新疆莎車1號(hào)扁桃仁2S-清蛋白的純化及特性研究

李述剛，陸健康*，王 萍，馬美湖*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，菲利普斯親水膠體研究中心，湖北 武漢 430068；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

新疆莎車1號(hào)扁桃仁2S-清蛋白的純化及特性研究

李述剛1，陸健康2,*，王 萍2，馬美湖3,*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，菲利普斯親水膠體研究中心，湖北 武漢 430068；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

清蛋白是扁桃種仁中主要蛋白質(zhì)，為揭示扁桃仁主要蛋白質(zhì)組成及結(jié)構(gòu)特性，以新疆莎車1號(hào)（SC-1）扁桃仁為研究對(duì)象，對(duì)其種仁中2S-清蛋白進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)特性研究，即經(jīng)有機(jī)溶劑多次沉淀提取，獲得扁桃仁清蛋白的粗提物，再經(jīng)Q Sepharose FF分離純化，獲得扁桃仁2S-清蛋白。經(jīng)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析表明，純化后的扁桃仁2S-清蛋白準(zhǔn)確分子質(zhì)量為31.40 kD，其在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果中顯示為18.0 kD和19.5 kD 2 個(gè)條帶，表明其由兩個(gè)不同的亞基通過(guò)二硫鍵結(jié)合而成。扁桃仁2S-清蛋白中谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）和精氨酸（Arg）的含量最高；其二級(jí)結(jié)構(gòu)中主要為β-折疊，占65.9%；扁桃仁2S-清蛋白羰基含量為4.45 nmol/mg、活性巰基含量為39.95 μmol/g、總巰基含量為57.11 μmol/g、表面疏水性為23.45 μg；變性溫度為43.3 ℃。研究結(jié)果可為新疆扁桃仁的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

扁桃仁；2S-清蛋白；純化；結(jié)構(gòu)特性

李述剛, 陸健康, 王萍, 等. 新疆莎車1號(hào)扁桃仁2S-清蛋白的純化及特性研究[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(17): 36-41. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717007. http://www.spkx.net.cn

LI Shugang, LU Jiankang, WANG Ping, et al. Purifi cation and characteristics of 2S-albumin in shache No. 1 almond from Xinjiang[J]. Food Science, 2017, 38(17): 36-41. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717007. http://www.spkx.net.cn

扁桃（almond，Prunus dulcis）又名巴旦木和美國(guó)大杏仁，是樹堅(jiān)果品種的重要成員，全球的主產(chǎn)地為澳大利亞、美國(guó)（加州）、西班牙和中國(guó)等地，是重要經(jīng)濟(jì)作物之一[1]。扁桃在我國(guó)的種植主要集中于新疆，其種植面積近100萬(wàn) 畝，占全國(guó)總量的90%，年產(chǎn)值已突破6億元，對(duì)區(qū)域經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展起到了重要的促進(jìn)作用[2]。植物種子在形成過(guò)程中會(huì)積累大量的植物蛋白質(zhì)，這些植物種子為人類提供了相對(duì)廉價(jià)的蛋白質(zhì)來(lái)源[3]。蛋白質(zhì)在人類營(yíng)養(yǎng)中發(fā)揮著重要的作用，人類必須通過(guò)攝入足夠的蛋白質(zhì)來(lái)保證機(jī)體新陳代謝的正常進(jìn)行[4]。

扁桃仁清蛋白是扁桃仁中含量最高的蛋白質(zhì)，其中包含2S-清蛋白等諸多蛋白組分。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于扁桃清蛋白的研究較少，而國(guó)外對(duì)扁桃仁清蛋白的研究大多集中于其致敏性及抗原表位的鑒定等[5-6]。本研究以新疆地區(qū)新疆莎車1號(hào)（Shache-1，SC-1）扁桃仁脫脂粉為原料，采用鹽提以及有機(jī)溶劑沉淀法制備扁桃仁清蛋白粗提物，并進(jìn)一步通過(guò)Q Sepharose FF離子交換層析法對(duì)其進(jìn)行純化，獲得扁桃仁2S-清蛋白組分；采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatography-mass spectrum，HPLC-MS）技術(shù)、圓二色譜（circular dichroism，CD）、差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）法等對(duì)2S-清蛋白的分子特性進(jìn)行研究，以期為深入了解扁桃仁2S-清蛋白的特性及其生物學(xué)活性提供科學(xué)依據(jù)，對(duì)該類食品的加工貯藏以及新疆扁桃開(kāi)發(fā)利用和產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有參考意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SC-1扁桃仁購(gòu)于新疆南疆喀什地區(qū)的莎車縣扁桃農(nóng)場(chǎng)。

Q Sepharose Fast Flow陰離子交換層析填料、丙烯酰胺、SDS（純度98.5%）、四甲基乙二胺（純度99%）、5,5 -二硫雙（2-硝基苯甲酸）（純度98%） 美國(guó)Sigma公司；丙酮、HCl、乙醇、乙酸乙酯（均為分析純）天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；溴酚藍(lán)（指示劑級(jí)）、2,4-二硝基苯肼（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

756型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；FA/JA2004N型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；pH211C型酸度計(jì) 北京哈納科儀科技有限公司；GL-22LM型高速冷凍離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器有限公司；FD-1D-50型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；STA 449F3型TG-DSC熱分析系統(tǒng) 耐馳科學(xué)儀器商貿(mào)（上海）有限公司；ChemiDocTMXRS＋凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；TU-1900雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；715型CD儀 日本分光株式會(huì)社；L-8800全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司；UHPLC LC-30A 日本島津公司；Triple-TOF 5600＋質(zhì)譜儀 美國(guó)AB Sciex公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱取400 g成熟的扁桃仁，經(jīng)攪拌器充分磨碎，然后在高速攪拌中用丙酮處理2 次（V（丙酮）∶m（扁桃仁樣品）=10∶1），由此得到蛋白質(zhì)沉淀物；然后在室溫條件下，再用石油醚（m（濃縮物）∶V（溶劑）=10∶1）提取2 次，除去溶劑，在室溫條件下風(fēng)干，即得扁桃仁總蛋白，并在－20 ℃貯存。

1.3.2 2S-清蛋白提取

取20 g扁桃仁總蛋白提取物，用200 mL含有0.5 mmol苯甲基磺酰氟的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4）溶解，然后在磁力攪拌器中攪拌2 h（4 ℃），使其充分溶解，然后4 ℃、10 000×g離心30 min除去少量不溶物；收集上清液冷卻至0 ℃，然后添加冷甲醇，使甲醇最終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%，充分混合后13 500×g離心30 min；再次收集上清液，加入3 倍體積的丙酮，在－20 ℃處理16 h，然后離心，收集沉淀；將沉淀溶于水，4 ℃條件下用透析袋透析72 h，冷凍干燥，即得扁桃仁清蛋白粗提物[6]。

1.3.3 Q Sepharose FF離子交換層析

采用Q Sepharose FF作為固定相，純化的色譜條件為：先用平衡緩沖液（0.025 mol/L pH 7.5的Tris-HCl溶液）進(jìn)行洗脫，洗脫體積為120 mL；再用初始濃度0 mol/L、最高濃度0.5 mol/L氯化鈉的0.025 mol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫，洗脫液體積為600 mL；最后用2 mol/L氯化鈉、0.025mol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液洗脫，洗脫液體積為150 mL；洗脫處理溫度為25 ℃，流速為1 mL/min；采用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，6 mL/管，收集后測(cè)定每管溶液的A280nm值，繪制洗脫曲線[7]。將收集得到的蛋白溶液于4 ℃截留分子質(zhì)量為8 000 D的透析帶中透析72 h，每6 h更換1 次透析液。透析完畢后收集蛋白溶液，－20 ℃冷凍過(guò)夜后真空冷凍干燥，收集凍干粉于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 SDS-PAGE分析

制備12%分離膠、5%濃縮膠，電極緩沖液為0.05 mol/L Tris-HCl、10% SDS、0.384 mol/L甘氨酸的緩沖溶液。樣品蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL，上樣量為10 μL。樣品在濃縮膠中電壓為40 V，進(jìn)入分離膠之后將其增至100 V。電泳完畢后染色6 h，最后脫色至背景透明[8]。

1.3.5 氨基酸組成分析

準(zhǔn)確稱取一定量樣品（使樣品蛋白質(zhì)含量在10～20 mg范圍內(nèi)）于水解管中，在水解管內(nèi)加6 mol/L HCl 10～15 mL，加入新蒸蒸餾水的酚酞3～4 滴，再將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5 min，抽真空后充入高純氮?dú)?，重?fù)3 次后，在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口，將已封口的水解管置于（110±1） ℃的恒溫干燥箱內(nèi)水解22 h，打開(kāi)水解管待水解液冷卻后過(guò)濾并轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶?jī)?nèi)，用去離子水多次沖洗水解管，將洗液全部轉(zhuǎn)入容量瓶?jī)?nèi)用去離子水定容。吸取濾液1 mL于5 mL容量瓶?jī)?nèi)，用真空干燥器在49～50 ℃條件下干燥，殘留物用1～2 mL水溶解，再干燥，反復(fù)進(jìn)行2 次，最后蒸干，再加入0.02 mol/L的HCl，溶解后用氨基酸分析儀分析[9]。

1.3.6 HPLC-MS分析

色譜條件：樣品首先通過(guò)超高效液相色譜系統(tǒng)UHPLC LC-30A進(jìn)行分離；流動(dòng)相A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈溶液，色譜柱為Zorbax RRHD 300SB C3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣，再經(jīng)色譜柱分離，流速為0.3 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，柱溫70 ℃；線性梯度范圍3%～97%乙腈。

質(zhì)譜條件：液相用Triple-TOF 5600＋質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，分析時(shí)長(zhǎng)為11 min，檢測(cè)方式為正離子模式，母離子掃描范圍m/z為350～4 000。

原始數(shù)據(jù)由ProMass 2.8軟件處理，參數(shù)設(shè)定：Smooth width為7，Noise threshold為2，原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)處理后得到扁桃仁清蛋白分子質(zhì)量譜圖[10-11]。

1.3.7 CD分析

參數(shù)設(shè)定：狹縫寬度為1.0 nm，響應(yīng)時(shí)間為4 s，敏感度為標(biāo)準(zhǔn)模式，掃描范圍為190～250 nm，數(shù)據(jù)精度為0.1 nm，掃描速率為50 nm/min，掃描次數(shù)為2 次，樣品池長(zhǎng)度為0.1 cm，溫度為室溫。

空白掃描：以20 mmol/L的硼酸鹽緩沖液為空白溶液；將供試品杯用2 mol/L硝酸浸泡過(guò)夜，去離子水沖洗干凈后晾干，加入20 mmol/L硼酸鹽緩沖液350 μL，按照以上參數(shù)進(jìn)行190～250 nm的遠(yuǎn)紫外掃描并采集數(shù)據(jù)，作為空白參考。

樣品測(cè)試：供試品杯清洗晾干，分別加入用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液和質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的蛋白溶液溶解，按上述參數(shù)進(jìn)行190～250 nm的遠(yuǎn)紫外掃描并采集數(shù)據(jù)。

對(duì)掃描后的所有圖譜用軟件Jwstda 32進(jìn)行Smoothing處理，然后采用Protein SSE軟件對(duì)扁桃仁清蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行擬合計(jì)算，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線采用軟件自帶的標(biāo)準(zhǔn)α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲曲線[12]。

1.3.8 羰基含量測(cè)定

參考吳大偉等[13]測(cè)定羰基含量的方法。在1.5 mL的離心管中分別加入0.2 mL蛋白質(zhì)溶液和0.5 mL的含有10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼的2 mol/L HCl溶液，混合均勻后于20 ℃條件下水浴2 h；另取0.2 mL蛋白質(zhì)溶液和0.5 mL不含有2,4-二硝基苯肼的2 mol/L HCl溶液混合，在20 ℃條件下水浴2 h，作為空白對(duì)照；然后分別往各離心管中加0.5 mL 40%的三氯乙酸，劇烈振蕩，搖勻后靜置20 min，10 000 r/min離心10 min后棄上清液，并用1 mL的乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液洗滌沉淀3 次；將洗滌后的蛋白質(zhì)沉淀懸浮于0.6 mol/L鹽酸胍溶液中，在37 ℃條件下水浴30 min，測(cè)定A370nm，以不加2,4-二硝基苯肼試劑時(shí)的樣品為對(duì)照，計(jì)算每毫克蛋白質(zhì)的羰基物質(zhì)的量，其計(jì)算公式見(jiàn)式（1）。

式中：DF為樣品稀釋系數(shù)；ε為摩爾消光系數(shù)22 000 L/（mol?cm）。

1.3.9 表面疏水性的測(cè)定

將樣品溶于20 mmol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，使蛋白質(zhì)量濃度為5 mg/mL。取1 mL蛋白溶液，加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)，以無(wú)蛋白的磷酸鹽溶液為對(duì)照。6 000×g離心15 min，取上清液稀釋10 倍，測(cè)定其表面疏水性用溴酚藍(lán)結(jié)合量表示，其計(jì)算公式見(jiàn)式（2）。

1.3.10 巰基含量測(cè)定

蛋白質(zhì)活性巰基含量的測(cè)定參考許晶等[15]改進(jìn)的Ellman試劑法，并做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。取2 mL蛋白溶液，加入5 mL Tris-甘氨酸緩沖液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、4 mmol/L Na2?EDTA，pH 8.0）中，再加入4 mg/mL 5,5 -二硫雙（2-硝基苯甲酸）的Ellman試劑0.1 mL，漩渦混勻后于25 ℃條件下反應(yīng)15 min，測(cè)定其A412nm，以不加Ellman試劑的溶液作為對(duì)照，每組樣品測(cè)定3 次取平均值。

總巰基含量的測(cè)定：取2 mL蛋白溶液，加入5 mL Tris-甘氨酸-8 mol/L Urea-0.5% SDS溶液中，再加入4 mg/mL 5,5 -二硫雙（2-硝基苯甲酸）的Ellman試劑0.1 mL，漩渦混勻后于25 ℃條件下反應(yīng)15 min，測(cè)定其A412nm，以不加Ellman試劑的溶液作為對(duì)照，每組樣品測(cè)定3 次取平均值。二硫鍵含量為總巰基含量與活性巰基含量差值的1/2。總巰基含量計(jì)算公式見(jiàn)式（3）。

式中：DF為樣品稀釋系數(shù)；ρ為樣品的蛋白質(zhì)最終質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.11 熱性質(zhì)分析

采用DSC測(cè)定扁桃分離蛋白的熱變性溫度。將8 mg左右樣品置于氧化鋁坩堝中并蓋好坩堝蓋，以空氧化鋁坩堝作為參比，氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣，溫度掃描范圍為15～100 ℃，掃描速率為5 ℃/min[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 扁桃仁清蛋白的提取和純化

圖 1 扁桃仁清蛋白粗提物SDS-PAGE電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE pattern of crude albumin extract

經(jīng)多步有機(jī)溶劑沉淀提取，獲得扁桃仁清蛋白的粗提物，為考察提取效果，對(duì)粗提物進(jìn)行了SDS-PAGE分析。由圖1可知，樣品在凝膠上的條帶清晰可見(jiàn)，扁桃仁清蛋白粗提物在凝膠上共顯示為7 個(gè)主要的條帶，分子質(zhì)量介于8～75 kD之間，依次為8、9、10、12、18.5、20 kD和63 kD，其中9、18.5 kD和20 kD 3 個(gè)條帶灰度值較高，說(shuō)明這3 個(gè)條帶的組分含量高。文獻(xiàn)報(bào)道扁桃仁清蛋白主要包含3 個(gè)組分[17]，其分子質(zhì)量與含量較高的3 個(gè)條帶一一對(duì)應(yīng)，表明粗提效果較好。

2.2 陰離子交換層析純化扁桃仁2S-清蛋白圖譜及SDS-PAGE分析

Q Sepharose FF是一種流速特性好的強(qiáng)陰離子交換劑，具有適用性強(qiáng)、分離效果好等優(yōu)點(diǎn)[18]。實(shí)驗(yàn)采用Q Sepharose FF離子交換色譜純化扁桃仁2S-清蛋白，上樣質(zhì)量濃度為25 mg/mL，上樣量為5 mL，結(jié)果如圖2所示。

圖 2 扁桃仁清蛋白陰離子交換層析Fig. 2 Ion exchange chromatography of crude albumin extract

由圖2可知，扁桃仁清蛋白粗提物經(jīng)層析后分離為4 個(gè)主要的洗脫峰，其中洗脫峰4吸光度最高，收集峰4組分進(jìn)行后續(xù)分析，該組分即為2S-清蛋白。

圖 3 扁桃仁清蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig. 3 SDS-PAGE pattern of 2S-albumin

將收集的洗脫峰4經(jīng)透析脫鹽凍干后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。由圖3可知，經(jīng)離子交換層析純化后，2S-清蛋白在電泳上僅顯示為18.0 kD和19.5 kD兩個(gè)條帶，表明其他扁桃仁蛋白質(zhì)已被去除，已經(jīng)得到純度較高的扁桃仁2S-清蛋白樣品。

2.3 扁桃仁2S-清蛋白分子質(zhì)量

采用高分辨的質(zhì)譜對(duì)扁桃仁2S-清蛋白的分子質(zhì)量進(jìn)行分析。純化的扁桃仁2S-清蛋白樣品，經(jīng)HPLC分離后進(jìn)行MS分析，通過(guò)在質(zhì)譜中的離子峰測(cè)定扁桃仁清蛋白的分子質(zhì)量，結(jié)果如圖4所示。

圖 4 扁桃仁2S-清蛋白的HPLC-MS圖譜Fig. 4 HPLC-MS profi le of 2S-albumin

由圖4可知，扁桃仁2S-清蛋白在質(zhì)譜中表現(xiàn)為多個(gè)離子峰，分布范圍主要在20～50 kD之間，其中，信號(hào)強(qiáng)度最高的質(zhì)譜峰在31 398 D處，表明扁桃仁2S-清蛋白的分子質(zhì)量為31.40 kD。質(zhì)譜分析測(cè)定的準(zhǔn)確分子質(zhì)量與圖3中的結(jié)果有些差異。這可能是由于扁桃仁2S-清蛋白為多亞基蛋白，在SDS-PAGE分析中，由于還原劑、變性劑和加熱處理等，使其亞基分離，因此顯示為兩個(gè)分子質(zhì)量較小的條帶；而質(zhì)譜分析中，處理?xiàng)l件較為溫和，亞基未分離，測(cè)定的為整個(gè)分子的總體分子質(zhì)量，因此，兩種測(cè)定方法的結(jié)果并不一致。

2.4 扁桃仁2S-清蛋白氨基酸組成分析

采用HPLC測(cè)定純化得到的扁桃仁清蛋白氨基酸組成，共計(jì)測(cè)定16 種氨基酸，結(jié)果如表1所示。

表 1 扁桃仁2S-清蛋白的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of 2S-albumin

由表1可知，扁桃仁2S-清蛋白含所測(cè)定全部16 種氨基酸。扁桃仁清蛋白酸性氨基酸含量相對(duì)較多，其谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）含量分別達(dá)14.49%和10.05%，該結(jié)果表明扁桃仁2S-清蛋白等電點(diǎn)較低；此外，這些酸性氨基酸使扁桃仁2S-清蛋白含有較強(qiáng)的離子鍵等非共價(jià)作用力，在該蛋白提取時(shí)采用一定離子強(qiáng)度的弱堿性緩沖液可以更好地促進(jìn)該蛋白的溶出。扁桃仁2S-清蛋白中含有較多的親水性氨基酸，這些親水性氨基酸賦予該蛋白良好的水溶性[19]。從氨基酸評(píng)分角度分析，扁桃仁2S-清蛋白第一限制性氨基酸為甲硫氨酸，第二限制性氨基酸為賴氨酸，除該兩種氨基酸外，其余必需氨基酸含量均能滿足聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織（Food and Agriculture Organization of the United/ World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）成人推薦標(biāo)準(zhǔn)；扁桃仁2S-清蛋白中精氨酸含量高且氨基酸組成全面，可能具有很高的生物學(xué)價(jià)值，可作為特殊食品中氨基酸膳食補(bǔ)充劑。

2.5 扁桃仁2S-清蛋白CD分析

對(duì)扁桃仁2S-清蛋白進(jìn)行CD分析，結(jié)果如圖5所示，扁桃仁清蛋白在195～198 nm波長(zhǎng)處有一強(qiáng)的正吸收峰，在205～240 nm范圍內(nèi)為一個(gè)較寬的負(fù)吸收峰，α-螺旋結(jié)構(gòu)的“雙負(fù)”吸收峰不明顯，說(shuō)明扁桃仁蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋比例較少，以β-折疊結(jié)構(gòu)為主。采用Protein SSE軟件對(duì)圖譜和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行擬合計(jì)算，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線采用軟件自帶的標(biāo)準(zhǔn)α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲曲線[20]。計(jì)算結(jié)果顯示，扁桃仁2S-清蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量為：α-螺旋9.7%、β-折疊65.9%、β-轉(zhuǎn)角4.5%、無(wú)規(guī)卷曲19.9%。在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊和α-螺旋是較為有序的結(jié)構(gòu)[21]，通常而言含量越高，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，變性溫度就越高。而扁桃仁2S-清蛋白雖然含有大量的β-折疊，但是變性溫度仍較低，其可能原因是β-折疊和α-螺旋不是影響扁桃2S-清蛋白變性溫度的主要因素，而二硫鍵較少等其他原因可能是主要因素。

圖 5 扁桃仁2S-清蛋白的CD圖Fig. 5 Circular dichroism spectrum of 2S-albumin

2.6 扁桃仁2S-清蛋白的表面活性基團(tuán)

蛋白質(zhì)表面活性基團(tuán)對(duì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)具有重要影響，其中最重要的為巰基、羰基以及表面的疏水性基團(tuán)。對(duì)扁桃仁2S-清蛋白的表面活性基團(tuán)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如表2所示。

表 2 扁桃仁2S-清蛋白的表面活性基團(tuán)Table 2 Functional group contents of 2S-albumin

蛋白質(zhì)羰基含量表征了蛋白質(zhì)氧化的程度，吳偉等[22]研究丙二醛氧化對(duì)大米蛋白功能性質(zhì)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，丙二醛濃度為0 nmol/L時(shí)大米蛋白羰基含量為3.91 nmol/mg，而扁桃仁2S-清蛋白的羰基含量為4.45 nmol/mg，表明扁桃仁2S-清蛋白氧化程度較小。巰基和二硫鍵是維系蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的重要化學(xué)鍵[23]，這些化學(xué)鍵的斷裂或者重新鍵合，將導(dǎo)致蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，最終會(huì)對(duì)蛋白的活性和功能造成影響。扁桃仁2S-清蛋白的總巰基含量為57.11 μmol/g，活性巰基含量為39.95 μmol/g，二硫鍵含量為8.58 μmol/g，與扁桃仁清蛋白[24]相比，扁桃仁2S-清蛋白的總巰基和活性巰基含量都較低，二硫鍵亦較前者低，這可能是扁桃仁2S-清蛋白較扁桃仁清蛋白變性溫度低的原因。表面疏水性對(duì)蛋白質(zhì)的乳化性和起泡性具有重要影響，扁桃仁2S-清蛋白的表面疏水性為23.45 μg，表明該蛋白表面存在一定的疏水性氨基酸，這些疏水性氨基酸的暴露，可以使扁桃仁2S-清蛋白蛋白具有更好的兩親特性，造成蛋白質(zhì)乳化性的增加[25]。

2.7 扁桃仁2S-清蛋白熱性質(zhì)分析

圖 6 扁桃仁2S-清蛋白DSC曲線Fig. 6 DSC curve of 2S-albumin

扁桃仁2S-清蛋白的DSC曲線如圖6所示。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，扁桃仁2S-清蛋白的變性起始溫度為28.4 ℃，變性終止溫度為57.6 ℃，峰值為43.3 ℃。與扁桃仁分離蛋白相比[26]，扁桃仁2S-清蛋白的變性溫度較低，變性溫度范圍較窄，表明扁桃仁2S-清蛋白純度較高，分子一致性較高。扁桃仁2S-清蛋白變性溫度較花生2S蛋白變性溫度低，其可能的原因是扁桃仁2S-清蛋白中可形成二硫鍵的Met和Cys等硫氨基酸較少的緣故[27]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以有機(jī)溶劑多次沉淀法制備扁桃仁清蛋白粗提物，經(jīng)SDS-PAGE分析，該粗提物分子質(zhì)量介于8～75 kD之間，其中9、18.5 kD和20 kD 3 個(gè)條帶的組分含量高；經(jīng)Q Sepharose FF分離純化得到扁桃仁2S-清蛋白，經(jīng)HPLC-MS分析該蛋白準(zhǔn)確分子質(zhì)量為31.40 kD，在SDS-PAGE凝膠上呈現(xiàn)出18.0 kD和19.5 kD兩個(gè)條帶；扁桃仁2S-清蛋白含所測(cè)定全部16 種氨基酸，其第一限制性氨基酸為甲硫氨酸，除該甲硫氨酸和賴氨酸外，其余必需氨基酸含量均能滿足FAO/WHO成人推薦標(biāo)準(zhǔn)；在CD圖上，扁桃仁2S-清蛋白在195～198 nm波長(zhǎng)處有一強(qiáng)的正吸收峰，在205～240 nm范圍內(nèi)為一個(gè)較寬的負(fù)吸收峰，α-螺旋結(jié)構(gòu)的“雙負(fù)”吸收峰不明顯，表明其二級(jí)結(jié)構(gòu)以β-折疊結(jié)構(gòu)為主，含量為65.9%；扁桃仁2S-清蛋白干粉DSC曲線出現(xiàn)一個(gè)峰，對(duì)應(yīng)的變性峰值溫度為43.3 ℃；扁桃仁2S-清蛋白羰基含量為4.45 nmol/mg、總巰基含量為57.11 μmol/g，活性巰基含量為39.95 μmol/g、二硫鍵含量為8.58 μmol/g、表面疏水性為23.45 μg。這些數(shù)據(jù)可為深入研究新疆扁桃仁蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)特性及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

[1] MARTí A F I, FORCADA C F I, KAMALI K, et al. Molecular analyses of evolution and population structure in a worldwide almond [Prunus dulcis(Mill.) D.A. Webb syn. P. amygdalus Batsch] pool assessed by microsatellite markers[J]. Genetic Resources and Crop Evolution, 2015, 62(2): 205-219. DOI:10.1007/s10722-014-0146-x.

[2] 韓宏偉, 王建友, 李勇, 等. 引種國(guó)外巴旦木品種篩選研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 51(10): 1830-1839. DOI:10.6048/j.issn.1001-4330.2014.10.012.

[3] SACK M, HOFBAUER A, FISCHER R, et al. The increasing value of plant-made proteins[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2015, 32: 163-170. DOI:10.1016/j.copbio.2014.12.008.

[4] 陳貴堂, 趙霖. 植物蛋白的營(yíng)養(yǎng)生理功能及開(kāi)發(fā)利用[J]. 食品工業(yè)科技, 2004(9): 137-140. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2004.09.041.

[5] GARINO C, DE PAOLIS A, CO?SSON J D, et al. Pru du 2S albumin or Pru du vicilin?[J]. Computational Biology and Chemistry, 2015, 56: 30-32. DOI:10.1016/j.compbiolchem.2015.03.004.

[6] POLTRONIERI P, CAPPELLO M S, DOHMAE N, et al. Identifi cation and characterisation of the IgE-binding proteins 2S albumin and conglutin γ in almond (Prunus dulcis) seeds[J]. International Archives of Allergy and Immunology, 2002, 128(2): 97-104.

[7] GENG F, HUANG X, YAN N, et al. Purification of hen egg white ovomacroglobulin using one-step chromatography[J]. Journal of Separation Science, 2013, 36(23): 3717-3722. DOI:10.1002/ jssc.201300425.

[8] FANG G, HUANG Q, WU X F, et al. Co-purifi cation of chicken egg white proteins using polyethylene glycol precipitation and anionexchange chromatography[J]. Separation and Purifi cation Technology, 2012, 96(33): 75-80. DOI:10.1016/j.seppur.2012.05.021.

[9] 齊建雙, 鐵雙貴, 韓小花, 等. 氨基酸分析儀法快速測(cè)定玉米籽粒中賴氨酸含量[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2014, 30(30): 199-202.

[10] GENG F, HUANG X, MAJUMDER K, et al. Mass spectrometry and two-dimensional electrophoresis to characterize the glycosylation of hen egg white ovomacroglobulin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(37): 8209-8215. DOI:10.1021/acs.jafc.5b02618.

[11] ANDREWS G L, SIMONS B L, YOUNG J B, et al. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (Triple TOF 5600)[J]. Analytical Chemistry, 2011, 83(13): 5442-5446. DOI:10.1021/ac200812d.

[12] 王晶. 雞蛋貯藏期間三種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的變化研究[D].武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014: 20.

[13] 吳大偉, 陳星, 洑琴, 等. 常溫儲(chǔ)存和干熱處理對(duì)豆粕蛋白質(zhì)氧化的影響[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2014, 29(5): 90-94.

[14] ALIZADEHPASDAR N, LICHAN E C Y. Comparison of protein surface hydrophobicity measured at various pH values using three different fluorescent probes[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48(2): 328-334. DOI:10.1021/jf990393p.

[15] 許晶, 齊寶坤, 趙青山, 等. 大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)特性與表面疏水性的關(guān)系[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2015, 30(8): 32-36; 41.

[16] 吳海波, 齊寶坤, 江連洲, 等. 大豆分離蛋白熱性質(zhì)及其空間構(gòu)象對(duì)表面疏水性的影響[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2014, 29(10): 42-46.

[17] YUSUF A A. Physico-chemical properties of almond seed protein concentrate[J]. Italian Journal of Food Science, 2003, 15(4): 531-539.

[18] LIANG J, FIEG G, JAKOBTORWEIHEN S. Ion-exchange adsorption of proteins: experiments and molecular dynamics simulations[J]. Chemie Ingenieur Technik, 2015, 87(7): 903-909. DOI:10.1002/ cite.201400095.

[19] 蔡聯(lián)輝, 曾虹燕, 王亞舉, 等. 蓮子蛋白質(zhì)的氨基酸組成及其營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)[J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2010, 32(5): 503-506. DOI:10.13325/j.cnki.acta.nutr. sin.2010.05.013.

[20] 沈星燦, 梁宏, 何錫文, 等. 圓二色光譜分析蛋白質(zhì)構(gòu)象的方法及研究進(jìn)展[J]. 分析化學(xué), 2004, 32(3): 388-394.

[21] 黎衛(wèi). 芡實(shí)蛋白組分的結(jié)構(gòu)表征及其理化性質(zhì)研究[D]. 無(wú)錫: 江南大學(xué), 2015: 29.

[22] 吳偉, 蔡勇建, 吳曉娟, 等. 丙二醛氧化對(duì)大米蛋白功能性質(zhì)的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(18): 113-116; 122. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2015.18.014.

[23] HOGG P J. Disulfi de bonds as switches for protein function[J]. Trends in Biochemical Sciences, 2003, 28(4): 210-214. DOI:10.1016/S0968-0004(03)00057-4.

[24] 王東爽, 陸健康, 李述剛. 新疆莎車1號(hào)扁桃仁4種蛋白組分功能特性研究[J]. 食品科技, 2016, 41(2): 74-79. DOI:10.13684/j.cnki. spkj.2016.02.014.

[25] GANG Y, ZHENG L, JIN Z, et al. Impacts of the surface charge property on protein adsorption on hydroxyapatite[J]. Chemical Engineering Journal, 2002, 87(2): 181-186.

[26] 李述剛, 陸健康, 王萍, 等. 不同脫脂處理對(duì)新疆莎車1號(hào)扁桃仁蛋白功能特性的影響[J]. 中國(guó)油脂, 2015, 40(6): 24-28. DOI:1003-7969( 2015) 06-0024-05.

[27] 楊曉泉, 張水華, 黎茵, 等. 花生2S蛋白的提取分離及部分性質(zhì)研究[J].華南理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 1998(4): 1-5.

Purifi cation and Characteristics of 2S-Albumin in Shache No. 1 Almond from Xinjiang

LI Shugang1, LU Jiankang2,*, WANG Ping2, MA Meihu3,*
(1. Glyn O. Phillips Hydrocolloid Research Center, Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation, School of Biological Engineering and Food, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China; 2. Production & Construction Group Key Laboratory of Special Agricultural Products Further Processing in Southern Xinjiang, College of Life Sciences, Tarim University, Alar 843300, China；3. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Albumin is the major protein in almond. In this experiment, we purifi ed and structurally characterized 2S-albumin from Shache No.1 almond (SC-1) from Xinjiang. Crude albumin extract was obtained from almond by repeated precipitation with organic solvents and then fractionated chromatographically on Q Sepharose FF to obtain 2S-albumin. By HPLC-MS analysis, the accurate molecular mass of 2S-albumin was determined to be 31.40 kD, which was separated into two bands (18.0 and 19.5 kD) in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), indicating that it was composed of two distinct subunits connected through disulfide bonds. In 2S-albumin, the contents of glutamic acid, aspartic acid and arginine residues were relatively high, and its dominant secondary structure was β-sheet (65.9%). The carbonyl group content of 2S-albumin was 4.45 nmol/mg, the active thiol group content was 39.95 μmol/g, the total thiol group content was 57.11 μmol/g, the surface hydrophobicity was 23.45 μg, and the denaturation temperature was 43.3 ℃. These results can provide a theoretical support for the development and utilization of Xinjiang grown almond.

almond; 2S-albumin; purifi cation; structure characteristics

10.7506/spkx1002-6630-201717007

TS255.1

A

1002-6630（2017）17-0036-06引文格式：

2017-02-14

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31401644）；兵團(tuán)中青年創(chuàng)新領(lǐng)軍人才項(xiàng)目（2016BC001）

李述剛（1979—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称返鞍踪|(zhì)化學(xué)與應(yīng)用。E-mail：lishugang2010@163.com *通信作者：陸健康（1983—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工。E-mail：lujiankang301@163.com馬美湖（1957—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称返鞍踪|(zhì)化學(xué)。E-mail：mameihuhn@163.com