SPE—HPLC測定樂舒洗液中黃柏堿含量

楊妮 毛桂福 王宏虹 謝巍 林威

摘要：目的 建立樂舒洗液中黃柏的薄層鑒別，以及用固相萃取-高效液相色譜法（SPE-HPLC）測定黃柏堿含量的方法。方法 采用薄層色譜法對樂舒洗液中的黃柏進行定性鑒別。采用Bond Elut plexa PCX強陽離子交換固相萃取小柱凈化，Platisil-NH2柱為色譜柱，柱溫為30 ℃，流動相為0.3%三乙胺（磷酸調(diào)pH 3.82）-四氫呋喃-乙腈（18∶12∶70），等度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為286 nm，測定樂舒洗液中黃柏堿的含量。結(jié)果 薄層色譜法能明顯檢出黃柏的特征有效成分黃柏堿；黃柏堿在1.22～12.2 ?g（r=0.999 9）范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為101.18%，RSD=1.71%。結(jié)論 本方法操作簡單，準確性、重復性好，可用于樂舒洗液的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：固相萃??；高效液相色譜法；樂舒洗液；黃柏堿

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.09.

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）09-

Content Determination of Phellodendrine in Leshu Lotionby SPE-HPLC YANG Ni， MAO Gui-fu， WANG Hong-hong， XIE Wei， LIN Wei （Women and Childrens Health Care Hospital of Liuzhou City， Liuzhou 545001， China）

Abstract： Objective To establish the method of thin layer identification of Phellodendri Chinensis Cortex and solid phase extraction - high performance liquid chromatography （SPE-HPLC） determination of the content of phellodendrine in Leshu Lotion. Methods Thin layer chromatography （TLC） was used for qualitative identification of Phellodendri Chinensis Cortex in Leshu Lotion and the Bond Elutplexa PCX strong cation-exchange solid phase was used for extraction small column purification. Platisil-NH2 column was as chromatographic column； column temperature was 30 ℃； triethylamine pH 3.82 （phosphoric acid）， tetrahydrofuran， acetonitrile was 18：12：70， isocratic elution； flow rate was 1.0 mL/min； detection wavelength was 286 nm. Results TLC could obviously identify active ingredients of phellodendrine in Phellodendri Chinensis Cortex. The phellodendrine had good linear relationship between concentration and peak area within the scope of 1.22–12.2 ?g （r=0.999 9）； the average recovery rate of phellodendrine was 101.18%， RSD was 1.71%. Conclusion This method is simple to operate， with accuracy and repeatability， and can be used for quality control of Leshu Lotion.

Key words： solid phase extraction； HPLC； Leshu Lotion； phellodendrine

樂舒洗液是柳州市婦幼保健院的傳統(tǒng)制劑，其生產(chǎn)工藝較為穩(wěn)定，處方由百部、黃柏、苦參、白鮮皮、蛇床子等9味藥組成，具有抗菌、消炎、止癢、收斂、殺滅陰道滴蟲、除臭等作用。一般采用HPLC測定黃柏堿的含量[1]，但樂舒洗液中含明礬較多，色譜分析過程中明礬易析出而損害色譜柱。固相萃取是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，再利用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達到分離待測化合物的目的，該方法簡便，能在短時間內(nèi)處理大量樣品，且能

基金項目：柳州市應用技術(shù)研究與開發(fā)計劃（2011J0302035）

通訊作者：毛桂福，E-mail：maogf2005@sina.com

有效去除樣品中雜質(zhì)的干擾，是目前公認的用于液體樣品濃縮、富集最為有效的前處理技術(shù)之一[2]。為加強對樂舒洗液的質(zhì)量控制，保證制劑療效，本試驗建立一種結(jié)果準確、回收穩(wěn)定、樣品處理簡便、凈化效果好的固相萃取-高效液相色譜法（SPE-HPLC），測定樂舒洗液中有效成分黃柏堿的含量。

1 儀器和試藥

島津LC-20AT四元梯度高效液相色譜系統(tǒng)（LC-20AT泵、Rheodyne 7725i型進樣閥、SPD-20A紫外檢測器、CTO-20A柱溫箱、DGu-20A在線脫氣機），日本島津；PHS-3C型pH計，上海精密科學儀器有限公司；KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HANGPINGFA1004型電子天平，上海天平儀器廠。Bond Elut Plexe PCX混合型強陽離子交換小柱（500 mg/6 mL）、Bond Elut-AL-A氧化鋁固相萃取小柱（500 mg/3 mL），Agilent公司；Agela Cleanert COOH弱酸型陽離子交換小柱（500 mg/6 mL）、Agela Cleanert ODS C18固相萃取小柱（1000 mg/6 mL），北京艾杰爾公司。

鹽酸黃柏堿對照品（批號110721，含量≥98%），四川省維克奇生物科技有限公司。甲醇、乙腈為HPLC純試劑，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。樂舒洗液樣品（本院制劑室，批號分別為2015121501、2015121502、2016042001、2016042002）。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃柏的薄層鑒別

精密量取樂舒洗液20 mL，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，過濾，揮干溶劑，用2 mL甲醇溶解，離心，取上清液，即得供試品溶液。同法制成缺黃柏陰性對照溶液。精密稱取黃柏對照藥材0.1 g，置錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理20 min，過濾，濃縮至2 mL，即得對照藥材溶液。精密稱取黃柏堿對照品6.1 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得對照品溶液。按薄層色譜法（2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則0502）試驗，取上述供試品溶液15 ?L，對照藥材溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各10 ?L，分別點于硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）為展開劑，展開，取出晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對照藥材及對照品相應的位置上，均顯相同的橙色斑點，陰性對照無干擾。

2.2 黃柏堿含量測定

2.2.1 溶液的制備

2.2.1.1 對照品貯備液 精密稱取黃柏堿對照品6.10 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得黃柏堿濃度為0.61 mg/mL的對照品貯備液。

2.2.1.2 供試品溶液 取樂舒洗液樣品，超聲處理（功率400 W，頻率40 kHz）30 min，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液2.0 mL，加于PCX混合型強陽離子交換小柱（預先依次用甲醇5.0 mL、0.5 mol/mL鹽酸溶液5 mL活化）上，流速為1.5 mL/min，依次用0.5 mol/mL鹽酸溶液12 mL、甲醇12 mL、50%甲醇水溶液6 mL洗滌，棄去洗液，抽干靜置1 min，再用20%濃氨甲醇溶液20 mL洗脫，收集洗脫液，置90 ℃水浴中吹干，殘渣用流動相定容至2 mL，即得。

2.2.1.3 陰性對照溶液 按照樂舒洗液制備工藝制備缺黃柏陰性樣品，再按供試品溶液制備方法操作，即得缺黃柏陰性對照溶液。

2.2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性 采用Platisil-NH2色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 ?m），柱溫30 ℃，流動相為0.3%三乙胺（磷酸調(diào)pH 3.82）-四氫呋喃-乙腈（18∶12∶70，V/V/V），流速1.0 mL/min，檢測波長286 mn，進樣量20 ?L。理論塔板數(shù)按黃柏堿峰計算應不低于12 000，黃柏堿保留時間為9.2 min。在此條件下，黃柏堿與其他相鄰色譜峰均達到有效分離，分離度均大于1.5。

2.2.3 專屬性試驗 分別取陰性對照溶液、對照品溶液與供試品溶液各20 ?L進行檢測，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，陰性對照溶液在供試品溶液色譜圖中黃柏堿吸收峰位置上無色譜峰出現(xiàn)，表明陰性對照溶液中其他雜質(zhì)對測定無干擾。

2.2.4 標準曲線 精密吸取黃柏堿對照品貯備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL，分別置10.0 mL容量瓶中，加甲醇定容，分別得到濃度為0.061、0.122、0.244、0.366、0.488、0.61 mg/mL的系列對照品溶液，分別進樣20 ?L，記錄峰面積，以對照品質(zhì)量濃度（?g/mL，C）對峰面積（A）進行回歸，得標準曲線方程A=32 964C+20 251，r=0.999 9。結(jié)果表明，黃柏堿在1.22～12.2 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取同一濃度黃柏堿對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測得黃柏堿峰面積RSD=0.94%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 取同一批號樣品6份，按“2.2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定黃柏堿含量，結(jié)果RSD=1.63%，表明該方法重復性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 將已知黃柏堿含量的樣品超聲處理30 min，濾紙過濾，精密吸取2 mL，共9份，分別上樣于活化的PCX混合型強陽離子交換小柱，分別加入一定量的黃柏堿對照品溶液，按供試品溶液制備方法處理，測定黃柏堿的含量并計算回收率，結(jié)果見表1。

2.2.8 樣品含量測定 取4批樣品，每批平行2份，按上述方法制備供試品溶液，分別進樣測定峰面積并計算黃柏堿含量，結(jié)果見表2。

3 討論

在黃柏的薄層鑒別過程中，曾嘗試以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（10∶6∶1∶1）為展開劑[3]，置氨蒸氣預飽和展開，置紫外光燈（365 nm）下檢視，發(fā)現(xiàn)樣品中黃柏堿分離效果差，拖尾嚴重，故采用藥典方法進行薄層鑒別。

樂舒洗液中黃柏堿含量較高，過濾后可直接測定，但樂舒洗液含明礬較多，色譜分析過程中明礬容易析出，使柱效迅速降低，柱壓快速升高。選用固相萃取法制備供試品溶液，可除去供試品中的無機鹽及雜質(zhì)，有利于延長色譜柱使用壽命。

由于黃柏堿結(jié)構(gòu)中既含有堿性叔氨基，又含有2個酸性的酚羥基，是典型的兩性化合物[4]，試驗中比較了PCX混合型強陽離子交換小柱、氧化鋁固相萃取小柱、弱酸型陽離子交換小柱、ODS C18固相萃取小柱，只有PCX混合型強陽離子交換柱對黃柏堿有較強的保留，能使堿性化合物從酸性和中性雜質(zhì)中分離出來，雖然強堿（如季銨堿類小檗堿等）會不可逆地保留在強陽離子交換柱上，但對黃柏堿的萃取分離影響不大，每支強陽離子交換柱仍可重復使用10余次，故選擇PCX混合型強陽離子交換小柱。

本試驗對SPE洗脫條件進行了優(yōu)化。首先，考察洗脫雜質(zhì)的溶劑0.5 mol/mL鹽酸體積（6、8、10、12 mL）和甲醇體積（6、8、10、12 mL），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用鹽酸溶液6 mL和甲醇10 mL能有效除去無機鹽及極性小的有機雜質(zhì)。其次，比較了水及50%甲醇水溶液去除極性大的有機雜質(zhì)的效果，發(fā)現(xiàn)50%甲醇水溶液除雜效果較好。最后，考察洗脫溶劑20%濃氨甲醇溶液體積（5、10、15、20、25 mL），發(fā)現(xiàn)20 mL洗脫溶劑才能完全洗脫黃柏堿，故選擇洗脫溶劑體積為20 mL。

由于黃柏堿的兩性化合物結(jié)構(gòu)特點，極性較大，在常規(guī)的C18柱中不易保留，柱效低，而選用氨基柱，以乙腈-四氫呋喃-0.3%三乙胺溶液為流動相，黃柏堿可以得到較好保留，并獲得極高的柱效，從而提高分離效果。流動相pH值對黃柏堿色譜峰的峰形、保留時間影響較大，當pH值調(diào)至3.82時，柱效較高，峰形最佳，與雜質(zhì)峰分離效果好。分析樣品的pH值對柱效、峰形、保留時間也有影響，如用甲醇作分析樣品溶劑，柱效稍有降低，峰形稍微變寬；使用pH值4.7以上的流動相作樣品溶劑，柱效會明顯降低，峰形明顯變寬。

參考文獻：

[1] 王舒.黃柏的研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2015，43（8）：39，111.

[2] 陳蕾.固相萃取技術(shù)在中藥分析中的應用[J].中國藥事，2012，26（2）：159-161.

[3] 張芳，張波.黃柏八味膠囊中主要藥味的薄層色譜鑒別[J].醫(yī)藥導報， 2016，35（z1）：95-96.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：305.

（收稿日期：2016-12-19）

（修回日期：2017-01-11；編輯：陳靜）