不同遷徙能力奇異變形桿菌的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究

唐 雨，劉艷霞 ，劉俊康，鄧 渝

（中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)與天然藥物化學(xué)教研室，重慶 400038）

·實(shí)驗(yàn)研究·

不同遷徙能力奇異變形桿菌的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究

唐 雨，劉艷霞 ，劉俊康，鄧 渝

（中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)與天然藥物化學(xué)教研室，重慶 400038）

目的 應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，檢測(cè)2種不同遷徙能力奇異變形桿菌變化顯著的差異蛋白，為深入研究奇異變形桿菌的耐藥性提供重要依據(jù)。方法 采用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)遷徙能力不同的內(nèi)環(huán)與外環(huán)變形桿菌，通過(guò)菌落直徑比值反映2種菌遷徙能力的差異；采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，檢測(cè)2種菌總體蛋白表達(dá)差異，并著重分析差異明顯的核糖蛋白各種類間的相互作用。結(jié)果 內(nèi)環(huán)菌菌落直徑較小，外環(huán)菌菌落直徑較大，其菌落直徑比值為3.84±0.56；與內(nèi)環(huán)菌相比，外環(huán)菌蛋白表達(dá)變化顯著，僅外環(huán)菌表達(dá)的蛋白29種，外環(huán)菌表達(dá)顯著下調(diào)的蛋白129種，顯著上調(diào)的蛋白269種；針對(duì)核糖蛋白分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)顯著增高的核糖蛋白種類有34種。結(jié)論 外環(huán)菌從形態(tài)到蛋白質(zhì)表達(dá)均有顯著變化，其核糖體蛋白表達(dá)的顯著增加可能是其產(chǎn)生耐藥性的原因。

奇異變形桿菌；遷徙能力；比較蛋白質(zhì)組學(xué)；耐藥

奇異變形桿菌是腸桿菌科變形桿菌屬的細(xì)菌，廣泛存在于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)，是導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)感染的第二大病原菌，僅次于大腸埃希菌[1]。同時(shí)，其致病機(jī)制為在感染部位大量繁殖并利用菌毛黏附于靶細(xì)胞表面，在靶細(xì)胞表面分化生長(zhǎng)，并超量表達(dá)鞭毛和多糖莢膜，然后侵入細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)，釋放大量尿素酶、溶蛋白酶、溶血素等毒力因子，使受染細(xì)胞產(chǎn)生病變，最終導(dǎo)致相應(yīng)組織和器官功能的異常，引起疾病[2]。奇異變形桿菌感染尿路后的治療較困難，雖然各種廣譜抗菌藥物可控制感染，但近年來(lái)，關(guān)于奇異變形桿菌耐藥的報(bào)道逐漸增多，且呈上升趨勢(shì)。有研究從耐藥菌株產(chǎn)生超廣譜β－內(nèi)酰胺酶及AmpC酶等角度進(jìn)行探索[3]，希望解決奇異變形桿菌的耐藥問(wèn)題。本研究中為深入探討不同遷徙能力的奇異變形桿菌蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，尋找更為確切的耐藥靶點(diǎn)，為后續(xù)深入地研究耐藥分子機(jī)制提供依據(jù)，有利于解決其耐藥問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

儀器：質(zhì)譜系統(tǒng)（Thermo LTQ Orbitrap Elite）；液相系統(tǒng)（Thermo EASY－nlc1000）；Thermo EASY－Spray Column Pepmap C18柱，15 cm×75 μm，3 μm）；低溫高速離心機(jī)（美國(guó) Thermo公司）；Milli－Q超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；超聲破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）。

材料：奇異變形桿菌(Proteus mirabilis，PM)由本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)菌裂解液（7 mol／L尿素，2 mol／L硫脲，4%CHAPS，0.2%Bio－Lyte，0.001%溴酚藍(lán)）；LB指示培養(yǎng)基（胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，pH＝7.2，1.5%瓊脂，0.05%TTC，0.1%葡萄糖）；LB無(wú)指示培養(yǎng)基（同LB指示培養(yǎng)基，無(wú)TTC溶液）。

1.2 細(xì)菌接種

已經(jīng)高壓滅菌的LB培養(yǎng)基，待其溫度降至50℃左右時(shí)按比例加入TTC、葡萄糖混勻，制板后室溫冷凝，37℃倒置，敞口無(wú)菌烤板0.5 h，正中心點(diǎn)種奇異變形桿菌，37℃培養(yǎng)3 d。待接種的奇異變形桿菌波動(dòng)生長(zhǎng)3 d后，用接種針取內(nèi)環(huán)菌和外環(huán)菌點(diǎn)種于LB指示培養(yǎng)基平板上，分別標(biāo)記為A和B，37℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜。觀察不同區(qū)域細(xì)菌生長(zhǎng)速度及遷徙能力。

1.3 不同遷徙能力菌體的比較蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)[4]

1.3.1 樣品制備

按1.2項(xiàng)下方法取內(nèi)環(huán)菌和外環(huán)菌，點(diǎn)種于LB無(wú)指示培養(yǎng)基上，收集2種不同遷徙能力的細(xì)菌，于4℃，以5 000 r／min的速率，離心10 min，收集菌體。用PBS洗1次，再次離心后，菌體加入適量含PMSF的細(xì)菌裂解液，0℃超聲裂解10 min，于4℃，以1 3 000 r／min的速率離心10 min，收集上清液，即為制備好的全細(xì)菌蛋白液。BCA法測(cè)定蛋白濃度。

1.3.2 蛋白質(zhì)的變性、純化、烷基化、酶解及脫鹽

參照文獻(xiàn)[5－6]相關(guān)方法并加以改進(jìn)。取樣品添加細(xì)菌裂解液及上樣緩沖液配制成質(zhì)量濃度為3 g／L的蛋白樣品，96℃變性10 min，冷卻至室溫，每孔上樣60 μg，SDS－PAGE凝膠電泳約0.5 cm即停止，考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后，切膠，每樣不超過(guò)1 cm2，置1.5 mL無(wú)菌離心管中，繼續(xù)脫色至無(wú)色，加乙腈脫水至膠粒變白，真空抽干，加10 mmoL DTT（25 mmol NH4HCO3）200 μL，56℃保溫1 h，冷卻至室溫，吸干，快速加IAA（25 mmoL NH4HCO3）200 μL，置暗室 45 min。依次用25 mmoL NH4HCO3（2次）、25 mM NH4HCO3＋50%乙腈（2次）、乙腈（1次），每次10 min。乙腈脫水至膠粒變白，真空抽干。將0.1 g／L酶液用25 mmoL NH4HCO3稀釋10～20倍，每管加20～30 μL，瞬時(shí)離心，使酶液和膠粒充分接觸，4℃放置30 min。待酶液被膠粒完全吸收，加25 mmoL NH4HCO3至總體積100～150 μL，37℃過(guò)夜。加1%TFA終止酶切，震蕩混勻，離心收集酶解液。

1.3.3 質(zhì)譜檢測(cè)[5－6]

nano－LC－MS／MS液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)作比較蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)。

色譜條件：液相系統(tǒng)為 Thermo EASY－nlc1000；質(zhì)譜系統(tǒng)：Thermo LTQ Orbitrap Elite；分析柱為 C18色譜柱(15 cm×75 μm，3 μm)；進(jìn)樣量為2 μL，流速為300 nL／min；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫，時(shí)間120 min。

質(zhì)譜條件：電噴霧（ESI）離子源，噴霧電壓約為2.2 kV，毛細(xì)管溫度為250℃，碰撞能量35%，碰撞誘導(dǎo)解離（CID），正離子模式；由Tune and Xcalibur控制軟件根據(jù)數(shù)據(jù)依賴的自動(dòng)模式實(shí)施一級(jí)和二級(jí)切換，一級(jí)質(zhì)譜使用全質(zhì)量掃描，m／z范圍300～1 800。

1.4 數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析[5－6]

使用Thermo Proteome discoverer 1.4搜索引擎對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，檢索奇異變形桿菌種屬的ΜniProt數(shù)據(jù)庫(kù)；參數(shù)：相對(duì)分子質(zhì)量范圍350～5 000，母離子分辨率10 mg／kg，子離子0.8，2個(gè)漏切位點(diǎn)的全酶切；信噪比閾值(S／N Threshold)1.5；固定修飾：半胱氨酸（烷基化）＋57.021 5；可變修飾：蛋氨酸（氧化）＋15.994 9；假陽(yáng)性率（FDR）：0.01。采用SIEVE v2.1×64進(jìn)行無(wú)標(biāo)定量分析，尋找相關(guān)差異蛋白，根據(jù)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組豐度比值分析差異蛋白。選用 iProXpress(integrated protein expression)在線蛋白表達(dá)分析系統(tǒng)進(jìn)行(Gene Ontology，GO）注釋的索引及細(xì)胞組分、過(guò)程、生物學(xué)功能、信號(hào)通路聚類的統(tǒng)計(jì)分析；尋找2種菌的差異蛋白；利用STRING(version 10，http:／／string－db.org／)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白－蛋白相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)觀察結(jié)果

圖1 TTC指示劑培養(yǎng)觀察結(jié)果

圖2 不同區(qū)域菌體接種培養(yǎng)觀察結(jié)果

初始階段生長(zhǎng)狀態(tài)與賈雄飛等[7]報(bào)道的增殖方式類似，但環(huán)間距稍大于其報(bào)道，后出現(xiàn)環(huán)間距增大的菌群，形如扇面（見(jiàn)圖1）。環(huán)間距小處于中央位置的為內(nèi)環(huán)菌，間距大處于邊緣位置的為外環(huán)菌。不同區(qū)域菌體分別接種后，由菌落直徑可見(jiàn)，內(nèi)環(huán)菌菌落直徑較小，外環(huán)菌菌落直徑較大，菌落直徑比值為3.84±0.56，說(shuō)明外環(huán)菌與內(nèi)環(huán)菌相比遷徙能力更強(qiáng)（見(jiàn)圖2）。

2.2 比較蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)

凝膠電泳法去除電解質(zhì)后，比較蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)和分析，共鑒定到蛋白質(zhì)1 003種，其中僅內(nèi)環(huán)菌組表達(dá)的29種，僅外環(huán)菌組表達(dá)的29種，通過(guò)表達(dá)豐度比較，豐度減少少于50%的129種，豐度增加至2倍以上的269種，2種菌蛋白質(zhì)表達(dá)變化不大的547種。結(jié)果顯示，外環(huán)菌相比內(nèi)環(huán)菌的蛋白質(zhì)表達(dá)情況發(fā)生了巨大變化。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2種菌在細(xì)胞形態(tài)方面呈現(xiàn)出極大差異，內(nèi)環(huán)菌為短桿狀，外環(huán)菌則為細(xì)長(zhǎng)桿狀。有研究對(duì)不同遷徙能力的奇異變形桿菌進(jìn)行鞭毛染色觀察發(fā)現(xiàn)，遷徙速度更快的變形桿菌的鞭毛從數(shù)量及長(zhǎng)度均遠(yuǎn)超過(guò)遷徙速度慢的菌，提示兩者的蛋白質(zhì)表達(dá)會(huì)有較大差異[8]。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的分子機(jī)器是核糖體，核糖體是細(xì)胞內(nèi)一種核糖核蛋白顆粒，主要由rRNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其唯一功能是按照mRNA的指令將氨基酸合成蛋白質(zhì)多肽鏈。核糖體蛋白種類的變化對(duì)細(xì)菌蛋白質(zhì)表達(dá)的影響是關(guān)鍵的。因此本研究中著重分析外環(huán)菌比內(nèi)環(huán)菌表達(dá)豐度顯著增加的核糖體蛋白并展示各蛋白間的相互作用（見(jiàn)圖3和表1）。

圖3 外環(huán)菌表達(dá)豐度增加2倍以上的核糖體蛋白相互作用圖

3 討論

由于無(wú)標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)方法本身容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和定量不準(zhǔn)的問(wèn)題，采用內(nèi)環(huán)菌與外環(huán)菌平行操作的方法保證可比性，同時(shí)在搜庫(kù)時(shí)設(shè)置信噪比閾值（S／N Threshold）1.5以去除背景。另因 iProXpress數(shù)據(jù)庫(kù)與STRING數(shù)據(jù)庫(kù)的差異，有9種在iProXpress中聚類的核糖蛋白種類未在STRING上識(shí)別。

表1 外環(huán)菌表達(dá)豐度增加2倍以上的核糖體蛋白注釋表

在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)奇異變形桿菌時(shí)，通常形態(tài)上會(huì)出現(xiàn)短桿狀菌與纖細(xì)長(zhǎng)條狀菌之間的交替變化，分別為繁殖體（Vegeta－tive cells，VC）及潛生體（Cryptic growth cells，CGC）。劉俊康等[9]觀察到奇異變形桿菌節(jié)律性波動(dòng)生長(zhǎng)過(guò)程中表現(xiàn)潛－生序變化，潛生體可以回復(fù)到繁殖體，并以多位斷裂、自旋端位斷裂、出芽生長(zhǎng)、梳狀繁殖等新的繁殖方式進(jìn)行穩(wěn)定性傳代。根據(jù)奇異變形桿菌的生長(zhǎng)特性及細(xì)胞形態(tài)，初步判斷本試驗(yàn)中的外環(huán)菌可能為該菌的潛生體，并能進(jìn)行穩(wěn)定傳代。有研究發(fā)現(xiàn)，奇異變形桿菌潛生體的耐藥程度普遍高于繁殖體，并從外膜通透性方面對(duì)該菌的耐藥機(jī)制進(jìn)行了探索，認(rèn)為外膜蛋白的大面積減少或缺失對(duì)潛生體耐藥程度的提高可能起著重要作用[10]。本研究中運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)方法，對(duì)2種不同遷徙能力的奇異變形桿菌體內(nèi)蛋白進(jìn)行比對(duì)分析，外環(huán)菌中表達(dá)的核糖體蛋白比內(nèi)環(huán)菌至少高3倍以上，通過(guò)展示顯著增加的各蛋白間的相互作用關(guān)系，以期為奇異變形桿菌容易發(fā)生耐藥問(wèn)題提供新的靶點(diǎn)。

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Comparative Proteomics of Proteus Mirabilis with Different M igratory Abilities

Tang Yu,Liu Yanxia,Liu Junkang,Deng Yu
(College of Pharmacy,3rd Military Medical University,Chongqing,China 400038)

Objective To detect differentially expressed proteins of two different migratory abilities of Proteus Mirabilis through comparative proteomics,to provide an important basis for further study on drug resistance of Proteus Mirabilis.M ethods LB medium was used to culture the inner and outer ring Proteus Mirabilis with different migratory ability,and the difference of migration ability between the two strains was determined by the ratio of colony diameter.Comparative proteomic analysis was used to detect the differences in overall protein expression between the two speciesofbacteria and to focuson the interaction between distinctclassesofribose proteins.Results The results showed that diameter of the inner colonies was small and the diameter of outer colonies was large.The colony diameter ratio were 3.84±0.56,compared with the inner ring,the outer ring of bacteria protein expression changes significantly, only the outer ring bacteria expressed 29 proteins,the outer ring of bacteria significantly down－regulation of 129 proteins and significantly up－regulation of 269 proteins.According to the analysis of ribosomal proteins,there were significant increase in expression of 34 kinds of proteins.Conclusion The morphology and protein expression of outer ring bacteria changed significantly,and the significant increase of ribosomal protein expression might be the cause of drug resistance.

Proteus Mirabilis;migratory abilities;comparative proteomics;drug resistance

2017－05－01)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.15.004

唐雨（1986－），女，碩士研究生，助教，主要從事天然藥物化學(xué)及其藥理作用研究，（電子信箱）tangyuflower＠163.com。

劉艷霞（1982－），女，碩士研究生，講師，主要從事天然產(chǎn)物抗腫瘤分子機(jī)制研究及新藥開(kāi)發(fā)，（電子信箱）liuyibin＿04＠163.com。

Q935；R378

A

1006－4931(2017)15－0013－04