成都市區(qū)污染空氣中PM2.5對大鼠學習記憶能力的影響*

張霄龍 任杰 王正榮△ 應正祺 王霞 黃禹瑤 后望 成姝婷

(1.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院；2.四川大學華西臨床醫(yī)學院； 3.四川大學華西口腔醫(yī)學院，四川 成都 610041)

成都市區(qū)污染空氣中PM2.5對大鼠學習記憶能力的影響*

張霄龍1任杰1王正榮1△應正祺1王霞2黃禹瑤3后望1成姝婷1

(1.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院；2.四川大學華西臨床醫(yī)學院； 3.四川大學華西口腔醫(yī)學院，四川 成都 610041)

目的：研究成都地區(qū)污染空氣中PM2.5微粒對大鼠學習記憶能力的影響。方法：Morris水迷宮篩選后的雄性SD大鼠32只，隨機分為：對照組、PM2.5低劑量組、PM2.5中劑量組、PM2.5高劑量組(n=8)。用EM-2062A顆粒物采樣器采集2016年7月14日至7月30日成都市區(qū)污染嚴重區(qū)域空氣中的PM2.5微粒，制成混懸液后對大鼠進行氣管滴注染毒處理，低、中、高劑量組PM2.5混懸液分別為0.96 mg·kg-1、3.84 mg·kg-1、和15.36 mg·kg-1，3周后以水迷宮實驗對比其學習記憶能力，ELISA檢測其肺組織IL-1β的水平。結果：與對照組相比，染毒大鼠的逃避潛伏期均有所增加，且高劑量組增加最多(P<0.05)，而有效區(qū)域運動時間長度則與染毒劑量呈反比。結論：成都地區(qū)污染空氣中PM2.5微粒能夠損害大鼠的學習記憶能力，這種損害與PM2.5微粒的濃度有關。

成都；PM2.5；大鼠；學習記憶能力

空氣污染一直是危害人類健康的重要因素之一，空氣污染物中的PM2.5因其粒徑小、表面積大、活性強、易吸附有毒有害物質等而危害更甚。霧霾天氣的加劇引起了人們的研究興趣，從1999年起，國內便開始有研究霧霾的主要污染物PM2.5的相關文獻[1]，并于2011年起爆發(fā)研究熱潮。成都的空氣質量問題在近年來越來越嚴峻，其污染物與呼吸系統(tǒng)疾病的關聯(lián)也受到了廣泛的關注。從文獻中，我們可以了解到，PM2.5可以對大鼠的呼吸循環(huán)系統(tǒng)造成氧化損傷[2]。能夠刺激免疫系統(tǒng)，誘發(fā)炎癥反應[3]?？梢源偈勾笫竽?，造成小血管栓塞[4]。還可以攻擊大鼠體細胞DNA，造成核酸損傷[5]?？諝馕廴镜募觿∈欠裨谄渌矫鎸θ祟惖慕】翟斐捎绊?，這是值得我們特別關注的方面，特別是近年來中小學頻繁出現(xiàn)在PM2.5空氣質量指數(shù)較高時宣布停課的情況，那么空氣污染是否會對生物體的學習記憶能力造成影響成為了我們的關注重點。

有研究者通過流行病學調研統(tǒng)計居住在不同污染程度地區(qū)成年人的健康狀況而得出了PM2.5會影響人類的學習記憶的結論[6]。但直接的實驗研究則尚未見有報道。然而，從流行病學角度的研究存在諸多偏倚，可能出現(xiàn)個體差異大、污染物侵襲程度不一、人口遷移等諸多問題。其數(shù)據(jù)雖然直接來源于人，但可能存在較大誤差。因此，有必要在嚴格的實驗條件下進行動物實驗，驗證PM2.5對實驗動物學習記憶的影響以及產生這種影響的原因。目前已有關于PM2.5影響大鼠海馬中鉛鋁錳含量及神經遞質的研究[7]，但尚沒有關于PM2.5對大鼠學習記憶影響的報道，也沒有關于PM2.5染毒大鼠的迷宮行為學實驗。

本研究采集成都污染區(qū)域空氣中的PM2.5微粒來對大鼠進行染毒處理，通過Morris水迷宮實驗對不同染毒劑量大鼠的空間學習記憶能力進行評估，并檢測其肺組織中白介素-1β的水平，以研究染毒劑量的PM2.5是否會對大鼠肺部造成炎癥影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級雄性SD大鼠(200～220g)40只，由四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所提供。所有大鼠均自由進食和飲水，待飼養(yǎng)1 周后開始實驗。

1.2 實驗儀器與實驗試劑

EM-2062A顆粒物采樣器(國技儀器，中國)，純水機(優(yōu)普，中國)，電子天平(Sartorius，德國)，WMT-100S Morris水迷宮(成都泰盟，中國)，酶標儀(Biotek，美國)，恒溫培養(yǎng)箱、注射器及眼科剪、眼科鑷、玻璃勻漿器等均為國產。白介素-1β(IL-1β)測試盒(南京建成，中國)。

1.3 采集PM2.5微粒并制備混懸液

大氣PM2.5 微粒樣品由四川科信時代檢測技術有限公司于2016年7月14日至7月30日(共17天)在成都市武侯區(qū)科園南路9-1愛思特大廈樓頂(半徑2公里范圍內有地鐵3號線和10號線施工工地以及南三環(huán)大量汽車流通過)采集，每天采集24 h。將采集到PM2.5的玻璃纖維濾膜放入超純水中，經超聲振蕩洗脫、收集洗脫液、過濾、以及真空冷凍干燥，提取得到PM2.5微粒樣品。用電子天平秤取9.6 mg、38.4 mg、和153.6 mg的PM2.5微粒，分別溶于25 mL的生理鹽水配置成低、中、高劑量PM2.5混懸液，使其濃度分別為0.384 mg·mL-1、1.536 mg·mL-1、6.144 mg·mL-1。將三組PM2.5混懸液置于4℃冰箱保存，使用前超聲振蕩30min并高溫高壓滅菌，使混懸液無菌且PM2.5微粒均勻分散其中。

1.4 大鼠分組與PM2.5染毒造模

以Morris水迷宮實驗對所有大鼠進行篩選，將篩選后的32只大鼠隨機分為4組，每組8只，分別為對照組及PM2.5低、中、高劑量組。各組大鼠經乙醚麻醉后，采用氣管滴注法染毒。低、中、高劑量組每只大鼠分別注入劑量為0.96 mg·kg-1、3.84 mg·kg-1、15.36 mg·kg-1的PM2.5混懸液，對照組按同樣方法注入生理鹽水，每周染毒2次，共3 w。

1.5 Morris水迷宮實驗

最后1次染毒1天后開始進行Morris 水迷宮實驗以檢測各組大鼠的學習記憶能力。每只大鼠連續(xù)接受5天定位航行實驗(Place navigation)的訓練并記錄其潛伏期。訓練期間，每只大鼠分別從4 個象限的固定入水點進入水迷宮中，并以登上平臺為最終目標；若大鼠人水后60 s內未能找到平臺，則人工引導其來到平臺位置并停留10 s。第6天撤去平臺進行空間探索實驗(Spatial probe test)，將大鼠從與定位航行實驗相同的入水點放入水中，記錄其在原平臺所在象限內游泳所花的時間，即有效區(qū)域運動時間。

1.6 采集樣本和肺組織IL-1β檢測

水迷宮實驗結束后處死大鼠，取肺組織保存于-80℃低溫冰箱待測。每個樣本秤取0.5 g肺組織在玻璃勻漿器中制成勻漿。按照白介素-1β(IL-1β)測試盒(南京建成)說明書，用ELISA 的方法檢測肺組織勻漿中IL-1β的濃度。

1.7 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行處理，結果數(shù)據(jù)以-X±SD表示。對Morris水迷宮中定位航行實驗的潛伏期采用重復測量數(shù)據(jù)的多因素方差分析，組間比較采用方差分析的兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PM2.5染毒對大鼠學習記憶的影響

定位航行實驗的結果顯示，染毒大鼠的潛伏期均較對照組有所增加(P<0.05)，高劑量組潛伏期的增加明顯多于低劑量組和中劑量組(P<0.05)，但低劑量組和中劑量組潛伏期的增加差異無統(tǒng)計學意義，見圖1。

圖1 大鼠定位航行實驗的潛伏期

空間探索實驗的結果顯示，對照組大鼠的有效區(qū)域運動時間明顯高于三組染毒大鼠(P<0.05)，染毒大鼠的有效區(qū)域運動時間長度與染毒計量呈反比，即高劑量組的有效區(qū)域運動時間短于中劑量組，中劑量組的有效區(qū)域運動時間短于低劑量組，見表1。

2.2 PM2.5染毒對大鼠肺組織的影響

ELISA結果顯示，對照組大鼠肺組織內的IL-1β含量比低劑量組稍高(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學意義；而中、高劑量組大鼠肺組織的IL-1β含量比對照組明顯升高(P<0.05)，見表2。

表1 空間探索實驗中大鼠游泳的有效區(qū)域運動時間±S，n=8)

注：與對照組相比，*P<0.05。

表2 大鼠肺組織勻漿中IL-1β的水平

注：與對照組相比，*P<0.05。

3 討論

成都市區(qū)現(xiàn)階段的大氣污染源主要來自汽車尾氣和工地施工。本實驗中，PM2.5的采集地點設在成都市區(qū)內同時接近地鐵施工工地和大流量車流道路的地方，可以最大程度的模擬目前成都大氣中PM2.5的成分。從Morris水迷宮實驗的結果可知，染毒大鼠尋找平臺的空間學習記憶能力比對照組差，也就是說，成都空氣中的PM2.5確實會對大鼠的學習記憶能力造成影響，而且這種影響與PM2.5的濃度有關，濃度越高，影響越大。從圖1我們可以看到，在定位航行實驗的第5天，低劑量組和中劑量組的潛伏期較之前有明顯降低，其中低劑量組的潛伏期時間更接近于對照組，而高劑量組的潛伏期則仍然較長。這說明較低濃度PM2.5對大鼠學習記憶的損害也許是可以恢復的，但高濃度PM2.5造成的損害則不易恢復。

考慮到PM2.5直接作用于大鼠的氣管和肺，而缺氧能夠導致學習記憶的損傷[8]，因此本實驗通過檢測大鼠肺部IL-1β的水平，以判斷染毒大鼠肺部是否有炎癥。結果表明，低劑量的PM2.5混懸液滴注沒有引起大鼠肺部明顯的炎癥，但低劑量組大鼠的空間學習記憶卻也受到了損害，而中劑量和高劑量的PM2.5混懸液滴注的確引起了其肺部一定程度的炎癥，因此，我們認為，在PM2.5混懸液滴注引起的大鼠空間學習記憶能力損害中，肺部炎癥可能對具有促進作用，但它并不是一個關鍵的因素。至于其中的機制，則需要進一步研究。

1 汪安璞. 大氣氣溶膠研究新動向[J]. 環(huán)境化學, 1999, 18(01): 10-15.

2 曲紅梅,牛靜萍,魁發(fā)瑞,等. 大氣中PM_(2.5)致大鼠呼吸道急性損傷作用[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2006, 22(05): 598-599.

3 肖純凌,王任群,趙肅,等. 大氣混合污染物對大鼠呼吸系統(tǒng)氧化損傷作用[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2006, 22(08): 935-936.

4 李志梅,段爭. PM2.5急性暴露對大鼠凝血功能的影響及其機制[A]. 中華醫(yī)學會呼吸病學年會——2013第十四次全國呼吸病學學術會議論文匯編[C]. 中華醫(yī)學會、中華醫(yī)學會呼吸病學分會, 2013, 1.

5 Meng Z, Zhang Q. Damage effects of dust storm PM2.5 on DNA in alveolar macrophages and lung cells of rats [J]. Food Chem Toxicol, 2007, 45(8): 1368-1374.

6 Gatto NM, Henderson VW, Hodis HN, et al. Components of air pollution and cognitive function in middle-aged and older adults in Los Angeles [J]. Neurotoxicology, 2014, 40: 1-7.

7 陳旭鋒,李太山,徐文哲,等. PM2.5染塵大鼠海馬中鉛鋁錳含量及神經遞質的變化[J]. 環(huán)境與健康雜志, 2015, 32(01): 73-75.

8 Arteaga O, Revuelta M, Uriguen L, et al. Docosahexaenoicacid reduces cerebral damage and ameliorates long-term cognitive impairments caused by neonatal hypoxia-ischemia in rats [J]. Mol Neurobiol, 2016, [Epub ahead of print].

Effect of PM2.5 in the polluted air of Chengdu on rats′ learning and memory ability*

Zhang Xiao-long1, Ren Jie1, Wang Zheng-rong1△, Ying Zheng-qi1, Wang Xia2, Huang Yu-yao3, Hou Wang1, Cheng Shu-ting1

(1.College of Basic Medicine and Forensic Medicine, Sichuan University; 2.College of Clinic Medicine, Sichuan University; 3. College ofStomatology, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041)

Objective：To investigate the effect of PM2.5 in the air of Chengdu on rats′ spatial learning and memory ability by Morris water maze. Methods: Thirty-two male SD rats screened by Morris water maze were randomly divided into control group, PM2.5 lower dosage group, PM2.5 middle dosage group, and PM2.5 higher dosage group (n=8). The rats were exposed to PM2.5, which was collected by EM-2062A Particulates Sampler from July 14thto 30thof 2017 in Chengdu, by intratracheal instillation, and the exposing dosage was depended on rats′ mass, that is 0.96 mg·kg-1in lower dosage group, 3.84 mg·kg-1in middle dosage group, and 15.36 mg·kg-1in higher dosage group. Learning abilities of those rats were estimated with Morris water maze 3 weeks later, and the IL-1β level was tested by ELISA. Results: Compared to the control, the escape latency time of treated rats was longer, and the higher dosage group has the longest escape latency time (P<0.05), while there was a reverse correlation between the effective regional time of rats and PM2.5 dosage. Conclusion: PM2.5 in the polluted air of Chengdu has the ability to impair rats′ ability of learning and memorizing, and this impairment was associated to the concentration of PM2.5.

Chengdu; PM2.5; Rats; Ability of learning and memorizing

四川大學國家級大學生創(chuàng)新訓練計劃項目(201610610100)

張霄龍，男，2014級本科生，Email：462251694@qq.com

△通訊作者：王正榮，男，教授，主要從事時間生物學研究，Email：wangzhengrong@126.com。

2017-4-21)