桃果實CyPD基因的克隆、生物信息學(xué)分析及蛋白表達(dá)

上官相超+胡順卿+周杰+朱樹華

摘要：線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）是線粒體內(nèi)膜上的一種蛋白復(fù)合體，在細(xì)胞凋亡或壞死中具有重要作用。親環(huán)蛋白D（CyPD）是MPTP的重要組成蛋白，對線粒體引起的細(xì)胞凋亡有重要的調(diào)節(jié)作用，但植物中該蛋白的研究較少。本試驗通過PCR、RACE等分子生物學(xué)技術(shù)克隆獲得了肥城桃果實線粒體CyPD基因cDNA序列，該序列全長663 bp，開放閱讀框為615 bp，編碼204個氨基酸；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，肥城桃CyPD與蘋果CyPD蛋白在進(jìn)化關(guān)系上最為親密；蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模擬表明，該蛋白含有2個α螺旋、8個β折疊結(jié)構(gòu)；體外構(gòu)建了pET-32a-CyPD重組表達(dá)載體，并成功在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究CyPD蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：肥城桃；線粒體；CyPD；基因克??；蛋白表達(dá)

中圖分類號：S662.1：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2017）08-0007-05

Abstract Mitochondrial membrane permeability transition pore （MPTP） is a kind of protein complex playing important roles in cell apoptosis and necrosis. Cyclophilin D （CyPD） plays roles in cell mitochondria-mediated apoptosis， which is an important part of MPTP. However， there are fewer researches on CyPD in plants. In this study， the full-length cDNA of CyPD was gained by molecular biology method. It was 663 bp， contained 615 bp of the coding sequence and encoded a polypeptide of 204 amino acids. The recombinant CyPD protein was expressed in Escherichia coli. The phylogentic tree revealed that CyPD was more closely related to apple CyPD protein in evolution. The three-dimensional structure of CyPD showed that the protein contained 2 α-helix and 8 β-pleated sheets. These results would lay a foundation for studying the structure and function of CyPD protein further.

Keywords Feicheng peach； Mitochondria； CyPD； Gene clone； Protein expression

線粒體是一種具有雙層膜結(jié)構(gòu)的半自主細(xì)胞器，除具有能量轉(zhuǎn)化、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化及儲存鈣離子等功能外[1-5]，還參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化和細(xì)胞信息傳遞等過程[6-8]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，是自主有序的、多基因嚴(yán)格控制的過程[9]。Bcl-2基因的發(fā)現(xiàn)使人們認(rèn)識到細(xì)胞凋亡過程的復(fù)雜性[10]，隨著對細(xì)胞凋亡的深入研究，人們逐步認(rèn)識到細(xì)胞凋亡有三條途徑：膜受體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑和線粒體途徑[11-13]。

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）是線粒體上的一個特殊孔道。MPTP開放被認(rèn)為是線粒體導(dǎo)致細(xì)胞死亡的眾多途徑中關(guān)鍵的一個，是細(xì)胞凋亡的限速步驟[14]。有研究表明，構(gòu)成MPTP的主要蛋白包括：線粒體腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運體（adenine nucleotide translocator，ANT）、親環(huán)蛋白D（cyclophilin D，CyPD）、電壓依賴型陰離子通道（voltage dependent anion channel，VDAC）、F0F1-ATP酶（ATP synthase）以及磷酸鹽載體（phosphate carrier，PiC）[15，16]。

CyPD是CyP蛋白家族的線粒體表型，是一種水溶性蛋白，有207個氨基酸，分子量約為20 kD。CyPD的N端有一段信號序列，使其定位于線粒體基質(zhì)中，蛋白轉(zhuǎn)運到線粒體后這段序列被切除[17]。CyPD在植物體生長和發(fā)育調(diào)節(jié)、代謝調(diào)控以及逆境應(yīng)答方面均發(fā)揮重要作用，是線粒體通透性轉(zhuǎn)變的主要調(diào)節(jié)元件之一。越來越多的證據(jù)顯示，CyPD 參與多種因素所致的MPTP開放[18]，調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)的細(xì)胞壞死過程[19，20]。

近年來，人們圍繞CyPD開展了很多研究，但這些研究主要集中在動物CyPD蛋白，對植物中該蛋白的研究相對較少。本試驗擬借助分子生物學(xué)手段，克隆獲得肥城桃CyPD基因，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并嘗試體外表達(dá)CyPD蛋白，以期為進(jìn)一步研究CyPD的結(jié)構(gòu)與功能及在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試桃品種為“大紅袍”（Prums persica [L.]Batsch cv. Dahongpao），采摘于山東省肥城市肥城桃基地。選取大小均勻、無機(jī)械損傷、無病蟲害的七成熟果實，采摘后運回實驗室，4℃下過夜預(yù)冷。桃果實切塊并液氮冷凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

大腸桿菌E. coli DH5α、E. coli BL21（DE3）以及含pET-32a質(zhì)粒的大腸桿菌均為本實驗室保存，pMD18-T Vector、PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit、SMARTerTM RACE 5′/3′ Kit、T4 DNA Ligase均購自TaKaRa公司。endprint

試驗所用引物均由北京華大基因科技公司合成（表1）。

1.2 試驗方法

1.2.1 肥城桃果實總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成 桃果實總RNA的提取方法參照改良CTAB法[21]，并使用PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。

1.2.2 肥城桃果實線粒體CyPD基因中間序列的克隆 在NCBI網(wǎng)站的GenBank板塊查找其它植物的CyPD基因序列，找出同源性較高片段，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計簡并引物CyPD-S和CyPD-AS。以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳后將目的條帶切下，使用Mini BEST Agarose Gel DNA Extraction Kit試劑盒回收DNA片段。將DNA片段連接pMD18-T Vector，構(gòu)建克隆載體，轉(zhuǎn)化DH5α。篩選出陽性克隆，菌液PCR驗證后，送華大基因科技公司進(jìn)行測序。

1.2.3 肥城桃果實CyPD基因全長的獲得及生物信息學(xué)分析 根據(jù)測序得到的中間片段序列，設(shè)計RACE引物GSP1、GSP2和巢式引物NGSP1、NGSP2。使用SMARTerTM RACE 5′/3′ Kit試劑盒進(jìn)行3′-RACE和5′-RACE。將巢式PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳并切膠回收，按前述步驟構(gòu)建克隆載體，進(jìn)行測序。將測序得到的5′端序列和3′端序列與中間序列進(jìn)行拼接，得到CyPD基因全長。用DNAMAN軟件推斷其編碼的氨基酸序列，并對不同物種的CyPD氨基酸序列進(jìn)行比對分析，通過MEGA5.1軟件構(gòu)建CyPD蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹，使用在線網(wǎng)站SWISS-MODEL進(jìn)行CyPD三維結(jié)構(gòu)的模擬。

1.2.4 CyPD蛋白的體外表達(dá) 根據(jù)CyPD的編碼區(qū)序列，設(shè)計含酶切位點的引物CyPD-1和CyPD-2，進(jìn)行PCR，獲得CyPD基因全長，使用pMD18-T Vector進(jìn)行克隆載體的構(gòu)建?？寺≥d體與pET-32a質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后分別回收目的條帶，使用T4 DNA Ligase進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒pET-32a-CyPD。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL21 （DE3），菌液PCR驗證成功后進(jìn)行體外蛋白表達(dá)。取200 μL菌液加入到100 mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基，抗生素為氨芐。37℃恒溫振蕩培養(yǎng)，OD600=0.4～0.6時取1 mL菌液作對照，剩余菌液中加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃誘導(dǎo)過夜，對樣品進(jìn)行12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 CyPD基因全長的獲得

肥城桃CyPD基因中間片段的擴(kuò)增結(jié)果如圖1A所示，在230 bp左右出現(xiàn)目的條帶，符合預(yù)期長度。將目的條帶切膠回收并測序，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計RACE引物和巢式引物。RACE結(jié)果如圖1B所示，3′和5′ RACE產(chǎn)物條帶單一明亮，說明設(shè)計的引物特異性較好。將RACE產(chǎn)物切膠回收并測序，并將測序結(jié)果進(jìn)行拼接，得到肥城桃CyPD基因序列。該基因長633 bp，用DNAMAN進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該序列含有完整的開放閱讀框，閱讀框內(nèi)含有615個堿基，編碼204個氨基酸。

2.2 CyPD蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

運用MEGA5.1構(gòu)建CyPD蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹，在所選物種中，肥城桃CyPD蛋白與蘋果CyPD蛋白在進(jìn)化關(guān)系上最為親密，和小麥、山羊草進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。其中肥城桃、蘋果、油茶、麻風(fēng)樹的CyPD蛋白在進(jìn)化關(guān)系上位于同一分支（圖2）。

2.3 CyPD蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬分析

向SWISS-MODEL網(wǎng)站提交蛋白氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，構(gòu)建模型需要氨基酸序列識別度達(dá)到25%以上，以1dyw.1.A（識別度為71.86%）為模板構(gòu)建CyPD蛋白結(jié)構(gòu)模型。CyPD蛋白結(jié)構(gòu)與模型蛋白結(jié)構(gòu)擬合度較高，所有氨基酸相似度均在0.6以上（圖3A）。從三維結(jié)構(gòu)（圖3B）可以看出，該蛋白中含有2個α螺旋、8個β折疊結(jié)構(gòu)。

2.4 CyPD蛋白體外表達(dá)

CyPD基因片段與pET-32a質(zhì)粒經(jīng)T4 DNA Ligase連接，獲得重組質(zhì)粒pET-32a-CyPD，將其導(dǎo)入BL21 （DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得CyPD重組蛋白。電泳結(jié)果如圖4所示，CyPD重組蛋白表達(dá)成功，分子量約為38 kD，表達(dá)量較高。

3 討論與結(jié)論

本試驗采用同源克隆的方法，獲得了肥城桃CyPD基因中間片段，然后根據(jù)中間片段設(shè)計RACE引物，獲得了5′端和3′端序列，經(jīng)過序列拼接得到了準(zhǔn)確的CyPD基因cDNA全長。CyPD蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹表明肥城桃CyPD蛋白與蘋果CyPD蛋白在進(jìn)化關(guān)系上最為親密，蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬表明該蛋白含有2個α螺旋、8個β折疊結(jié)構(gòu)。之后體外重組了pET-32a-CyPD克隆載體，并在BL21（DE3）中成功表達(dá)獲得CyPD重組蛋白。

CyPD的主要特征是具有肽脯氨酰順反異構(gòu)酶活性，能夠催化蛋白中脯氨酸肽鍵（Xaa-Pro）的順反異構(gòu)化，在蛋白折疊或構(gòu)象變化中能夠加速含脯氨酸蛋白的折疊[22， 23]。CyPD的另一特征是能夠與其抑制劑CsA特異性結(jié)合，從而使后者具有高效的免疫抑制性能[24，25]。研究表明，CsA與CyPD結(jié)合后能抑制CyPD順反異構(gòu)酶的活性，從而抑制MPTP開放[26]。以CsA作抑制劑，探索CyPD功能缺失情況下MPTP的開放情況，可作為下一步研究的方向。

MPTP是多種蛋白質(zhì)組成的蛋白復(fù)合體，參與了線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而MPTP各組分間的相互作用在此過程中發(fā)揮了重要作用。PiC和ANT均已經(jīng)被證明在MPTP的結(jié)構(gòu)構(gòu)成和功能代謝上具有重要作用[27-29]，研究表明在小鼠中CyPD能通過與ANT結(jié)合或者通過促進(jìn)鈣離子觸發(fā)的PiC變構(gòu)而促進(jìn)MPTP開放[30，31]，但尚不清楚植物中CyPD是否能與PiC及ANT發(fā)生相互作用。endprint

作為MPTP的重要組成成分，CyPD具有重要的研究價值。本試驗以肥城桃為材料對CyPD的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了初步探討，并取得了一定的進(jìn)展，為深入了解CyPD在MPTP開放乃至在線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用奠定理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Chaban Y， Boekema E J， Dudkina N V. Structures of mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and mechanisms for their stabilisation[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA） - Bioenergetics， 2014， 1837（4）： 418-426.

[2]Glancy B， Willis W T， Chess D J， et al. Effect of calcium on the oxidative phosphorylation cascade in skeletal muscle mitochondria[J]. Biochemistry， 2013， 52（16）： 2793-2809.

[3]Kiss G， Konrad C， Pour-Ghaz I， et al. Mitochondrial diaphorases as NAD+ donors to segments of the citric acid cycle that support substrate-level phosphorylation yielding ATP during respiratory inhibition[J]. FASEB Journal， 2014， 28（4）： 1682-1697.

[4]Lee J， Giordano S， Zhang J. Autophagy， mitochondria and oxidative stress： cross-talk and redox signalling[J]. The Biochemical Journal， 2012， 441（2）： 523-540.

[5]Nunes-Nesi A， Araújo W L， Obata T， et al. Regulation of the mitochondrial tricarboxylic acid cycle[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2013， 16（3）： 335-343.

[6]Chu C T， Baylr H， Kagan V E. LC3 binds externalized cardiolipin on injured mitochondria to signal mitophagy in neurons[J]. Autophagy， 2014， 10（2）： 376-378.

[7]Bai X， Yan Y， Canfield S， et al. Ketamine enhances human neural stem cell proliferation and induces neuronal apoptosis via reactive oxygen species-mediated mitochondrial pathway[J]. Anesthesia and Analgesia， 2013， 116（4）： 869-880.

[8]Cheng Z， Ristow M. Mitochondria and metabolic homeostasis[J]. Antioxidants & Redox Signaling， 2013， 19（3）： 240-242.

[9]Sinha K， Das J， Pal P B， et al. Oxidative stress： the mitochondria-dependent and mitochondria-independent pathways of apoptosis[J]. Archives of Toxicology， 2013， 87（7）：1157-1180.

[10]Reed J C. Roles of apoptosis-regulating Bcl-2 family genes in AML[M]//Andreeff M （Ed.）. Targeted Therapy of Acute Myeloid Leukemia， New York： Springer， 2015： 47-65.

[11]Wang R， Ma L， Weng D， et al. Gallic acid induces apoptosis and enhances the anticancer effects of cisplatin in human small cell lung cancer H446 cell line via the ROS-dependent mitochondrial apoptotic pathway[J]. Oncol. Rep.， 2016， 35（5）： 3075-3083.

[12]Kumar N， Raj V P， Jayshree B S， et al. Elucidation of structure-activity relationship of 2-quinolone derivatives and exploration of their antitumor potential through Bax-induced apoptotic pathway[J]. Chem. Biol. Drug Des.， 2012， 80（2）： 291-299.endprint

[13]Yee C， Yang W， Hekimi S. The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C.elegans[J]. Cell， 2014， 157（4）： 897-909.

[14]Bernardi P， Rasola A， Forte M， et al. The mitochondrial permeability transition pore： channel formation by F-ATP synthase， integration in signal transduction， and role in pathophysiology[J]. Physiological Reviews， 2015， 95（4）： 1111-1155.

[15]Kinnally K W， Peixoto P M， Ryu S-Y， et al. Is mPTP the gatekeeper for necrosis， apoptosis， or both？[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA） - Molecular Cell Research， 2011， 1813（4）： 616-622.

[16]Richardson A P， Halestrap A P. Quantification of active mitochondrial permeability transition pores using GNX-4975 inhibitor titrations provides insights into molecular identity[J]. Biochemical Journal， 2016， 473（9）： 1129-1140.

[17]Andreeva L， Heads R， Green C J. Cyclophilins and their possible role in the stress response[J]. Int. J. Exp. Pathol.， 1999， 80（6）： 305-315.

[18]Tsujimoto Y， Shimizu S. Role of the mitochondrial membrane permeability transition in cell death[J]. Apoptosis， 2007， 12（5）： 835-840.

[19]Waldmeier P C， Zimmermann K， Qian T， et al. Cyclophilin D as a drug target[J]. Curr. Med. Chem.， 2003， 10（16）： 1485-1506.

[20]Lemasters J J， Qian T， He L， et al. Role of mitochondrial inner membrane permeabilization in necrotic cell death， apoptosis， and autophagy[J]. Antioxidants & Redox Signaling， 2002， 4（5）： 769-781.

[21]陳長寶， 朱樹華， 周杰. 改良 CTAB 法提取成熟肥城桃果實的總RNA[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009（5）： 102-104.

[22]Bernardi P， Di Lisa F. The mitochondrial permeability transition pore： molecular nature and role as a target in cardioprotection[J]. Journal of Molecular and Cellular Cardiology， 2015， 78： 100-106.

[23]Itani H A， Dikalova A E， McMaster W G， et al. Mitochondrial cyclophilin D in vascular oxidative stress and hypertension[J]. Hypertension， 2016， 67（6）： 1218-1227.

[24]Wang S， Wei A C， Fu Z， et al. Cyclophilin D binds to Tufm and suppresses mitochondrial translation[J]. Circulation， 2014， 130（Suppl 2）： 274-280.

[25]Gineste C， Hernandez A， Ivarsson N， et al. Cyclophilin D， a target for counteracting skeletal muscle dysfunction in mitochondrial myopathy[J]. Hum. Mol. Genet.， 2015， 24（23）： 6580-6587.

[26]Javadov S， Kuznetsov A. Mitochondrial permeability transition and cell death： the role of cyclophilin D[J]. Front Physiol.， 2013， 4： 76.

[27]Zhu W， Miao Q， Sun D， et al. The mitochondrial phosphate transporters modulate plant responses to salt stress via affecting ATP and gibberellin metabolism in Arabidopsis thaliana[J]. PLoS ONE， 2012， 7（8）： e43530.

[28]Qiu Y， Yu T， Wang W， et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore （mPTP） opening[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2014， 448（1）： 15-21.

[29]Kwong J Q， Molkentin J D. Physiological and pathological roles of the mitochondrial permeability transition pore in the heart[J]. Cell Metabolism， 2015， 21（2）： 206-214.

[30]Itoh T， Kouzu H， Miki T， et al. Cytoprotective regulation of the mitochondrial permeability transition pore is impaired in type 2 diabetic Goto–Kakizaki rat hearts[J]. Journal of Molecular and Cellular Cardiology， 2012， 53（6）： 870-879.

[31]Leung A W C， Varanyuwatana P， Halestrap A P. The mitochondrial phosphate carrier interacts with cyclophilin D and may play a key role in the permeability transition[J]. The Journal of Biological Chemistry， 2008， 283（39）： 26312-26323.endprint