外周化學(xué)感受性反射在慢性心力衰竭中的作用及其機(jī)制探討*

唐玉紅 周華 周黎明 丁延鋒 HD Schultz

(1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生理教研室，四川 成都 610041；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理教研室，四川 成都 610041；3.美國內(nèi)布拉斯加州立大學(xué)醫(yī)學(xué)中心細(xì)胞與整合生理系，內(nèi)布拉斯加州 奧馬哈 68198-5850)

論 著

外周化學(xué)感受性反射在慢性心力衰竭中的作用及其機(jī)制探討*

唐玉紅1△周華1周黎明2丁延鋒3HD Schultz3

(1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院生理教研室，四川 成都 610041；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理教研室，四川 成都 610041；3.美國內(nèi)布拉斯加州立大學(xué)醫(yī)學(xué)中心細(xì)胞與整合生理系，內(nèi)布拉斯加州 奧馬哈 68198-5850)

目的：探討外周化學(xué)感受性反射在缺血性心臟病所致慢性心力衰竭中的作用及其機(jī)制。方法：采用結(jié)扎SD大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支制備慢性心力衰竭(Chronic heart failure，CHF)模型；測(cè)定清醒大鼠的每分肺通氣量(Minute ventilation，VE)作為衡量外周化學(xué)感受性反射的指標(biāo)；放射免疫技術(shù)測(cè)定頸動(dòng)脈體(Carotid body，CB)血管緊張素II(Angiotensin II，Ang II)水平；并采用Western blot方法檢測(cè) CB組織Ang II 1型受體(Angiotensin II receptor subtype 1 receptor，AT1R)和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin converting enzyme，ACE)的蛋白表達(dá)。結(jié)果：8周后模型組大鼠形態(tài)學(xué)和血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)均達(dá)到CHF動(dòng)物模型標(biāo)準(zhǔn)，CHF模型制備成功。清醒CHF大鼠在常氧和不同程度缺氧狀態(tài)下，VE均高于假手術(shù)組(P<0.05)。放射免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CHF組CB組織AngII水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)；Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，CHF組CB組織AT1R和ACE的蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)論：冠脈結(jié)扎的CHF大鼠對(duì)缺氧刺激引起的外周化學(xué)感受性反射增強(qiáng)，可能促進(jìn)了交感神經(jīng)活動(dòng)的過度激活。升高的Ang II可能通過AT1R參與了CB化學(xué)感受性反射增強(qiáng)。

慢性心力衰竭；外周化學(xué)感受性反射；頸動(dòng)脈體；血管緊張素II；血管緊張素II1型受體；缺氧

心力衰竭，簡(jiǎn)稱心衰(Chronic heart failure，CHF)是各種心血管疾病發(fā)展的終末階段，也是導(dǎo)致心血管疾病死亡的主要原因。隨著人口老齡化的加速、冠心病和高血壓發(fā)病率的上升，冠狀動(dòng)脈疾病所致缺血性心臟病成為引起心衰最常見的病因[1-3]。探討缺血性心臟病心衰的深層次病理生理機(jī)制，進(jìn)而發(fā)掘治療新策略，有著極其重大的理論和實(shí)際意義。

大量研究證實(shí)交感神經(jīng)活動(dòng)(Sympathetic nerve activity，SNA)增強(qiáng)是慢性心衰的特征。持續(xù)增強(qiáng)的SNA增加了心臟的前、后負(fù)荷，最終導(dǎo)致心肌毒性和細(xì)胞凋亡，是加速病情惡化并使患者存活期縮短的重要因素[4-9]。研究發(fā)現(xiàn)，在CHF中造成交感功能紊亂涉及多種因素，其機(jī)制非常復(fù)雜。

近年來，在臨床病人和CHF動(dòng)物模型都觀察到化學(xué)感受性反射(Chemoreceptive reflex)參與了CHF中的交感功能紊亂[10-11]。前期研究表明，起搏方式誘導(dǎo)的心衰家兔，在清醒狀態(tài)下對(duì)外周化學(xué)感受性反射(Peripheral chemoreceptive reflex)的敏感性增強(qiáng)，并對(duì)交感神經(jīng)的過度興奮起到重要作用；升高的Ang II對(duì)CB的作用介導(dǎo)了這一效應(yīng)[12-14]。 然而，關(guān)于外周化學(xué)感受性反射在CHF中的作用，對(duì)臨床病人的研究結(jié)果不盡相同，至今尚無定論[15]。

因此，本實(shí)驗(yàn)以冠脈結(jié)扎誘導(dǎo)的CHF大鼠為研究對(duì)象，以每分肺通氣量為衡量外周化學(xué)感受性反射的指標(biāo)， 并結(jié)合Western blot方法和放射免疫測(cè)定技術(shù)，觀察在缺血性心肌病性心衰過程中，外周化學(xué)感受性反射是否增強(qiáng)及AngII在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物

SD雄性大鼠共52只，220-280 g ，由Sasco Breeding Laboratories (Omaha，NE，USA)提供，實(shí)驗(yàn)方案得到內(nèi)布拉斯加大學(xué)醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)，飼養(yǎng)和護(hù)理符合美國國立衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》。

1.1.2 儀器

PowerLab16S生物信號(hào)采集和處理系統(tǒng)(AD Instruments Inc, Australia)；出口管與分壓傳感器 MP-45(Validyne Engineering，Northridge，CA，USA)；SigmaScan Pro軟件(Aspire Software International，USA)；DSI Dataquest PA C40血壓遙測(cè)裝置(Data Science International，USA)；Wizard 1470自動(dòng)伽瑪計(jì)數(shù)儀(PerkinElmer，CT，USA)等。

1.1.3 試劑

羊抗大鼠AT1 抗體(SC-31181，Santa Cruz，USA)；羊抗大鼠ACE抗體(SC-12187，Santa Cruz，USA)；小鼠抗大鼠TH抗體(Sigma-Aldrich Chemical Co.，St Louis，MO，USA)；驢抗羊抗體(Invitrogen Alexa Fluro 488，Molecular Probes，USA)；驢抗小鼠抗體(Invitrogen Alexa Fluro 568，Molecular Probes，USA)；BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒(Protein assay kit (Pierce，USA)；01-RK-A22 AngII125I 放射免疫試劑盒(ALPCO Diagnostics，USA)等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠冠脈結(jié)扎心衰模型的制備

雄性SD大鼠，3%異氟醚麻醉，于左冠狀動(dòng)脈起始點(diǎn)下2 mm(前降支)處，用穿有6-0號(hào)絲線的不銹鋼彎針穿過，結(jié)扎，造成心肌缺血。假手術(shù)組(Sham)以完全相同的方式操作，但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。術(shù)后8周超聲心動(dòng)圖評(píng)估所有大鼠的心臟功能。與Sham組大鼠正常心臟功能相比，冠脈結(jié)扎大鼠的射血分?jǐn)?shù)(Ejection fraction，EF)和左室短軸縮短率(Left ventricular fractional shortening，F(xiàn)S)降低>30%時(shí)，計(jì)入心衰模型組。并且在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后和處死動(dòng)物前，進(jìn)一步測(cè)量左室舒張期末壓(Left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)等指標(biāo)；處死動(dòng)物，測(cè)量心梗面積和全左心室壁面積；當(dāng)LVEDP>15 mmHg及心梗面積占左室壁面積之比>30%的冠脈結(jié)扎大鼠，最終被確定獲得CHF。

1.2.2 大鼠在清醒狀態(tài)下外周化學(xué)感受性反射活動(dòng)的記錄

將大鼠置于一自制的有機(jī)玻璃盒里，通入氣體的導(dǎo)管經(jīng)從盒兩側(cè)小孔出入，不同濃度的混合氣體流過有機(jī)玻璃盒，使血液氣體濃度改變。出口管與分壓傳感器MP-45相連，后者通過放大器連于PowerLab 16S生物信號(hào)采集和處理系統(tǒng)。記錄大鼠清醒狀態(tài)下潮氣量(Tidal volume，VT)和呼吸頻率(Respiratory rate，RR)以計(jì)算VE。依次給予大鼠21%O2(常氧)、15%O2(輕度缺氧)和10%O2(重度缺氧)，觀察上述指標(biāo)的改變，同時(shí)經(jīng)放置于股動(dòng)脈的血壓遙測(cè)裝置監(jiān)測(cè)動(dòng)脈血壓和心率。

1.2.3 CB組織Ang II濃度的測(cè)定

將假手術(shù)組與CHF組大鼠CB組織勻漿、萃取和重建，每管樣品用Wizard 1470自動(dòng)伽瑪計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)1 min，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到AngII濃度。采用放射免疫技術(shù)測(cè)定CB組織Ang II的濃度。

1.2.4 CB組織AT1R和ACE的表達(dá)

迅速取下每只大鼠兩側(cè)的CB，立即放入干冰，并儲(chǔ)存于-80°C備用。提取CB組織中的蛋白質(zhì)，采用常規(guī)Western blot方法，檢測(cè)AT1R和ACE在CB組織的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

各組數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SigmaStat統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，以P<0.05為有顯著性差異。分別以AT1R和ACE蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值的比值作為評(píng)價(jià)AT1R和ACE蛋白質(zhì)表達(dá)水平的指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠冠脈結(jié)扎心衰模型的制備

26只假手術(shù)組大鼠動(dòng)物均存活，冠脈結(jié)扎組存活率約為68%。假手術(shù)組大鼠心臟形態(tài)正常，沒有可見的心肌損傷，見圖1A；模型組大鼠心臟增大，左室可見明顯的梗死區(qū)域，梗死區(qū)心肌為白色瘢痕組織代替，左室腔擴(kuò)大，左室壁增厚，見圖1B，模型組心梗面積占左室壁面積之比為43.1%±3.9。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的心臟重量與體重之比增加，左室舒張期末壓(Left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)明顯升高，而射血分?jǐn)?shù)(Ejection fraction，EF)和左室短軸縮短率(Left ventricular fractional shortening，F(xiàn)S)顯著降低，見表1。

A B圖1 假手術(shù)組(A)和CHF大鼠(B)左心室腔照片 (黃色箭頭指示梗死區(qū))

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05。

LVESD(Left ventricular end-systolic diameter)—左室收縮末期直徑；LVEDD(Left ventricular end-diastolic diameter)—左室舒張末期直徑。

2.2 CHF大鼠在清醒狀態(tài)下外周化學(xué)感受性反射活動(dòng)增強(qiáng)

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在常氧(21%O2)、中度(15%O2)和重度(10%O2)缺氧的狀態(tài)下，CHF組的每分肺通氣量(VE)均高于假手術(shù)組(P<0.05)，見表2 。

表2 在不同O2濃度下假手術(shù)組和CHF組大鼠的每分肺通氣量(X±SD)

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05。

2.3 CHF組CB組織Ang II濃度增高

放射免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CHF組AngII水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，見表3。

2.4 CHF大鼠CB組織AT1R和ACE的蛋白表達(dá)增強(qiáng)

Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，CHF組CB組織AT1R和ACE的蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，見圖2和表3。

圖2 假手術(shù)組和慢性心衰組大鼠CB組織 AT1R(A)及ACE(B)的表達(dá)

組 別例 數(shù)AngII濃度(pg·mg-1)AT1R/GAPDHACE/GAPDH假手術(shù)組 20362±363113±025028±002慢性心衰組195144±043?213±023?037±002?

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支8周制備CHF模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠心室肥厚，左心室有大于30%的梗死區(qū)域和左心室功能明顯減弱，達(dá)到心衰動(dòng)物模型的組織學(xué)和功能學(xué)指標(biāo)，表明CHF模型制備成功。

與快速起搏心衰模型相比，大鼠冠脈結(jié)扎的心衰模型能更好地模擬臨床缺血性心肌病性CHF的病理生理過程，并具有成本低廉，可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，更適用于缺血性心肌病性心衰的研究[16]。

本實(shí)驗(yàn)以VE為衡量外周化學(xué)感受性反射的指標(biāo)，觀察到冠脈結(jié)扎的心衰大鼠對(duì)缺氧刺激引起的外周化學(xué)反射增強(qiáng)，與前期在家兔心衰模型的研究報(bào)道一致[12]，進(jìn)一步證實(shí)了CHF過程中外周化學(xué)感受性反射的增強(qiáng)，該現(xiàn)象可能參與了交感神經(jīng)活動(dòng)的過度激活。而在冠脈結(jié)扎誘導(dǎo)的心衰大鼠模型上的這一發(fā)現(xiàn)，則為臨床缺血性心肌病性心衰中SNA增強(qiáng)機(jī)制的研究提供了新的路徑。常氧下CHF組VE也高于假手術(shù)組，可能的機(jī)制是在CHF發(fā)生發(fā)展過程中，由于心臟功能減弱造成的動(dòng)脈供血供氧不足，引起代償性化學(xué)反射增強(qiáng)。

AngII是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的成分之一，由血漿或組織中的ACE水解血管緊張素I而生成；其生理作用幾乎都是激動(dòng)AT1受體產(chǎn)生的。AngII主要在失血、運(yùn)動(dòng)、腎血流量降低時(shí)發(fā)揮心血管調(diào)控作用[17]。由于Ang II具有改變中樞神經(jīng)系統(tǒng)交感功能的作用，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)交感傳出最主要的因素。有研究表明在冠脈結(jié)扎誘導(dǎo)的心衰大鼠中樞Ang II在交感傳出的增強(qiáng)起到重要作用[13]。在CHF病人和CHF動(dòng)物模型都觀察到血漿和組織的Ang II 水平增高[14]。前期采用起搏誘導(dǎo)的家兔心衰模型研究也提示CB的Ang II和AT1R增強(qiáng)了外周化學(xué)感受器對(duì)低氧的敏感性[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，CHF大鼠CB組織Ang II的濃度增加及AT1R、ACE的蛋白表達(dá)增強(qiáng)，提示CB組織AngII合成增加，并通過AT1受體發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究證實(shí)了CHF過程中外周化學(xué)感受性反射活動(dòng)增強(qiáng)并可能參與交感神經(jīng)活動(dòng)的過度激活，升高的Ang II可能通過AT1受體參與了CB化學(xué)感受性反射增強(qiáng)。該研究為進(jìn)一步探討缺血性心臟病心衰的病理生理機(jī)制及發(fā)掘新的藥物靶點(diǎn)提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Enhanced peripheralchemoreceptive reflex activity and the involved mechanism in conscious rats with chronic heart failure*

Tang Yu-hong1Δ, Zhou Hua1, Zhou Li-ming2, Ding Yan-feng3, HD Schultz3

(1.Department of Physiology, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041; 2.Department of Pharmacology, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041; 3.Department of Cellular and Integrative Physiology, University of Nebraska Medical Center, Nebraska Omaha 68198-5850)

Objective：To investigate the mechanisms of the peripheral chemoreceptive reflex in chronic heart failure caused by ischemic cardiomyopathy. Methods: CHF was produced by ligating the left anterior descending coronary artery in SD male rats. VE were measured in conscious rats as an indicator of peripheral chemoreceptive reflex. The Ang II levels of CB tissues were measured by radioimmunoassay, and the expression of AT1R and ACE protein in CB tissues were detected by Western blot. Results: CHF model was successfully produced for the morphological and hemodynamic indexes of rats reached the standard of CHF animal model 8 weeks after ligation. The VE in conscious CHF rats under normoxia and hypoxia were higher than that in the sham group (P<0.05). The level of AngII of CB tissues in CHF group was significantly higher than that in the sham group (P<0.05) by radioimmunoassay; Western blot results showed that compared with the sham group, the expressions of AT1R and ACE in CB tissues increased in CHF group (P<0.05). Conclusion: An enhancement of the peripheral chemoreceptive reflex occurs in the conscious rats with ligation-induced CHF and it may contribute to the sympathetic over-activation in the CHF state. Elevated Ang II in CB may be involved in the enhancement of CB chemoreceptive reflex via AT1R.

Chronic heart failure; Peripheral chemoreceptive reflex; Angiotensin II; Angiotensin II 1-type receptor; Carotid body; hypoxia

NIH基金(編號(hào)：PO-1 HL 62222)

唐玉紅，女，講師，主要從事神經(jīng)生理學(xué)研究，Email：yvonneyht@163.com。

2017-7-17)