芒果葉中總黃酮提取工藝優(yōu)選

張 帆，陳 越，侯文浩，鄧國(guó)文，劉小幸，周程艷

（河北大學(xué)藥學(xué)院，河北 保定 071000）

·實(shí)驗(yàn)研究·

芒果葉中總黃酮提取工藝優(yōu)選

張 帆，陳 越，侯文浩，鄧國(guó)文，劉小幸，周程艷

（河北大學(xué)藥學(xué)院，河北 保定 071000）

目的 選取總黃酮最優(yōu)提取工藝，為芒果葉的進(jìn)一步開發(fā)研究提供科學(xué)依據(jù)。方法 以百色芒果葉為原料，分別采用普通醇提法和超聲提取法，進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，分析乙醇濃度、液固比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)總黃酮提取效果的影響，并以總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝。結(jié)果 乙醇加熱回流法的最佳工藝為溫度100℃，時(shí)間2 h，液固比10，提取次數(shù)3次；超聲提取法的最佳工藝為溫度50℃，時(shí)間35 min，液固比10，提取次數(shù)3次。結(jié)論 芒果葉中總黃酮的最佳提取工藝為乙醇加熱回流法。

總黃酮；單因素試驗(yàn)；正交試驗(yàn)；提取工藝

芒果葉為漆樹科植物芒果 Mangifera indica L.的葉[1]，其味酸、甘，性涼、平，具有行氣疏滯、祛痧積的功效，主要用于治療熱滯腹痛、氣脹、小兒疳積、消渴[2]等癥。芒果葉中含有大量總黃酮，包括芒果苷、高芒果苷、異芒果苷、槲皮素等多種化學(xué)成分，主要成分芒果苷具有抗炎[3]、解熱鎮(zhèn)痛[4－7]、抗菌[8－11]、免疫調(diào)節(jié)[12－15]、降血糖[16－18]、抗氧化[19－22]等廣泛的藥理作用。芒果苷為一種四羥基吡酮碳糖苷，是氧雜蒽酮類化合物，目前對(duì)于芒果葉的研究主要是針對(duì)于其主要有效成分的得率測(cè)定和藥理作用，對(duì)其提取工藝的研究較少，因其提取效果不佳。本研究中以百色芒果葉為原料，采用乙醇加熱回流法和超聲提取法，結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化提取工藝，為進(jìn)一步研究芒果葉提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Bio TEK型多功能酶標(biāo)儀（基因有限公司）；SBB20002型電子天平（盛博電子衡器有限公司）；賽多利斯分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司）；YL－060S型語路超聲清洗器，RE 52－99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；ZDHW電熱套（北京中興偉業(yè)有限公司）。

1.2 試藥

無水乙醇（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)為20160229）；超純水、亞硝酸鈉（北京康普匯維＜廣州＞科技有限公司，批號(hào)為20151223）；硝酸鋁（常州市海拓實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，批號(hào)為20161115）；氫氧化鈉（天津市博迪化工有限公司，批號(hào)為20160709）。百色芒果葉采自廣西百色市，經(jīng)周程艷副教授鑒定為漆樹科植物芒果 Mangifera indica L.的葉。蘆丁對(duì)照品(天津力生制藥股份有限公司，批號(hào)為1502001，含量為每片200 mg)。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮得率的測(cè)定

2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

選擇蘆丁為對(duì)照品，參照2015年版《中國(guó)藥典(一部)》和文獻(xiàn)[23－25]制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。將蘆丁對(duì)照品干燥至恒重，稱取1.300 8 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液定容，制得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.013 008 g／L)，分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置10 mL容量瓶中，各加入0.30 mL體積分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉水溶液，靜置6 min，分別加入0.30 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁水溶液，靜置6 min，然后加入4.00 mL體積分?jǐn)?shù)為4%的氫氧化鈉溶液，再加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇定容，靜置15 min，以空白試劑作對(duì)照，用酶標(biāo)儀于506 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度、吸光度分別為橫、縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 Y＝7.113 8 X＋0.053 3，r2＝0.999 4(n＝6)。

2.1.2 總黃酮得率測(cè)定

稱取10.00 g百色芒果葉于體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇中加熱回流提取，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，置250 mL容量瓶中定容。精密量取20.00 mL稀釋至100 mL，再精密量取8.00 mL，置100 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液至40 mL，搖勻，隨之加入4 mL體積分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉溶液，使混勻，靜置6 min，加入4 mL體積分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁水溶液，使混勻，按2.1.1項(xiàng)下操作，測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算芒果葉提取液的總黃酮含量 Q（g／L），利用提取液中總黃酮得率計(jì)算百色芒果葉中總黃酮得率 T(%)。

總黃酮得率 T(%)＝Q×V／1 000 W×100%

其中，Q為芒果提取液總黃酮含量（g／L)，V為提取液體積（mL)，W為百色芒果葉質(zhì)量（g)，總黃酮得率 T(%）為提取所得總黃酮與所用百色芒果葉的質(zhì)量之比。

2.2 乙醇加熱回流法工藝條件優(yōu)選

2.2.1 提取條件單因素試驗(yàn)

液固比：稱取百色芒果葉3份，每份10.00 g，精密稱定，分別加入液固比 5，8，10，15，20的體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，100℃下熱回流提取2次，每次提取1 h，用酶標(biāo)儀于506 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，計(jì)算芒果葉中總黃酮得率(%)。結(jié)果見圖1 A?？梢姡S著液固比增大，總黃酮得率增加，當(dāng)液固比達(dá)到10以上時(shí)，提取液總黃酮得率增速減緩，提示在液固比為10時(shí)，芒果葉中總黃酮提取已較充分，考慮節(jié)約溶劑，以降低經(jīng)濟(jì)成本選取液固比為10。

提取溫度：稱取百色芒果葉3份，每份10.00 g，精密稱定，使用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇作為提取液，選取最優(yōu)固液比10，提取溫度設(shè)計(jì)60℃，80℃，100℃，120℃4個(gè)水平，加熱回流提取2次，每次提取2 h，用酶標(biāo)儀于506 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值并計(jì)算芒果葉中總黃酮得率(%)。結(jié)果見圖1 B?？梢?，總黃酮得率隨提取溫度的升高而增大，但在提取溫度超過100℃以后，得率迅速下降，因此選擇提取溫度為100℃左右較適宜。

提取時(shí)間：稱取百色芒果葉3份，每份10.00 g，精密稱定，使用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇作為提取液，液固比10，提取溫度100℃，加熱回流提取2次，每次提取時(shí)間設(shè)計(jì)1，2，3 h共3個(gè)水平，用酶標(biāo)儀于506 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值并計(jì)算芒果葉中總黃酮得率(%)。結(jié)果見圖1 C?？梢?，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮得率逐漸升高，超過2 h后，總黃酮得率降低，因此提取時(shí)間確定在2 h左右。

圖1 加熱回流法提取條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

提取次數(shù)：稱取百色芒果葉3份，每份10.00 g，精密稱定，使用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇作為提取液，液固比、提取時(shí)間及提取溫度按以上試驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)，提取次數(shù)設(shè)計(jì)1，2，3共3個(gè)水平，測(cè)定吸光度并計(jì)算芒果葉中總黃酮得率(%)。結(jié)果見圖1 D?？梢?，總黃酮得率隨著回流次數(shù)的增加而提高，在回流處理3次時(shí)，總黃酮的得率達(dá)到最高值，繼續(xù)增加回流次數(shù)，總黃酮得率增速減緩，考慮節(jié)約溶劑，以降低經(jīng)濟(jì)成本，并增加回流次數(shù)，使芒果葉雜質(zhì)過少，為后續(xù)的過濾操作增加了困難，所以綜合考慮，選擇3次為最佳提取次數(shù)。

表1 乙醇加熱回流法工藝優(yōu)選因素水平表

表2 乙醇加熱回流法工藝優(yōu)選 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 乙醇加熱回流法工藝優(yōu)選方差分析結(jié)果

2.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度(A)、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）、液固比（D）4個(gè)因素進(jìn)行 L9(34)正交試驗(yàn)，以總黃酮得率(%)為指標(biāo)，利用正交試驗(yàn)確定乙醇加熱回流法的最佳提取條件。因素水平表見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見表2和表3。由極差的大小可將影響大小依次排列為提取溫度＞提取時(shí)間＞提取次數(shù)＞液固比，經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響均呈極顯著性差異。提取溫度為100℃時(shí)為最佳溫度，同理提取時(shí)間2 h，提取次數(shù)3次，而液固比無顯著性影響，因此以節(jié)約成本考慮，選擇液固比10，最優(yōu)化方案為A2B2C3D2。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了考察最優(yōu)提取工藝的重復(fù)性，同時(shí)具有工業(yè)化生產(chǎn)的意義，因此選取了同一批芒果葉樣品100 g模擬工業(yè)化生產(chǎn)，并平行重復(fù)3次，測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮得率。結(jié)果得率分別為1.821 4%，1.813 5%，1.816 9%，平均值為1.8173%，RSD＝0.396%(n＝3），表明該提取工藝穩(wěn)定、可行。

2.3 超聲提取法工藝條件優(yōu)選

2.3.1 單因素試驗(yàn)

液固比：稱取百色芒果葉3份，每份10.00 g，精密稱定，分別加入液固比8，10，15的蒸餾水，50℃超聲提取2次，每次提取35 min，依法測(cè)定吸光度，并計(jì)算芒果葉中總黃酮得率(%)。結(jié)果見圖2 A。可見，隨著液固比增大，總黃酮得率增加，當(dāng)液固比超過10時(shí)，提取液總黃酮得率增速減緩，提示在液固比為10時(shí)，芒果葉中總黃酮提取已較充分，考慮節(jié)約溶劑，為降低經(jīng)濟(jì)成本，選擇液固比為10。

提取溫度：稱取百色芒果葉3份，每份10.00 g，精密稱定，使用蒸餾水作為提取液，液固比為10，提取時(shí)間為35 min，提取溫度設(shè)計(jì)20℃，30℃，50℃，70℃ 等4個(gè)水平，超聲提取2次，依法測(cè)定吸光度并計(jì)算芒果葉中總黃酮得率(%)。結(jié)果見圖2 B?？梢?，總黃酮得率隨提取溫度的升高而增大，但在提取溫度超過50℃后，得率迅速下降，因此選擇提取溫度為50℃較適宜。

提取時(shí)間：稱取百色芒果葉3份，每份10.00 g，精密稱定，液固比為10，提取溫度為50℃，每次提取時(shí)間設(shè)計(jì)10，20，35，50 min共4個(gè)水平，依法測(cè)定吸光度并計(jì)算芒果葉中總黃酮得率(%)。結(jié)果見圖2 C。可見，增加超聲處理時(shí)間，總黃酮得率隨提取時(shí)間先升高后下降，總黃酮在超聲35 min時(shí)達(dá)到最高，繼續(xù)增加超聲時(shí)間，總黃酮得率開始下降，故選擇超聲時(shí)間為35 min最佳。

提取次數(shù)：稱取百色芒果葉3份，每份10.00 g，精密稱定，使用蒸餾水作為提取液，液固比為10，提取時(shí)間為35 min，提取溫度為50℃，提取次數(shù)設(shè)計(jì)1，2，3，4共4個(gè)水平，依法測(cè)定吸光度并計(jì)算芒果葉中總黃酮得率(%)。結(jié)果見圖2 D?？梢?，總黃酮得率隨著超聲次數(shù)增加而提高，在超聲處理3次時(shí)，總黃酮的得率達(dá)到最高值，繼續(xù)增加超聲次數(shù)，總黃酮得率增速減緩，考慮節(jié)約溶劑，以降低經(jīng)濟(jì)成本，選擇3次為最佳超聲次數(shù)。

圖2 超聲提取法工藝條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）及液固比（D）4個(gè)因素進(jìn)行 L9(34)正交試驗(yàn)，以總黃酮得率(%)為指標(biāo)，利用正交試驗(yàn)確定乙醇加熱回流法的最佳提取條件。因素水平表見表4，正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見表5和表6。由極差的大小可將影響大小依次排列為提取溫度＞提取時(shí)間＞提取次數(shù)＞液固比，經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，提取溫度、提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響均呈極顯著性差異?？芍?，提取溫度為50℃時(shí)為最佳溫度，同理提取時(shí)間為35 min，提取次數(shù)為3次時(shí)，液固比無顯著性影響，因此以節(jié)約成本考慮，選擇液固比10，最優(yōu)化方案為A2B2C3D2。

表4 超聲提取法工藝優(yōu)選因素水平表

表5 超聲提取法工藝優(yōu)選 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 超聲提取法工藝優(yōu)選方差分析結(jié)果

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了考察最優(yōu)提取工藝的重復(fù)性，以及具有工業(yè)化生產(chǎn)的意義，本研究中取同一批芒果葉樣品100 g模擬工業(yè)化生產(chǎn)，平行重復(fù)3次，測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮得率。結(jié)果得率分別為1.652 6%，1.659 6%，1.651 4%，平均值為1.654 5%，RSD＝0.443%(n＝3），表明該提取工藝穩(wěn)定、可行。

2.4 兩種提取方法比較

乙醇加熱回流法、超聲波提取法最佳工藝條件下，從芒果葉中提取總黃酮得率分別為(1.84±0.02)%和(1.66±0.02)%，乙醇加熱回流法提取總黃酮得率最高，超聲波提取法工藝簡(jiǎn)單，但提取得率低于乙醇加熱回流法，且不易控制其溫度。綜合考慮，選用乙醇加熱回流法為提取總黃酮的最佳方法。

3 討論

我國(guó)是芒果主要產(chǎn)地之一，主要分布于臺(tái)灣、廣東、廣西、海南、福建、云南、四川等地區(qū)，資源豐富，分布地域廣，原料易得，價(jià)格低廉，甚至四季可采[26]。以往芒果葉中總黃酮的提取方法存在耗時(shí)、耗料、提取率低、有效成分易被破壞等諸多缺點(diǎn)。超聲提取法有諸多優(yōu)點(diǎn)，可大大縮短提取時(shí)間，節(jié)約溶劑，提高提取率[27－28]；采用乙醇回流法對(duì)總黃酮進(jìn)行提取雖耗時(shí)，但提取率高。本研究中應(yīng)用正交試驗(yàn)分析上述2種方法的最佳工藝，分析結(jié)果表明，采用乙醇回流法提取芒果葉中總黃酮得率最高，超聲提取法提取效率較低。各因素對(duì)提取率變化的影響原因分析如下。

液固比：在單因素試驗(yàn)中，2種方法隨著提取液固比的升高，總黃酮得率均呈先升后平緩趨勢(shì)。原因可能是，液固比較低時(shí)液體量不夠，不能充分浸潤(rùn)芒果葉，產(chǎn)生的蒸氣量不夠，導(dǎo)致總黃酮提取不完全；而當(dāng)繼續(xù)增大液體的比例時(shí)，可能提取已較為完全，所以上升較為平緩。

提取溫度：在單因素試驗(yàn)中，2種方法隨著提取溫度的升高，總黃酮得率均呈先升后降趨勢(shì)。原因可能是，溫度升高加快了分子的擴(kuò)散速度，有助于溶質(zhì)擴(kuò)散，芒果葉中醇溶性雜質(zhì)隨著溫度升高溶出速度明顯升高，不利于芒果苷溶出；此外，溫度升高對(duì)芒果葉中的芒果苷產(chǎn)生不同程度的破壞，直接降低了提取質(zhì)量及效率。

提取時(shí)間：在單因素試驗(yàn)中，2種方法隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮得率均呈先升后降趨勢(shì)。原因可能是，提取時(shí)間過長(zhǎng)芒果苷含量降低，長(zhǎng)時(shí)間的提取破壞了芒果苷分子結(jié)構(gòu)。

提取次數(shù)：在單因素試驗(yàn)中，2種方法隨著提取次數(shù)的升高，總黃酮得率均呈先升后平緩趨勢(shì)。提取次數(shù)是利用溶液的濃度差增加溶液的得率，其得率平緩的原因可能是因?yàn)橛捎诖螖?shù)增多，提取較完全。

綜上所述，芒果葉中總黃酮的最佳提取工藝為乙醇加熱回流法；以百色芒果葉為原料，乙醇加熱回流法的最佳工藝為溫度100℃，時(shí)間2 h，液固比10，提取次數(shù)3次，該提取工藝穩(wěn)定、可行。

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Optimization of Extraction Technology of Total Flavonoids from Mangifera Indica Leaves

Zhang Fan,Chen Yue,Hou Wenhao,Deng Guowen,Liu Xiaoxing,Zhou Chengyan
(Department of Pharmacy,Hebei University,Baoding,Hebei,China 071000)

Objective To optimize the extraction process of total flavonoids,and provide a scientific basis for further development and utilization ofMangifera Indica leaves.M ethods Baise Mangifera Indica leaves as raw materials,the common ethanol extraction and ultrasonic extraction method were used,single factor test and orthogonal test were used,the effects of alcohol concentration,liquid－solid ratio,extraction temperature and extraction time on the extraction of total flavonoids were analyzed,and the yield of total flavonoids as index,the extraction process optimization.Results The optimum ethanol refluxing method for temperature was 100℃,the time was 2 h, the ratio of liquid to solid was 10,the times of extraction was 3.The optimum ultrasonic extraction method for temperature was 50℃, the time was 35 min,the ratio of liquid to solid was 10,the times of extraction was 3.Conclusion The best extraction process of total flavonoids from Mangifera Indica leaves is ethanol refluxing method.

total flavonoids;single factor experiment;orthogonal test;extraction technology

2017－04－10)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.15.002

2016年“挑戰(zhàn)杯”河北大學(xué)課外學(xué)術(shù)科技作品競(jìng)賽項(xiàng)目[ZR038]；2016年河北大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目[2016182]。

張帆（1993－），女，大學(xué)本科在讀，研究方向?yàn)橹兴幪崛》蛛x和制劑，（電子信箱）1935373658＠qq.com。

周程艷（1976－），女，博士研究生，副教授，研究方向?yàn)橹胁菟幮滤庨_發(fā)與研究，（電話）0312－5971107（電子信箱）893927534＠qq.com。

TQ460.6；R284.2

A

1006－4931(2017)15－0005－06