2沈建軍2肖 倩2梁重鋒2蔣淑蓮2

（1.南京市第二醫(yī)院，江蘇 南京 210003；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210006）

目的 觀察扶正化瘀方干預(yù)治療對(duì)于慢加急性肝衰竭（ACLF）形成及嚴(yán)重程度的影響。方法 66只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組（6只）、急性肝衰竭組（8只）、慢性肝炎模型組（6只）、慢性肝炎干預(yù)組（6只），ACLF模型組（20只）、ACLF干預(yù)組（20只），采用50%CCl4植物油溶液腹腔注射建立慢性肝炎模型，干預(yù)組予扶正化瘀方灌胃干預(yù)治療，第9周用D-氨基半乳糖急性攻擊正常大鼠、慢性肝炎模型大鼠和慢性肝炎干預(yù)組大鼠建立急性肝衰竭或ACLF模型，12 h后觀察各組死亡率、肝功能及肝臟病理等變化。結(jié)果 大鼠造模9周，慢性肝炎模型組大鼠較正常組大鼠肝體比顯著升高，肝功能指標(biāo)明顯惡化；病理顯示肝細(xì)胞損傷，炎細(xì)胞侵潤(rùn)。慢性肝炎干預(yù)組肝體比和肝功能指標(biāo)較慢性肝炎模型組有明顯改善；病理上炎癥明顯減輕。急性損傷后12 h，急性肝衰竭組、ACLF模型組、ACLF干預(yù)組死亡率分別為0%、100.00%、25.00%。急性肝衰竭組、ACLF模型組肝功能指標(biāo)較正常組明顯惡化，病理見大量肝細(xì)胞壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。而ACLF干預(yù)組較ACLF模型組肝功能指標(biāo)和肝細(xì)胞壞死和炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。結(jié)論 扶正化瘀方明顯減輕ACLF形成時(shí)的嚴(yán)重程度，降低死亡率，對(duì)于ACLF有著積極的預(yù)防作用。

扶正化瘀方 慢加急性肝衰竭 防治

盡管目前研究識(shí)別了慢加急性肝衰竭 （ACLF）重要的誘發(fā)因素及預(yù)后標(biāo)志物，但ACLF仍然是一個(gè)高死亡率的疾病。ACLF防與治的關(guān)鍵是誘發(fā)ACLF突發(fā)事件的早期識(shí)別、更接近于實(shí)際的潛在發(fā)病機(jī)制的研究以及有效的積極救治［1-2］。實(shí)際上，ACLF既是一個(gè)急性嚴(yán)重肝損傷，又有著一個(gè)慢性肝損傷過(guò)程，那么，慢性肝損傷過(guò)程的積極干預(yù)，對(duì)不可預(yù)測(cè)而發(fā)生的急性嚴(yán)重肝損傷是否有著積極意義呢？本研究選擇已應(yīng)用于臨床、對(duì)慢性肝炎和肝硬化有較好療效，尤其抗肝纖維化作用突出的扶正化瘀方［3-4］，干預(yù)治療CCl4慢性肝損傷模型大鼠，探討扶正化瘀方對(duì)于ACLF形成時(shí)的嚴(yán)重程度和高死亡率產(chǎn)生的預(yù)防作用?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 扶正化瘀方：丹參、蟲草菌絲、絞股藍(lán)、桃仁、五味子及松花粉，由上海黃海制藥廠提供。其浸膏干粉由上?，F(xiàn)代中醫(yī)藥技術(shù)發(fā)展公司提供，以雙蒸水稀釋成含生藥460 mg/mL的藥液［5］。D-氨基半乳糖購(gòu)自江蘇省啟東市久豐工貿(mào)有限公司。50%CCl4植物油溶液，法瑪西亞-普強(qiáng)公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Wistar大鼠，SPF級(jí)，66只，體質(zhì)量120～150 g，購(gòu)自北京維通利華（證書號(hào)：中科動(dòng)管第003），飼養(yǎng)于南京墨跡生物科技發(fā)展有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲食。

1.3 模型與分組 66只大鼠隨機(jī)分為正常組6只、急性肝衰竭組8只、慢性肝炎模型組6只、慢性肝炎干預(yù)組（6只），ACLF模型組（慢加急肝衰模型組）20只、ACLF干預(yù)組（慢加急肝衰干預(yù)組）20只。慢性肝炎模型組、慢性肝炎干預(yù)組，ACLF模型組、ACLF干預(yù)組每周兩次皮下注射50%CCl4植物油溶液建立慢性肝炎模型，共注射9周。劑量：前4周1.5 mL/kg體質(zhì)量，以后2 mL/kg體質(zhì)量。正常組、急性肝衰竭組皮下注射同等劑量植物油。同時(shí)慢性肝炎干預(yù)組和ACLF干預(yù)組每天灌胃扶正化瘀浸膏4.6 g/kg體質(zhì)量。正常組、急性肝衰竭組、慢性肝炎模型組和ACLF模型組每天灌胃0.9%氯化鈉注射液4.6 g/kg體質(zhì)量。9周后急性肝衰竭組、ACLF模型組和ACLF干預(yù)組給予腹腔注射0.5 g/kg D-氨基半乳糖急性攻擊致肝衰竭，正常組、慢性肝炎模型組、慢性肝炎干預(yù)組腹腔注射同等劑量生理鹽水以對(duì)照。大鼠肝衰竭攻擊后，12 h內(nèi)連續(xù)觀察，大鼠出現(xiàn)瀕死癥狀（呼吸微弱，不能站立）時(shí)處死計(jì)數(shù)，至ACLF模型組最后1只出現(xiàn)瀕死癥狀時(shí)處死全部大鼠，每只大鼠留取血清及肝組織標(biāo)本。

1.4 指標(biāo)檢測(cè) 肝體比：稱大鼠體質(zhì)量與肝濕質(zhì)量，肝體比＝肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量；以“mg/g”表示。肝功能：檢測(cè)血清總膽紅素（TBil）、白蛋白（Alb）、丙氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）；肝組織炎癥：肝組織標(biāo)本采用中性緩沖甲醛液固定，石蠟包埋，作HE染色，光鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、肝體比和死亡率比較 見表1。正常組大鼠活動(dòng)自如，毛發(fā)光亮。慢性肝炎模型組大鼠消瘦無(wú)力、毛無(wú)光澤，較正常組、急性肝衰竭組體質(zhì)量下降，肝體比上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。慢性肝炎干預(yù)組較慢性肝炎模型組體質(zhì)量增加，肝體比下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。急性損傷后12 h，急性肝衰竭組、ACLF模型組、ACLF干預(yù)組肝體比均見增加。ACLF模型組各指標(biāo)較急性肝衰竭組增加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而ACLF干預(yù)組各指標(biāo)較ACLF模型組有顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。急性肝衰竭組、慢加急肝衰模型組、慢加急肝衰干預(yù)組死亡率分別為0%、100.00%、25.00%。ACLF干預(yù)組較ACLF模型組死亡率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、肝體比和死亡率比較（±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量、肝體比和死亡率比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.05；與慢性肝炎模型組比較，#P＜0.05；與急性肝衰竭組比較，△P＜0.05，與ACLF模型組比較，▲P＜0.05。下同。

組別 n 死亡率（%）正常組 6 0（0）慢性肝炎模型組 6 0（0）慢性肝炎干預(yù)組 6 0（0）519.35±21.53 3.92±0.29 ACLF模型組 19 414.21±27.28△7.02±0.87△19（100.00）△ACLF干預(yù)組 20 445.22±23.25▲5.80±1.17▲5（25.00）▲體質(zhì)量（g） 肝體比（mg/g）507.32±22.25 3.60±0.09 415.18±16.43*△6.44±0.46*△446.88±26.98#4.77±0.38#急性肝衰竭組 8 0（0）

2.2 各組大鼠肝功能變化比較 見表2。正常組大鼠肝功能指標(biāo)處于正常范圍。慢性肝炎模型組較正常組TBil、ALT上升，Alb減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。慢性肝炎干預(yù)組較慢性肝炎模型組TBil、ALT均有下降，Alb上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。急性損傷12 h后，急性肝衰竭組、ACLF模型組、ACLF干預(yù)組TBil、ALT均明顯惡化。其中ACLF模型組較急性肝衰竭組上升明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而ACLF干預(yù)組較ACLF模型組有顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表2 各組大鼠肝功能變化比較（±s）

表2 各組大鼠肝功能變化比較（±s）

組別 n ALT（IU/L）正常組 6 153.83±83.23慢性肝炎模型組 6 357.67±101.12*慢性肝炎干預(yù)組 6 230.17±28.56#3.40±1.52 33.63±2.00 ACLF模型組 19 4.48±2.96△33.78±3.42 1552.89±1481.62△ACLF干預(yù)組 20 3.10±2.74▲30.43±2.76 1123.29±965.94▲TBil（μmol/L） Alb（g/L）1.23±0.67 42.67±1.51 1.47±0.39*34.50±1.52*1.28±0.34#38.50±1.87#急性肝衰竭組 8 1352.63±849.04

2.3 各組大鼠肝組織炎癥情況比較 見圖1。HE染色顯示：正常組大鼠肝組織未見肝細(xì)胞變性、壞死等改變；慢性肝炎模型組較正常組肝組織肝細(xì)胞呈氣球樣變、脂肪變性、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及中央靜脈分布的肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，而慢性肝炎干預(yù)組及慢性肝炎模型組肝細(xì)胞脂肪樣變、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死程度均較輕。急性損傷12 h后，急性肝衰竭組、慢加急肝衰模型組、慢加急肝衰干預(yù)組均見肝細(xì)胞大塊壞死，炎癥細(xì)胞顯著浸潤(rùn)。ACLF模型組較急性肝衰竭組程度尤為嚴(yán)重。ACLF干預(yù)組較急性肝衰竭組肝細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有明顯改善。

圖1 各組大鼠肝組織炎癥的情況（HE染色，400倍）

3 討 論

ACLF是在慢性肝炎或肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的肝衰竭，是一個(gè)獨(dú)特的臨床疾?。?-8］，盡管識(shí)別了ACLF重要的誘發(fā)因素及預(yù)后標(biāo)志物，ACLF仍然是一個(gè)伴隨著高死亡率的疾病。目前病因治療絕大多數(shù)研究并沒有顯示任何顯著地改善生存［9-10］，肝臟支持系統(tǒng)——分子吸咐再循環(huán)系統(tǒng)（MARS）的治療對(duì)于改善肝衰竭患者存活率也沒有明顯的效果，且MARS作為慢加亞急性肝衰竭患者過(guò)渡到肝移植的一個(gè)治療手段仍有待確定［11］。肝移植是治療慢乙肝ACLF最后的治療方法［12］，由于肝源缺乏和費(fèi)用高昂，對(duì)于大多數(shù)發(fā)展中國(guó)家患者來(lái)說(shuō)是奢侈的，因此，對(duì)于慢性肝病患者，在其病程中，如何減少ACLF的發(fā)生、減輕嚴(yán)重程度顯得尤為重要。

扶正化瘀方由丹參與蟲草等組成，功能補(bǔ)虛養(yǎng)陰，活血化瘀，既往研究發(fā)現(xiàn)對(duì)肝纖維化有良好作用［13-15］，其作用機(jī)制與改善肝臟炎癥、促進(jìn)過(guò)度增生沉積的肝臟ECM降解有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，扶正化瘀方可以顯著改善患者中醫(yī)癥狀評(píng)分，從而改善患者生存質(zhì)量［16］。

本實(shí)驗(yàn)顯示扶正化瘀方能顯著降低有CCl4誘導(dǎo)的慢性肝炎模型大鼠肝體比、改善其肝功能，病理提示扶正化瘀方能減輕肝組織炎癥，有著良好的抗肝臟炎癥作用。急性損傷12 h結(jié)果提示，急性肝衰竭組、ACLF模型組、ACLF干預(yù)組死亡率分別為0%、100.00%、25.00%。ACLF干預(yù)組較ACLF模型組死亡率明顯下降；表明大鼠慢性肝損傷病程中扶正化瘀方預(yù)防性用藥可明顯降低ACLF死亡率。肝功能檢測(cè)和病理染色也顯示，ACLF模型組較急性肝衰竭組肝細(xì)胞炎癥、壞死明顯，ACLF干預(yù)組較ACLF模型組炎癥、壞死均有明顯減輕，表明大鼠慢性肝損傷病程中扶正化瘀方預(yù)防性用藥可明顯減輕ACLF損傷程度。

總之，CCl4大鼠肝損傷形成過(guò)程中，予以扶正化瘀方干預(yù)治療明顯減輕炎癥形成，這對(duì)于ACLF預(yù)防的意義在于：一旦ACLF不可避免而形成，由于扶正化瘀方的干預(yù)治療，可以明顯減輕ACLF形成時(shí)的嚴(yán)重程度，明顯降低其死亡率。

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The Prevention Effect of Fuzheng Huayu Decoction（FZHY）on the Formation of Acute on Chronic Liver Failure in Rats Suffering From Chronic Liver Injury

WANG Zengxiu，LIAN Ya′nan，TAN Shanzhong，et al. The Second Hospital of Nanjing，Jiangsu，Nanjing 210003，China.

Objective：To explore the prevention effect of FZHY recipe on the formation of acute on chronic liver failure.Methods：66 male Wistar rats were randomly divided into normal control group（6），acute liver failure group（8），chronic hepatitis model group（6），chronic hepatitis intervention group（6），acute on chronic liver failure model group（20），cute on chronic liver failure intervention group（20）.50%carbon tetrachloride vegetable oil solution was intraperitoneally injected to establish liver injury models，F(xiàn)ZHY recipe was dosed to intervention group. After 9 weeks，D-galactosamine was simultaneously intraperitoneally injected to normal rats of chronic hepatitis，chronic hepatitis model rats and the intervention group to establish acute liver failure or acute on chronic liver failure models.In 12 hours after the acute attack，the mortality，liver function，liver pathological changes were observed.Results：In the ninth week，chronic hepatitis model group had higher liver/body rate and worse liver function than the normal group and pathologically liver cell injury，inflammatory cells invasion were detected in the chronic hepatitis model group.Compared with chronic hepatitis model group，liver/body rate and liver function in chronic hepatitis intervention group had been improved obviously，including liver cell injury and inflammatory cells invasion.In 12 hours after the acute injuries，the mortality rates in acute liver failure group，chronic on acute hepatic failure model group and chronic on acute hepatic failure intervention group were 0%，100%and 25%respectively.Acute liver failure group and acute on chronic hepatic failure model group had significantly worse liver function，pathologically massive necrosis of liver cells and infiltration of inflammatory cells than the normal group. Compared with chronic on acute hepatic failure model group，liver function had been improved significantly in chronic on acute hepatic failure intervention group，including necrosis of liver cells and infiltration of inflammatorycells pathologically.Conclusion：FZHY recipe can reduce severity and mortality of acute on chronic liver failure significantly，has significant prevention effect in the formation of acute on chronic liver failure in rats suffering from chronic liver injury.

FZHY Recipe；Acute on chronic liver failure；Prevention and treatment

R285.5

A

1004-745X（2017）08-1333-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.08.006

2016-08-16）

江蘇省中醫(yī)藥領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（LJ200922）；江蘇省南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目（DYY056；ZKX13018）；南京市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201503030）

△通信作者（電子郵箱：doctor_tsz@hotmail.com）