黑素皮質(zhì)素受體4（MC4R）基因在5個地方雞種中的遺傳多態(tài)性分析

周艷+雷秋霞+韓海霞+李福偉+高金波+劉瑋+逯巖+曹頂國

摘要：本試驗采用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法分析了黑素皮質(zhì)素受體4（MC4R）基因在5個地方雞種中的遺傳多態(tài)性，結(jié)果在5個供試雞群體中檢測到兩個突變位點。在NC_006089.4：g.54 C>G位點中，CC基因型在萊蕪黑雞和瑯琊雞中均沒有檢測到，CG雜合型在汶上蘆花雞中表現(xiàn)為優(yōu)勢基因型，突變型GG基因型在其余4個群體中表現(xiàn)為優(yōu)勢基因型，等位基因G在所有供試群體中表現(xiàn)為優(yōu)勢等位基因。在NC_006089.4：g.315位點中，GT雜合型在汶上蘆花雞中表現(xiàn)為優(yōu)勢基因型，GG野生型在其余4個群體中表現(xiàn)為優(yōu)勢基因型，等位基因G在除汶上蘆花雞以外的4個群體中表現(xiàn)為優(yōu)勢等位基因。

關(guān)鍵詞：雞；MC4R基因；PCR-SSCP；PCR-RFLP；遺傳多態(tài)性

中圖分類號：S831.2 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2017）08-0127-04

Abstract The SNPs of MC4R gene in five Chinese indigenous Chicken Breeds were detected by PCR-SSCP and PCR-RFLP methods. As a result， two mutations in MC4R gene were identified. In NC_006089.4：g.54 C>G， genotype CC was not found in Laiwu Black chickens and Langya chickens， the frequency of genotype CG was higher than that of the other genotypes in Wenshang Barred chickens， and GG showed to be the advantageous genotype in the other four populations； allele G was dominant in all the five populations. In NC_006089.4： g.315， heterozygous genotype GT was advantageous in Wenshang Barred chickens， and GG was advantageous in other four populations； allele G was dominant in the four populations except Wenshang Barred chickens.

Keywords Chicken； MC4R gene； PCR-SSCP； PCR-RFLP； Genetic polymorphism

黑素皮質(zhì)素受體4（melanocortin-4 receptor，MC4R）基因?qū)儆诤谒仄べ|(zhì)素受體家族，為G蛋白耦聯(lián)受體超家族的一員。目前，人們已經(jīng)在5個物種（人、豬、鼠、雞和牛）中分離并克隆出所有的MCRs亞型[1]。已有研究表明，MC4R主要在控制體重、采食量和能量穩(wěn)態(tài)的過程中發(fā)揮重要作用[2，3]。MC4R基因多個單堿基突變已被認(rèn)為與人類肥胖病癥關(guān)系密切[4-7]； MC4R-/-小鼠表現(xiàn)為極度肥胖[8]；豬MC4R基因被認(rèn)為是影響生長肥育性狀的主效基因之一[9]；中國西門塔爾牛MC4R基因表達(dá)量也被認(rèn)為與背膘厚度呈顯著相關(guān)[10]。

雞MC4R基因被定位在2號染色體的2q12處，由長996 bp的單一外顯子構(gòu)成，編碼332個氨基酸，在腎上腺、性腺、脾、脂肪等組織中廣泛表達(dá)[11]。目前雞MC4R基因的相關(guān)研究結(jié)果表明，MC4R基因?qū)﹄u生長和體組成性狀有顯著影響[12，13]，但對雞脂肪性狀的影響還未有定論。我國地方雞品種資源非常豐富，以肉質(zhì)鮮美而聞名，本研究采用PCR-SSCP技術(shù)和PCR-RFLP技術(shù)檢測MC4R基因在我國地方雞種中的遺傳多樣性，以期為我國地方雞種的創(chuàng)新利用提供科學(xué)資料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

5個地方雞種汶上蘆花雞（WL）、濟寧百日雞（JB）、萊蕪黑雞（LH）、瑯琊雞（LY） 和石岐雜雞（SQZ）均來自山東省地方雞品種資源活體基因庫，飼養(yǎng)全階段由專人管理，營養(yǎng)水平一致。每品種隨機抽取30只個體，公母各半，翅靜脈采血，EDTA抗凝，酚/氯仿抽提基因組DNA。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計

根據(jù)雞MC4R基因DNA序列（GenBank號： NC_006089.4），采用Primer Premier 5.0和Oligo 6軟件設(shè)計P3引物，P2引物參考李國輝等[14]擴增外顯子區(qū)域，引物由上海英俊生物工程有限公司合成。引物2為SSCP引物，擴增目的片段長度為210 bp，引物3為FbrⅠ酶切引物，目的片段長度為610 bp。各引物序列如下：

P2F：5′CCATAAGATGAATTTCACCCAG3′，

P2R：5′TTGCCACAATGACCAAGACG3′；

P3F：5′TAGCCAAGAACAAGAACC3′，

P3R：5′GGGCAGGAGATGTAGAAA3′。

1.3 PCR擴增

PCR擴增體系（10 μL）：2×Taq PCR MasterMix（北京天根）5 μL，ddH2O 3.6 μL，引物（10 pmol/μL） 各0.3 μL，模板DNA（50 ng/μL）0.8 μL。

PCR程序：94℃ 5 min；94℃ 40 s，55.6℃（P2）/50.6℃（P3）40 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。endprint

1.4 PCR-SSCP分析

10 μL引物2的PCR產(chǎn)物98℃變性8 min后，冰浴5 min，12%非變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr∶Bis=29∶1）電泳，250 V電泳30 min后160 V繼續(xù)電泳16～17 h。電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染顯帶并記錄結(jié)果。

1.5 PCR-RFLP分析

酶切反應(yīng)體系15 μL，其中FbrⅠ內(nèi)切酶0.5 μL（10 U/μL），10×Buffer G 1 μL，P3引物PCR產(chǎn)物8 μL，ddH2O 5.5 μL，37℃恒溫水浴過夜。

電泳檢測：2.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V電泳1 h，于紫外燈下觀察并拍照，檢測酶切產(chǎn)物。

1.6 序列分析

經(jīng)PCR-SSCP和PCR-RFLP基因分型后，每個基因型取兩個不同個體的PCR擴增產(chǎn)物在濟南科益科技有限公司進(jìn)行獨立測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

用設(shè)計的兩對引物對5個地方雞種的基因組DNA進(jìn)行擴增，所得PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。引物2的擴增片段長度為210 bp，引物3的擴增片段長度為610 bp，擴增條帶均單一、明亮，片段長度符合預(yù)期要求，無非特異性條帶產(chǎn)生，可以用于后續(xù)分析。

2.2 基因分型結(jié)果

在12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳條件下，對5個地方雞種引物2的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分析，對引物3進(jìn)行FbrⅠ酶切檢測，結(jié)果每對引物各檢測到 3種基因型，具體見圖2。

引物2的3種基因型分別命名為CC、CG、GG。引物3的分別命名為GG、GT、TT，其中TT型條帶為244、208、112 bp和46 bp，GG型條帶為320、244 bp和46 bp，GT型條代為320、244、208、112 bp和46 bp。

2.3 不同基因型個體的序列測定結(jié)果

測序結(jié)果（圖3）表明， P2引物和P3引物位點多態(tài)性均由該段序列中的1個核苷酸的點突變造成， 分別為54 bp處發(fā)生點突變C→G（反向測序）， 命名為NC_006089.4：g.54 C>G和315 bp處發(fā)生點突變由G→T，命名為NC_006089.4：g.315 G>T。我們將與GenBank發(fā)布序列一致的純合基因型命名為野生型，根據(jù)這個原則，NC_006089.4：g.54 C>G位點，基因型CC為野生型，GG為突變型；NC_006089.4：g.315 G>T位點GG為野生型，TT為突變型。

2.4 各多態(tài)位點的基因型頻率和等位基因頻率

對汶上蘆花雞、萊蕪黑雞、濟寧百日雞、石岐雜雞和瑯琊雞進(jìn)行了MC4R基因兩個多態(tài)位點的基因型檢測，計算了各品種的基因型頻率和等位基因頻率，結(jié)果見表1。

由表1可知，在NC_006089.4：g.54 C>G多態(tài)性位點中，CC基因型在萊蕪黑雞和瑯琊雞中均沒有檢測到，CG雜合型在汶上蘆花雞中表現(xiàn)為優(yōu)勢基因型，突變型GG基因型在其余4個群體中表現(xiàn)為優(yōu)勢基因型，等位基因G在所有供試群體中表現(xiàn)為優(yōu)勢等位基因。在NC_006089.4：g.315多態(tài)位點中，GT雜合型在汶上蘆花雞中表現(xiàn)為優(yōu)勢基因型，GG野生型在其余4個群體中表現(xiàn)為優(yōu)勢基因型，等位基因G在除汶上蘆花雞以外的4個群體中表現(xiàn)為優(yōu)勢等位基因。

3 討論與結(jié)論

中樞黑皮素神經(jīng)系統(tǒng)在攝食行為及能量代謝中起著重要作用，而MC4R基因在這個復(fù)雜的信號通路中起關(guān)鍵作用，其V103I突變被證實與人類肥胖密切相關(guān)[15，16]。劉桂蘭等[17]研究表明MC4R基因多態(tài)性與豬平均背膘、腰椎間膘厚等脂肪性狀顯著相關(guān)，李長龍等[18]也證實MC4R基因多態(tài)性與豬肌內(nèi)脂肪和背膘都有顯著相關(guān)性。除與脂肪性狀密切相關(guān)外，MC4R基因多態(tài)性也被表明與兔[19]、鴿[20]和鵝[21]的生長及體組成相關(guān)。李國輝等[14]在培育品種京海黃雞中檢測到MC4R基因的2個突變位點，隨后陶勇等[22]分析了其中一個位于編碼區(qū)662位點的突變與京海黃雞生長性能的相關(guān)性，結(jié)果表明該位點突變與京海黃雞4、8、12和16周齡體重顯著相關(guān)。

本研究分析了MC4R基因的兩個突變位點共6種基因型在5個地方雞種中的分布，結(jié)果表明所檢測的兩個突變位點在5個供試群體中的多態(tài)性并不豐富，NC_006089.4：g.54 C>G多態(tài)性位點CC基因型在萊蕪黑雞和瑯琊雞中均沒有檢測到，這與陶勇等[22]、李國輝等[14]就該位點在京海黃雞中的研究結(jié)果一致，表明該位點在我國部分地方雞種及其培育品種中的分布基本一致。值得注意的是，所檢測的兩個突變中，汶上蘆花雞的優(yōu)勢基因型均與其他4個地方雞種表現(xiàn)不一致，這是否暗示汶上蘆花雞與其他雞種的遺傳距離較遠(yuǎn)還需進(jìn)一步驗證。但在所有5個地方雞種中，兩個突變位點的優(yōu)勢等位基因表現(xiàn)一致，而我國地方雞種以肉質(zhì)鮮美而聞名，所以本研究檢測到的優(yōu)勢基因型和等位基因可否作為肉質(zhì)性狀的分子標(biāo)記應(yīng)用于我國地方雞種的創(chuàng)新利用有待于進(jìn)一步驗證。

參考文獻(xiàn)：

[1]李蓉，秦延洋，齊智利. 黑皮質(zhì)素受體4對采食和能量代謝調(diào)控機制的研究進(jìn)展[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2017， 49（1）：110-113.

[2]蔣思文，彭健，熊遠(yuǎn)著. 黑素皮質(zhì)素受體對動物采食量和能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)控[J]. 遺傳， 2002，24（2）：223-226.

[3]Todorovic A， Haskell-Luevano C. A review of melanocortin receptor small molecule ligands [J]. Peptides， 2005， 26（10）： 2026-2036.

[4]張翼飛，寧光. MC4R及其基因突變與肥胖相關(guān)性研究進(jìn)展[J]. 國外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊，2003，26（1）：39-40.endprint

[5]蔡姝冰，賈偉平，方啟晨， 等. F261S-肥胖患者中黑皮素4受體基因的新突變[J]. 中華內(nèi)分泌代謝雜志， 2004， 20（4）： 372-375.

[6]邵新宇，賈偉平，蔡姝冰， 等. 人黑皮素4受體F261S突變基因的克隆和功能驗證[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志， 2005， 85： 366-369.

[7]王?？。R軍，張愫， 等. 黑皮素4受體基因多態(tài)性與青少年肥胖的相關(guān)性研究[J]. 中國學(xué)校衛(wèi)生， 2007， 28（1）：12-14.

[8]Satoh N， Ogawa Y， Katsuira G， et al. Satiety effect and sympathetic activation of leptin are mediated by hypothalamic melanocortin system [J]. Neurosci. Lett.， 1998， 249（2/3）： 107-110.

[9]Kim K S， Larsen N， Rothschild M F. Linkage and physical mapping of the porcine melanocortin-4 receptor （MC4R） gene [J]. Journal of Animal Science， 2000， 78（3）： 791-792.

[10]黃萌，許尚忠，李俊雅，等. 中國西門塔爾牛MC3R和MC4R基因組織表達(dá)譜及其在脂肪組織中表達(dá)水平與背膘厚度的相關(guān)性研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2011， 42（4）： 489-494.

[11]Takeuchi S， Takahashi S. Melanocortin receptor genes in the chicken-Tissue distributions [J]. Gen. Comp. Endocrinol.， 1998， 112（2）： 220-231.

[12]霍明東，王守志，李輝. MC4R基因多態(tài)性與雞生長和體組成性狀的相關(guān)研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，37（2）：184-189.

[13]仇雪梅，李寧，鄧學(xué)梅，等. 雞MC4R基因的SNPs及其與屠體性狀的相關(guān)研究[J]. 中國科學(xué)C輯：生命科學(xué)，2006，36（2）：127-133.

[14]李國輝，王金玉，陶勇， 等. 京海黃雞MC4R基因新突變位點的分析[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2008，37（2）：28-30.

[15]Geller F， Reichwald K， Dempfle A， et al. Melanocortin-4 receptor gene variant I103 is negatively associated with obesity [J]. Am. J. Hum. Genet.， 2004， 74（3）： 572-581.

[16]Wang D，Ma J，Zhang S，et al. Association of the MC4R V103I polymorphism with obesity： a Chinese case-control study and meta-analysis in 55，195 individuals [J]. Obesity（Silver Spring），2010，18（3）：573-579.

[17]劉桂蘭，蔣思文，熊遠(yuǎn)著， 等. 豬資源家系MC4R基因掃描及其與脂肪性狀的相關(guān)分析[J]. 遺傳學(xué)報， 2002， 229（6）：497-501.

[18]李長龍，潘玉春，孟和，等. H-FABP、MC4R、ADD1基因多態(tài)性在3個豬群中分布及其與肌內(nèi)脂肪和背膘的相關(guān)研究[J].遺傳，2006， 28（2）：159-164.

[19]蔣美山，陳仕毅，賴松家， 等. 兔黑素皮質(zhì)素受體4（MC4R）基因多態(tài)性及其與體重及屠體性狀的關(guān)聯(lián)研究[J].遺傳， 2008， 30（12）：1574-1578.

[20]李世鵬，白秀娟. 鴿黑素皮質(zhì)素受體4基因多態(tài)性與生長性狀及體組成的相關(guān)研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2008， 35（10）：67-72.

[21]陳宏權(quán)，黃華云，陳華， 等. 鵝MC4R基因RFLP及其與胴體和羽絨性狀的關(guān)聯(lián)性[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報， 2008， 39（7）：885-890.

[22]陶勇，李國輝，王金玉， 等. 京海黃雞MC4R基因多態(tài)性及其與生長性能的關(guān)聯(lián)分析[J].中國家禽， 2008， 30（5）：21-23.endprint