754例I期-IIIa期可手術(shù)切除非小細胞肺癌患者EGFR和KRAS基因突變狀態(tài)及其臨床意義

趙靜 高潔 郭李平 胡曉許 劉琦 趙金銀 劉利成 姜君 王孟昭 梁智勇 徐燕 陳閩江 張力李龍蕓 鐘巍

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)發(fā)病率越來越高,已成為全球癌癥死亡的首要原因[1-3].近20年來,NSCLC的治療取得了飛速發(fā)展,涌現(xiàn)出大量新的藥物和治療手段,如分子靶向治療[4-7]、免疫治療[8-10]等,使患者預(yù)后大為改善.在分子靶向治療方面,研究最成熟的當(dāng)屬表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR).具有EGFR敏感突變的患者,使用吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼具有更高的客觀緩解率(objective response rate, ORR)、更長的無進展生存期(progressionfree survival, PFS)以及更高的生活質(zhì)量.當(dāng)這些一、二代EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)耐藥后,若耐藥機制由EGFR T790M介導(dǎo),使用三代EGFR-TKIs(Osimertinib, AZD9291)亦能再次產(chǎn)生顯著療效.因此,對EGFR突變的準(zhǔn)確檢測顯得尤為重要.目前研究主要集中在晚期NSCLC組織和血漿標(biāo)本的EGFR檢測.PIONEER研究[11]顯示,在晚期亞裔腺癌患者EGFR突變率高達51.4%.在另外一項IGNITE研究,再次確認了晚期亞裔NSCLC腺癌EGFR突變率為49.2%,與PIONEER結(jié)果一致,非腺癌患者EGFR突變率也高達14.1%,與歐美人群中腺癌患者突變率相當(dāng).然而,對于真實世界中,可手術(shù)切除的I期-IIIa期NSCLC組織標(biāo)本的EGFR突變情況尚不清楚[12,13].

另外,并非所有具有EGFR敏感突變的NSCLC患者對EGFR-TKIs表現(xiàn)出良好療效.KRAS基因編碼的P21蛋白位于EGFR信號通路下游,KRAS基因突變會使下游信號通路配體非依賴性持續(xù)性激活,不受上游靶向藥物對EGFR的影響,導(dǎo)致細胞持續(xù)惡性增殖.KRAS基因突變會使NSCLC患者對EGFR-TKIs產(chǎn)生耐藥[14],同時患者預(yù)后更差[15].多數(shù)研究認為EGFR和KRAS基因突變是相互排斥的[16-19],但是一些臨床研究表明KRAS基因突變可以發(fā)生在EGFR突變型患者中,但雙突變發(fā)生率低于1%.因此,同時檢測EGFR和KRAS對指導(dǎo)NSCLC患者個體化治療具有重要臨床意義[20].

EGFR基因突變多位于外顯子18-21,其中以外顯子19缺失突變和外顯子21L858R錯義突變最為常見,約占總突變率的90%[21].KRAS基因最常見的突變方式為點突變,90%的KRAS基因突變位于外顯子2的第12和13密碼子位點.本研究目的旨在使用Modified AMRS PCR熒光探針法檢測真實世界下,未加選擇的可手術(shù)切除I期-IIIa期的NSCLC患者組織標(biāo)本中EGFR和KRAS基因的熱點突變狀態(tài),是否存在雙突變以及基因突變與臨床因素的相關(guān)性.

1 材料與方法

1.1 材料 標(biāo)本來自北京協(xié)和醫(yī)院病理科于2013年1月-2013年12月收集NSCLC標(biāo)本,標(biāo)本類型僅限于手術(shù)完整切除的標(biāo)本,除外電子氣管鏡和穿刺活檢標(biāo)本,去除重復(fù)標(biāo)本,共納入754例,其中男性374例,女性380例;年齡24歲-92歲,中位年齡60歲;年齡分組:40歲以下、40歲-49歲、50歲-59歲、60歲-69歲、70歲以上患者樣本分別為15例(2.0%)、53例(7.0%)、282例(37.4%)、240例(31.8%)和164例(21.7%);病理分型:腺癌623例(82.5%)、鱗癌91例(12.1%)、腺鱗癌1例(0.1%)、其他39例(5.3%).所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋、切片及HE染色,由病理醫(yī)師復(fù)閱切片明確診斷,并確定有足夠的腫瘤細胞再行后續(xù)檢測.

1.2 方法

1.2.1 DNA提取用 無菌刀片刮取5張-10張4 μm厚的連續(xù)石蠟切片中癌組織區(qū)域,保證腫瘤細胞含量在30%以上.石蠟組織脫蠟后用石蠟包埋組織DNA快速提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因組DNA.用NanoDrop 2000熒光分光光度計檢測DNA的質(zhì)量和濃度,所有DNA吸光度值A(chǔ)260/280均在1.8-2.0之間,用無DNase水將DNA稀釋至0.5 ng/μL-10 ng/μL備用.

1.2.2 突變擴增系統(tǒng)(amplification refractory mutation system, ARMS) 熒光PCR檢測以所提取石蠟樣本DNA為模板,按照EGFR基因和KRAS基因突變檢測試劑盒(購自于北京華大吉比愛生物技術(shù)有限公司)操作說明書步驟,應(yīng)用實時熒光定量PCR儀(ABI 7300, USA)檢測EGFR和KRAS基因的常見突變,所檢突變包括EGFR基因L858R和exon 19del突變及KRAS基因12和13密碼子突變.檢測結(jié)果由兩位專業(yè)的研究人員判讀和分析.如果判讀結(jié)果不一致,再由第三位研究員分析得出最終決定.按照雙盲試驗的設(shè)計原則,試驗數(shù)據(jù)的記錄和獲得由不同的研究員獨立進行.研究員對患者組織檢測結(jié)果并不知曉直到統(tǒng)計分析.

1.2.3 測序分析 若檢出EGFR和KRAS雙突變的標(biāo)本,采用直接測序法進行驗證.針對EGFR基因19、21號外顯子和KRAS基因第2號外顯子設(shè)計擴增引物且在擴增引物的5'端加上M13測序引物,其中EGFR基因第19號外顯子上下游引物分別為:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTAATTCCCGTC GCTATC-3';5'-GGAAACAGCTATGACCGTGGGCCTGA GGTTCAGAG-3',EGFR基因第21號外顯子上下游引物分別為:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTACTTGGAGGACCGT CGCTT-3';5'-CAGGAAACAGCTATGACCGCTGACCTA AAGCCACCTCC-3',KRAS基因第2號外顯子上下游引物分別為:5'-TGTAAAACGACGGCCAGTCGATACACGTCTG CAGTCAACT-3';5'-CAGGAAACAGCTATGACCGCATA TTACTGGTGCAGGACC-3'.以所提取石蠟樣本DNA為模板進行PCR擴增,反應(yīng)條件:95oC預(yù)變性7 min;95oC變性30 s,56oC 30 s,72oC延伸45 s,40個循環(huán),最后72oC延伸10 min.將所得PCR產(chǎn)物送上海生工生物公司進行測序,使用DNAStar軟件對測序結(jié)果進行比對和分析.

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析.針對連續(xù)變量采用獨立樣本t檢驗,針對計數(shù)變量采用卡方檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 樣本中EGFR、KRAS突變情況 本次檢測涉及754例樣本,共260例檢出EGFR突變(34.5%),其中,外顯子21 L858R突變124例(16.4%),外顯子19缺失突變(exon 19del)142例(18.8%),有6例(0.8%)樣本同時發(fā)生了L858R和19del突變.有320例樣本同時進行了KRAS基因突變檢測,共檢出42例KRAS突變(13.1%),且全部為12號密碼子突變,未檢出13號密碼子突變.有3例(0.9%)樣本出現(xiàn)雙突變,其中,2例為EGFR(L858R)和KRAS(G12)雙突變,1例為EGFR(Exon 19del)和KRAS(G12)突變,將此3例雙突變樣本使用常規(guī)測序驗證,結(jié)果如圖1.

圖 1 3例EGFR-KRAS雙突變樣本的DNA測序分析Fig 1 DNA sequencing data of 3 specimens with EGFR-KRAS double mutations. EGFR: epidermal growth factor receptor.

2.2 EGFR和KRAS基因突變與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 在754例NSCLC樣本中,女性EGFR基因突變率(39.5%,150/380)高于男性(29.4%,110/374),但二者沒有顯著性差異(P=0.076).60歲以下患者和60歲以上患者EGFR基因突變率相當(dāng)[36.3%(127/350)vs 32.9%(133/404)].腺癌(38.7%, 241/623)中EGFR基因突變率明顯高于鱗癌(10.0%, 9/91)和其他類型癌(25.6%, 10/39)的突變率.在其中320例NSCLC樣本中,男性KRAS基因突變率(16.6%,29/175)高于女性(9.0%, 13/145),且二者具有顯著差異(P=0.048).60歲以下患者和60歲以上患者KRAS基因突變率相當(dāng)[17.1%(28/164)vs 15.4%(24/156)].腺癌(14.1%,36/255)中KRAS基因突變率高于鱗癌(7.7%, 2/26)和其他類型癌(10.5%, 4/38),詳見表1.

2.3 基于EGFR和KRAS基因分型的單因素分析 在EGFR或KRAS基因突變陽性的樣本中,EGFR陽性組的中位初診年齡為58歲,平均年齡為(58.6±10.1)歲,KRAS陽性組的中位初診年齡為61.5歲,平均年齡為(62.4±8.4)歲,EGFR陽性組患者年齡分布較KRAS陽性組具有年輕化趨勢(P=0.031,5).在性別分布方面,KRAS陽性組的男性分布比例明顯高于EGFR組(69% vs 42.3%, P<0.01).在病理類型分布方面,兩組均以腺癌為主,并未發(fā)現(xiàn)有顯著差異(P=0.228)(圖2).

3 討論

圖 2 基于EGFR和KRAS基因分型的單因素分析.A: 基于EGFR和KRAS分型的年齡分布情況;B:基于EGFR和KRAS分型的性別分布情況;C:基于EGFR和KRAS分型的病理類型分布情況.Fig 2 Single factor analysis based on EGFR and KRAS genotype.A: Age distribution based on EGFR and KRAS genotype; B:Gender distribution based on EGFR and KRAS genotype; C:Pathological type based on EGFR and KRAS genotype.

表 1 EGFR及KRAS基因突變情況與患者臨床病理特征之間的關(guān)系Tab 1 The relationship between EGFR and KRAS mutations and clinical variables of patients

本研究是一項專門針對I期-IIIa期可手術(shù)切除NSCLC患者EGFR和KRAS基因突變狀況的調(diào)查研究.研究顯示,在未加選擇可切除的I期-IIIa期NSCLC患者,EGFR基因突變率為34.5%,這與早期文獻[22,23]所報道的一致.但對于腺癌,此研究EGFR突變率僅為38.7%,明顯低于PIONEER和IGNITE研究所報道的50%左右[11].在PIONEER和IGNITE研究中,均是納入的IV期腺癌患者,而我們的標(biāo)本為I期-IIIa期,這種早晚期標(biāo)本差異可能是導(dǎo)致突變率不同的一個重要原因.在一項EGFR-TKIs術(shù)后輔助治療的隨機III期臨床研究中(BR.19研究)[20],研究者亦發(fā)現(xiàn)手術(shù)標(biāo)本中EGFR的突變率明顯低于晚期患者,僅3%(15/503),而且分期越早的標(biāo)本,其EGFR突變率越低,這些發(fā)現(xiàn)似乎也在一定程度上支持我們的結(jié)論.這也反映早期NSCLC和晚期NSCLC可能具有不同的生物學(xué)行為,EGFR基因在其中所起的作用不同,因此制定綜合治療策略需考慮這種差異[24,25].

既往研究[26,27]表明,EGFR突變與患者性別、種族、吸煙、病理類型有關(guān),其在亞裔、女性、不吸煙、腺癌的患者中發(fā)生率較高.本研究在754例I期-IIIa期NSCLC樣本中也發(fā)現(xiàn),EGFR基因突變率在腺癌中較高,同時女性較男性也有升高趨勢(39.5% vs 29.4%, P=0.076),這與既往研究結(jié)果一致.

KRAS基因是EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的重要節(jié)點,該基因的突變可以導(dǎo)致EGFR-TKI原發(fā)性耐藥,同時它亦是判斷NSCLC患者預(yù)后的重要指標(biāo).KRAS基因突變具有明顯的地域差異,西方人群中KRAS突變率約25%,明顯高于東亞人群10%,且KRAS基因突變多見于男性,吸煙以及肺腺癌[27].在本研究中,KRAS基因的突變率為13.1%,且腺癌的突變率(14.1%)高于鱗癌(7.7%)和其他類型癌(10.5%).這些發(fā)現(xiàn)也與既往研究[27,28]一致.

在NSCLC中同時存在EGFR和KRAS突變非常罕見,一直以來研究者認為兩者互斥[16-18].但在本研究中,共有3例樣本在EGFR和KRAS基因上同時發(fā)生了突變,均為女性肺腺癌患者,且經(jīng)直接測序法驗證,說明EGFR和KRAS雙突變可以同時存在,KRAS的突變可能會導(dǎo)致具有EGFR敏感突變患者對EGFR-TKIs耐藥.在臨床中,約30% EGFR陽性NSCLC患者對EGFR-TKIs靶向治療無應(yīng)答,即發(fā)生原發(fā)性耐藥[29].本研究,在320例檢測EGFR和KRAS突變的樣本中,EGFR的突變率為30.3%(97/320),其中在EGFR突變陽性樣本中,KRAS的突變率為3.1%(3/97),其遠遠低于30%,說明EGFR-TKIs原發(fā)耐藥除了KRAS突變外,還有很多其他機制參與,如BIM表達水平等[29].

總之,本研究提示在I期-IIIa期可手術(shù)的NSCLC樣本中EGFR基因突變率低,EGFR基因突變和KRAS基因突變可同時存在.但該研究仍有較多缺陷,它是一項回顧性研究,所得結(jié)論是與其他研究結(jié)果進行比較得出,未納入IV期標(biāo)本做為對照,部分臨床資料收集不完善以及EGFR檢測內(nèi)容不全,這些均需要在后續(xù)研究中改進和完善,并進一步驗證研究結(jié)論的可靠性.