玉米葉片硝酸還原酶活性測定方法的優(yōu)化

宋月+崔婷婷+武麗娟

摘要：以玉米（Zea mays L.）自交系許178為材料，通過考察研磨方法、NADH用量、溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間、顯色時(shí)間對玉米葉片硝酸還原酶活性的影響獲得最優(yōu)試驗(yàn)條件。結(jié)果表明，石英砂研磨比液氮研磨測得的酶活性高；反應(yīng)溫度35 ℃、pH 7.5為較適反應(yīng)條件；反應(yīng)時(shí)間和顯色時(shí)間均為10 min時(shí)測得的硝酸還原酶活性與標(biāo)準(zhǔn)方法相比無顯著差異；還原劑NADH用量減少至一半測得的硝酸還原酶活性與標(biāo)準(zhǔn)方法無顯著差異。綜上所述，玉米葉片硝酸還原酶活性測定的優(yōu)化處理方案為用石英砂研磨，加入0.15 mL NADH，在35 ℃、pH 7.5的條件下反應(yīng)10 min，顯色10 min。

關(guān)鍵詞：硝酸還原酶；玉米（Zea mays L.）葉片；測定條件；優(yōu)化

中圖分類號：S513 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）15-2817-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.15.005

Abstract： In order to get the optimal experimental conditions，taking maize （Zea mays L.） inbred lines Xu178 as material，the effects of grinding methods，dosage of reductant NADH，reaction temperature，reaction time，pH and color developing time on nitrate reductase of maize leaves were studied. The results showed that Quartz sand grinding has higher activity than liquid nitrogen. The optimal reaction temperature was 35 ℃ and the optimal pH value was 7.5. There were no significant differences between the standard method and the reaction conditions that reaction time and coloration time were both 10 min， and also no significant differences between the half dosage of the reducing agent NADH and the standard methods dosage. In conclusion，the optimal experimental conditions to assay nitrate reductase activity of the maize leaves were that Quartz sand grinding，the reaction temperature was 35 ℃，the pH value was 7.5，the reaction time was 10 min，the color developing time was 10 min and dosage of reductant NADH was 0.15 mL.

Key words： nitrate reductase； maize （Zea mays L.） leaves； determination conditions； optimization

氮素是玉米（Zea mays L.）生長發(fā)育所需同化物質(zhì)的主要來源，對玉米產(chǎn)量起著至關(guān)重要的作用[1]。硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）是植物體氮素同化和代謝過程的首個(gè)關(guān)鍵限速酶[2-5]，在植物高效利用氮素過程中具有重要的生物學(xué)地位，因此NR活性的高低可以反映植株的氮素營養(yǎng)狀況和氮代謝水平[6]。研究不同玉米品種葉片NR活性的差異是反應(yīng)氮效率的一個(gè)重要生理指標(biāo)[7-12]。

目前報(bào)道的測定植物葉片NR活性的方法主要有活體法[13]和離體法[14]。活體法操作相對簡單、快速，但是存在測定值偏低、重復(fù)性不夠理想的缺點(diǎn)，因此在科研試驗(yàn)上應(yīng)用較多的還是離體法。離體法操作步驟繁瑣，在測定過程中需要嚴(yán)格控制各項(xiàng)操作條件，同時(shí)對于不同的植物葉片，需要的試驗(yàn)條件也會(huì)有所差異。本研究以玉米自交系許178穗位葉為試驗(yàn)材料，對研磨輔助材料、研磨時(shí)間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、還原劑用量及pH共6個(gè)因素設(shè)置不同處理，以期篩選出玉米葉片NR活性測定的最佳方法，從而為玉米氮高效研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料取自陜西省楊凌示范區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)西卜村新品種示范園中進(jìn)行田間試驗(yàn)的玉米自交系許178。于2015年7月20日，在玉米吐絲后一周時(shí)取長勢均勻一致的植株穗位葉葉片，迅速放入液氮中冷凍，帶回實(shí)驗(yàn)室放入-80 ℃冰箱保存，用于NR活性的測定。

1.2 處理因素及設(shè)計(jì)

參考《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[15]離體法測定植物葉片NR活性的方法，針對不同的研磨方法、NADH（Nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen）用量、溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間、顯色時(shí)間設(shè)置不同的處理，每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)，并設(shè)空白對照。用Tecan M200型全波長酶標(biāo)儀測定硝酸還原酶活性。

1.2.1 研磨方法對NR活性的影響 參考文獻(xiàn)[15]給出的研磨方法是把植物葉片放在研缽里面，加入少量石英砂和緩沖液后手動(dòng)研磨。作者在采用此方法測定NR活性的時(shí)候發(fā)現(xiàn)該方法研磨速度較慢，大批量測定時(shí)影響試驗(yàn)效率。因此，為了提高研磨速度，設(shè)置了一個(gè)液氮研磨的處理，旨在探討不同研磨方法是否對NR活性測定有所影響。endprint

1.2.2 NADH用量對NR活性的影響 在標(biāo)準(zhǔn)方法加入0.30 mL NADH的基礎(chǔ)上，另外設(shè)置了0.45、0.15、0.10 mL幾個(gè)梯度，目的在于了解NADH用量對NR活性測定的影響。

1.2.3 pH對NR活性的影響 酶的活性不僅受到溫度的影響，還受到其他因素的影響，pH就是其中的1個(gè)重要因素，本試驗(yàn)設(shè)置了7.0、7.5、8.0 3個(gè)pH梯度，以確定玉米NR還原反應(yīng)的最適pH。

1.2.4 反應(yīng)溫度對NR活性的影響 反應(yīng)溫度是最重要的影響因素，本試驗(yàn)設(shè)置了20、25、30、35、40 ℃ 5個(gè)酶活反應(yīng)溫度梯度，目的在于確定玉米NR還原反應(yīng)的最適溫度。

1.2.5 反應(yīng)時(shí)間對NR活性的影響 在標(biāo)準(zhǔn)方法給出的反應(yīng)時(shí)間30 min基礎(chǔ)上，另外設(shè)置了40、20、10、5 min的反應(yīng)時(shí)間，目的在于確定縮短反應(yīng)時(shí)間是否會(huì)影響玉米NR活性的測定。

1.2.6 顯色時(shí)間對NR活性的影響 在標(biāo)準(zhǔn)方法給出的顯色時(shí)間15 min基礎(chǔ)上，另外設(shè)置了5、10、20、25 min 4個(gè)酶活顯色時(shí)間梯度，目的在于確定最佳的顯色時(shí)間。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 NR活性測定采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中檢出NO2-含量（μg/mL），以每小時(shí)每克鮮重產(chǎn)生NO2-的量表示酶活性，計(jì)算方法：

式中，C0和C1分別為試驗(yàn)初始和試驗(yàn)過程中根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求的得NO2-量；Vt為反應(yīng)液總體積；Vs為測定時(shí)取樣體積；FW為鮮重；t為反應(yīng)時(shí)間。

用Microsoft Excel 2003和SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 研磨方法對NR活性的影響

選用了液氮研磨法和石英砂研磨法2種方法，結(jié)果如圖1所示。盡管采用液氮研磨法速度較快，可以提高試驗(yàn)效率，但是測得的NR活性比石英砂法顯著降低。因此，為了保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，采用石英砂研磨法。

2.2 還原劑NADH量對NR活性的影響

不同的樣品，其NR活性不同，對于不同的樣品質(zhì)量，NR的活性也是不同的[13]，因此所需NADH的量也各不相同。本試驗(yàn)采用了4個(gè)不同的NADH用量，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，0.45、0.15 mL NADH與0.30 mL用量的NR活性無顯著差異，0.10 mL NADH與0.30 mL NADH處理間差異顯著，說明將NADH用量減少到0.15 mL對試驗(yàn)結(jié)果無顯著影響，同時(shí)增加其用量對試驗(yàn)也無影響，為節(jié)約成本，可將NADH的用量減少到0.15 mL。

2.3 不同pH對NR活性的影響

pH是影響酶活性的重要因素之一，只有在特定的pH條件下，酶才能夠表現(xiàn)出最大的活性。過酸或過堿不僅會(huì)降低酶的活性，有時(shí)甚至?xí)姑傅幕钚詥适?。由圖3可知， pH 7.5時(shí)NR的活性最大，說明其最適pH為7.5，且與pH為7.0、8.0相比，差異達(dá)到顯著水平。

2.4 不同溫度對玉米NR活性的影響

在一定條件下，每種酶都有其最適反應(yīng)溫度，低于或高于其最適反應(yīng)溫度都會(huì)降低酶的活性。同時(shí)，對于相同的酶，不同的植物可能其最適反應(yīng)溫度也有不同。《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[15]給定的溫度是25 ℃，但在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以及有試驗(yàn)證明該酶的最適溫度為30 ℃[16，17]。因此，本試驗(yàn)設(shè)置了20、25、30、35、40 ℃的溫度梯度，結(jié)果（圖4）表明，溫度在35 ℃時(shí)NR的活性最大，而且與其他溫度差異顯著，表明35 ℃為玉米NR的最適反應(yīng)溫度。

2.5 不同反應(yīng)時(shí)間對NR活性的影響

從圖5可以看出，反應(yīng)時(shí)間為20、10 min時(shí)測得NR的活性與30 min時(shí)測得的酶活性無顯著差異，反應(yīng)時(shí)間為5、40 min時(shí)測得的NR活性與30 min測得的NR活性差異顯著。因此為了快速準(zhǔn)確地測定酶的活性，10 min是較好的反應(yīng)時(shí)間。

2.6 不同顯色時(shí)間對NR活性的影響

由圖6可知，5 min的顯色時(shí)間與其他4個(gè)時(shí)間測定的NR活性差異顯著，而其他4個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定的NR活性差異不顯著。因此為了節(jié)約時(shí)間，提高測定效率，可以把顯色時(shí)間縮短至10 min。

3 討論

3.1 硝酸還原酶測定中較佳的研磨方法是石英砂研磨法

本試驗(yàn)結(jié)果表明，石英砂研磨法比液氮研磨法對NR活性的測定更為合適，原因可能是液氮的超低溫對葉片中的NR活性產(chǎn)生影響。在超低溫下，酶的活性可能會(huì)徹底喪失，或酶在超低溫下活性降低后難以恢復(fù)，從而影響酶活性的測定。與液氮研磨法相比，石英砂研磨法的溫度適中，酶活性損失較少。因此對于硝酸還原酶活性的測定，石英砂研磨法是較好的選擇。

3.2 適當(dāng)降低NADH用量對硝酸還原酶的測定結(jié)果沒有影響

NADH作為生物體中提供還原力的一種物質(zhì)，對植物的生命活動(dòng)影響重大，是必不可少的。在NR的測定過程中，NADH的用量對酶活性的測定也具有影響。因此，本試驗(yàn)針對其用量進(jìn)行了探討。本試驗(yàn)結(jié)果表明，NADH的用量由0.30 mL增加至0.45 mL，對結(jié)果無影響，減少其用量至0.15 mL時(shí)，對酶活性的測定影響較小，但當(dāng)加入量為0.10 mL時(shí)，測得的酶活性顯著降低。原因可能是在一定的提取液中，對酶的提取量是一定的。對于玉米穗位葉NR活性的測定，0.15 mL的NADH是足夠的，因此增加NADH加入量對酶活性的測定沒有顯著差異；但當(dāng)?shù)陀?.15 mL時(shí)，由于還原力不夠，酶活性顯著降低。因此，為節(jié)省成本，可以在不影響試驗(yàn)結(jié)果的同時(shí)適當(dāng)減少NADH用量。

3.3 硝酸還原酶活性測定最適溫度為35 ℃，最適pH為7.5

試驗(yàn)結(jié)果表明，玉米NR活性測定的最適還原溫度是35 ℃，低于或高于這個(gè)溫度都不能很好地測定NR的活性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)與Averina等[18]、王學(xué)穎等[19]、劉潔等[20]、齊艷玲等[21]等的研究結(jié)果并不一致，與周樹等[13]研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)镹R作為一種酶，除了受遺傳因素的決定以外，還受到多種環(huán)境因素的影響，如光、無機(jī)鹽、水分和外源激素等環(huán)境因素的影響；此外，試驗(yàn)場地、季節(jié)、測定品種等也可能影響其結(jié)果。在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)NR對溫度特別敏感，在測定該酶活性時(shí)要特別注意溫度的調(diào)控，盡量使酶處于這個(gè)溫度。同時(shí)酶活力受環(huán)境pH的影響，在一定的pH下，酶表現(xiàn)出最大活力，高于或低于此pH，酶活力降低。pH影響酶活力的原因可能是過酸或過堿可以使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，從而影響了酶活性部位的構(gòu)象，進(jìn)而影響酶的活性。因此對其進(jìn)行探討，得出該酶的最適反應(yīng)pH為7.5，與齊艷玲等[21]、王學(xué)穎等[19]的結(jié)論一致，說明中性偏堿性條件有利于玉米葉片NR活性的測定。endprint

3.4 適當(dāng)降低顯色時(shí)間和反應(yīng)時(shí)間對硝酸還原酶的測定沒有影響

在酶活性測定過程中，顯色時(shí)間和反應(yīng)時(shí)間對酶活性的測定也具有一定的影響。顯色時(shí)間過短，亞硝酸鹽與磺胺及萘胺的反應(yīng)不能充分進(jìn)行，得出的酶活性偏低；顯色時(shí)間過長，則浪費(fèi)了許多時(shí)間，試驗(yàn)效率低。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)時(shí)間的長短也會(huì)對酶活性的測定產(chǎn)生影響，反應(yīng)時(shí)間過短，反應(yīng)不能充分進(jìn)行，測得的酶活性低；反應(yīng)時(shí)間過長，也會(huì)使測得的酶活性降低。因此在本次試驗(yàn)中，對反應(yīng)時(shí)間和顯色時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)。試驗(yàn)中共設(shè)了5個(gè)顯色時(shí)間梯度進(jìn)行研究探討，結(jié)果表明，將顯色時(shí)間降低到10 min對NR活性的測定結(jié)果無顯著影響；但當(dāng)顯色時(shí)間降低到5 min時(shí)，酶活性顯著降低，其原因可能是時(shí)間太短，反應(yīng)還未充分進(jìn)行，說明亞硝酸鹽與磺胺及萘胺的反應(yīng)可能在5～10 min已反應(yīng)完全，之后反應(yīng)液的顏色不會(huì)發(fā)生顯著變化，即反應(yīng)液的吸光度也沒有顯著變化。因此，為了節(jié)省時(shí)間，可以將顯色時(shí)間縮短到10 min。同時(shí)對反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)縮短至20 min和10 min時(shí)對酶活性的測定結(jié)果沒有影響，與Férrario-Mery等[22]的反應(yīng)時(shí)間一致；但當(dāng)將反應(yīng)時(shí)間提高到40 min時(shí)，測定結(jié)果顯著降低，說明30 min酶活反應(yīng)已經(jīng)完全結(jié)束，再延長時(shí)間已無意義，只會(huì)降低測定的結(jié)果。因此，為了提高試驗(yàn)效率，可以把反應(yīng)時(shí)間縮短至10 min。

4 結(jié)論

分別對硝酸還原酶活性測定過程中幾個(gè)重要因素設(shè)置不同處理，篩選出快速、準(zhǔn)確、又節(jié)約成本的玉米葉片硝酸還原酶測定的最佳試驗(yàn)條件為用石英砂研磨，加入0.15 mL NADH，在35 ℃、pH 7.5的條件下反應(yīng)10 min，顯色10 min。該方法不僅能快速準(zhǔn)確地測定玉米硝酸還原酶活性，而且可以節(jié)約時(shí)間和成本。

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