玉米不同組織器官谷氨酰胺合成酶同工酶表達(dá)差異及聚合方式

王小純張浩然韋一昊賈喜婷谷明鑫馬新明,*

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南鄭州 450002;2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建小麥玉米作物學(xué)國家重點實驗室, 河南鄭州450002;3河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)系, 河南鄭州 450002

玉米不同組織器官谷氨酰胺合成酶同工酶表達(dá)差異及聚合方式

王小純1,2,3張浩然3韋一昊1賈喜婷3谷明鑫3馬新明1,*

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 河南鄭州 450002;2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建小麥玉米作物學(xué)國家重點實驗室, 河南鄭州450002;3河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)系, 河南鄭州 450002

谷氨酰胺合成酶(GS)是作物氮同化及轉(zhuǎn)移利用的關(guān)鍵酶, 本試驗研究了玉米灌漿期不同組織器官的GS同工酶表達(dá)特性, 鑒定了玉米GS同工酶的聚合方式。Western blot結(jié)果表明, 玉米不同組織器官的GS同工酶亞基表達(dá)存在明顯差異, 分子量約40 kD的GS1亞基在所有組織中均大量表達(dá), 39 kD的GS1亞基僅在穗位節(jié)及穗柄中大量表達(dá), 分子量約44 kD的GS2亞基在葉片等光合組織中微量表達(dá)。通過改進(jìn)BNE技術(shù), 結(jié)合膠內(nèi)轉(zhuǎn)移酶活性的測定, 分析了玉米GS同工酶全酶的大小; 利用2-D膠結(jié)合Western blot鑒定了GS同工酶相應(yīng)的亞基組成。結(jié)果表明, 在玉米組織鑒定出3種分子量不同的GS同工酶, GS2全酶分子量約460 kD, 為十聚體; GS1全酶有2種聚合狀態(tài), 一種是分子量約410 kD的十聚體, 另一種是分子量約240 kD的五聚體形式, 可見玉米GS同工酶表達(dá)存在多種方式。

玉米; 谷氨酰胺合成酶(GS); 表達(dá); BNE; 聚合方式

氮是玉米生長發(fā)育必須的大量礦質(zhì)營養(yǎng)元素, 也是玉米產(chǎn)量的一個主要限制因素。在高等植物中, 谷氨酰胺合成酶(GS)/谷氨酸合酶(GOGAT)循環(huán)是氮素同化的主要途徑, 是無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮的樞紐[1], GS是GS/GOGAT循環(huán)中的關(guān)鍵酶, 因此, GS同工酶表達(dá)成為提高作物氮素利用率的一個研究熱點。

高等植物中有2種GS同工酶, 定位于細(xì)胞液的GS1和質(zhì)體的GS2。研究表明GS同工酶的表達(dá)受組織器官、生長發(fā)育、新陳代謝及環(huán)境因素等的調(diào)控[2-4]。GS1主要參與蛋白質(zhì)等含氮有機(jī)化合物降解產(chǎn)生氨的再同化及轉(zhuǎn)移利用[1], GS2主要參與光呼吸和硝酸鹽還原產(chǎn)生的氨的同化[5]。高等植物GS2亞基較大(42～45 kD), 由單一核基因編碼, 而GS1亞基較小(38～40 kD), 由2～5個核基因編碼[6-12]。玉米GS2亞基約44 kD, 由單一核基因編碼, GS1亞基39～40 kD, 由5個核基因編碼[13]。

植物GS必須組裝成聚合體才具有催化活性, 早期電子顯微鏡研究表明大豆GS1全酶是八聚體, 由2個平面環(huán)組成, 每個平面環(huán)由 4個亞基組成[14]。Llorca等[10]利用X-ray晶體技術(shù)研究菜豆重組 GS1結(jié)構(gòu), 發(fā)現(xiàn)其與大豆GS1全酶結(jié)構(gòu)相同, 即由兩個4元環(huán)聚合體組成的八聚體;用分析離心機(jī)測定菜豆GS1全酶相對分子質(zhì)量為344 kD,與晶體研究結(jié)果一致。X-ray晶體分析表明玉米GS1、苜蓿 GS1全酶是由 2個五元環(huán)聚合體組成的十聚體[15-17],但沒有關(guān)于GS2全酶結(jié)構(gòu)的報道。

利用凝膠過濾及分析離心機(jī)測定純化GS全酶的分子量, 也可以初步判斷 GS的聚合狀態(tài), 但是所用材料多,費時長, 儀器設(shè)備昂貴, 而且分辨率低。近年來 Blue native PAGE (BNE)快速發(fā)展[18-19], 利用凝膠電泳對蛋白質(zhì)復(fù)合體依據(jù)其大小進(jìn)行分離, 具有樣品需求少、分辨率高、簡便快捷且保持蛋白質(zhì)聚合狀態(tài)等特點, 越來越多地應(yīng)用于活性蛋白的低聚物狀態(tài)研究[20-22]。本研究通過改良BNE, 結(jié)合蛋白質(zhì)免疫印跡等技術(shù), 分析了玉米不同組織部位GS的表達(dá)特性, 并快速鑒定了GS同工酶的聚合狀態(tài), 與玉米GS1晶體研究結(jié)果一致, 為簡便快捷及時研究GS同工酶表達(dá)調(diào)控方式及其與玉米氮素利用的關(guān)系提供了技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料

將玉米品種豫單916種植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(鄭州),常規(guī)田間管理, 于灌漿期選取根(地下節(jié)根和地上氣生根)及不同葉位的葉片、葉脈、葉鞘、節(jié)、節(jié)間、穗柄、苞葉和籽粒, 快速清洗、剪碎, 于液氮中速凍, 置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 粗酶液的制備

稱取0.5 g不同組織部位的樣品, 加液氮研磨, 再加3倍體積的提取緩沖液(100 mmol L–1Tris-HCl, pH 7.6, 1 mmol L–1EDTA, 1 mmol L–1MgCl2和10 mmol L–1β-巰基乙醇[13,22])混成勻漿, 冰浴靜置30 min后, 4℃、13 000×g離心30 min, 上清液即粗酶提取液。

1.3 電泳分離鑒定GS同工酶

利用3種凝膠電泳系統(tǒng)分離鑒定GS同工酶。

1.3.1 不連續(xù)活性聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)(Native-PAGE) 由3%的濃縮膠(pH 6.7)和5%的分離膠(pH 8.7)組成, 用于玉米不同組織器官的蛋白提取液中GS同工酶亞型的分離和酶活性檢測[22]。4℃預(yù)冷電極緩沖液(25 mmol L–1Tris, 192 mmol L–1甘氨酸), 粗酶液與5×上樣緩沖液[25 mmol L–1Tris-HCl, pH 7.6, 5% (w/v) β-巰基乙醇, 0.05% (w/v)溴酚藍(lán), 50% (v/v)甘油]混勻后上樣, 于4°C條件下電泳, 濃縮膠穩(wěn)壓80V, 分離膠穩(wěn)壓120 V。

1.3.2 Blue native PAGE (BNE) 依據(jù)Wittig等[18]改良BNE電泳方案, 根據(jù)GS同工酶全酶大小進(jìn)行分離并鑒定其相對分子質(zhì)量。凝膠由3%的濃縮膠和4%～13%的梯度分離膠組成, 樣品處理同 Native-PAGE, 加入預(yù)冷陽極緩沖液(25 mmol L–1咪唑-HCl, pH 7.0), 首先使用陰極電泳緩沖液 A (0.02% Coomassie Blue G250, 50 mmol L–1Tricine-HCl, 5 mmol L–1咪唑, pH 7.0), 于4°C、100 V電泳20min后, 更換為陰極電泳緩沖液 B (50 mmol L–1Tricine-HCl, 5 mmol L–1咪唑, pH 7.0), 繼續(xù)電泳至樣品進(jìn)入 4%～13%的梯度分離膠, 然后進(jìn)行穩(wěn)流(15 mA)電泳至藍(lán)色指示劑出膠[22]。

1.3.3 Clear native PAGE (CNE) 參考Wittig等[19], 凝膠體系和 BNE一樣, 但只使用陰極電泳緩沖液 B, 于100V電泳至樣品進(jìn)入分離膠, 然后進(jìn)行穩(wěn)流(15 mA)電泳至藍(lán)色指示劑出膠。

膠內(nèi)GS活性依據(jù)Wang等[22]方法檢測, 活性染色結(jié)束后掃描結(jié)果, 然后再用考馬斯亮藍(lán)R250染色。BNE膠中, 以高分子蛋白 Marker (Amersham HMW Calibration Kit For Native Electrophoresis)為標(biāo)準(zhǔn), 利用Gel-Pro analyzer計算GS同工酶全酶的相對分子質(zhì)量。

1.4 Western blot檢測GS同工酶亞基

取適量粗酶提取液與等體積 2×的上樣緩沖液[100 mmol L–1Tris-HCl, pH 6.8, 4% (w/v) SDS, 10% (v/v) β-巰基乙醇, 0.2% (w/v)溴酚藍(lán), 20% (v/v)甘油]混合, 沸水浴5min變性處理, 室溫條件下利用SDS-PAGE (5%濃縮膠, 12%分離膠)分離蛋白質(zhì), 將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上進(jìn)行Western-blot檢測。使用本實驗室制備的小麥 GS多克隆抗體檢測玉米GS亞基, 使用Bio-Rad Clarity Western ECL試劑盒顯色, 以蛋白Marker (Thermo Scientific PageRuler Prestained Protein Ladder)為標(biāo)準(zhǔn), 利用 Gel-Pro analyzer計算GS同工酶亞基分子質(zhì)量。

1.5 GS同工酶亞基組成的鑒定

切取BNE膠條, 浸泡于含1% SDS和1% β-巰基乙醇的變性液中, 37℃變性處理 2 h[18], 然后用去離子水沖洗凝膠 3～5次, 置 SDS-PAGE濃縮膠頂部, 室溫條件下電泳。電泳結(jié)束后, 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上進(jìn)行Western blot分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米GS同工酶表達(dá)特點

Western blot結(jié)果顯示玉米中有3種GS亞基, 即40 kD和 39 kD的胞液型 GS (GS1)及 44 kD的質(zhì)體型 GS (GS2), 且不同組織器官中 GS同工酶表達(dá)差異較大(圖1-A)。40 kD的GS1在玉米中起主導(dǎo)作用, 不同組織器官均有較大的表達(dá)量(籽粒除外); 39 kD的GS1僅在穗位節(jié)間、節(jié)和果穗柄中表達(dá), 且后2個部位表達(dá)量較高, 可能與玉米灌漿期氮素營養(yǎng)的運輸有關(guān); GS2只在功能葉的葉片、葉脈中少量表達(dá), 可能與玉米是C4植物, 光呼吸強(qiáng)度低有關(guān)。Native-PAGE結(jié)合膠內(nèi) GS酶活性分析顯示(圖 1-B), 玉米根系、葉片、莖節(jié)、穗柄等組織中均檢測到GS活性帶, 葉片中最高, 籽粒中最低; 但葉片提取液中僅檢測到 1條 GS活性帶, 可能因 GS2活性太低或不連續(xù)Native-PAGE分離蛋白質(zhì)的特點導(dǎo)致的2種GS同工酶沒有被分離開; 此外與 Western blot結(jié)果一致, 在含兩種GS1亞基的穗位節(jié)和果穗柄中檢測到2個GS同工酶。

圖1 玉米不同組織GS同工酶表達(dá)和活性分析Fig. 1 Analysis of the expression and activity of GS isoforms from different tissues of maize

2.2 玉米GS同工酶大小鑒定

通過改良 BNE方法, 在玉米葉片和穗位節(jié)間、節(jié)和果穗柄中檢測到2個大小不同的GS活性帶, 其他組織中則只檢測到一條GS帶(圖2-A)。其中, 遷移率較大的GS同工酶全酶分子量約 240 kD, 活性較低; 遷移率較小的GS同工酶分子量約410 kD, 活性非常高。利用BNE分離玉米葉片總蛋白后, 進(jìn)行 Western blot, 檢測到一個相對分子質(zhì)量約460 kD的GS同工酶(圖2-C), 可能因其活性低, 且分子量接近RuBP羧化酶, 其活性被羧化酶的藍(lán)色條帶遮蓋[22]。

2.3 GS同工酶及聚合狀態(tài)鑒定

第一相膠為 BNE, 用以分離玉米組織蛋白復(fù)合體,切取相應(yīng)組織的泳道進(jìn)行蛋白質(zhì)變性處理; 第二相膠為SDS-PAGE, 對 BNE上的蛋白質(zhì)復(fù)合體的亞基進(jìn)行電泳分離; 然后轉(zhuǎn)膜, 利用Western blot鑒定玉米組織中GS同工酶的亞基組成。玉米葉片中分子量約460 kD的GS同工酶(圖2-A)由44 kD的亞基組成且信號非常弱(圖3-A),為GS2; 分子量約410 kD和240 kD的GS同工酶由39～40 kD的亞基組成且信號非常強(qiáng), 為GS1, 表明胞液型GS存在兩種不同的聚合方式。玉米穗柄中只有分子量約410 kD和240 kD的GS同工酶, 也是由39～40 kD的亞基組成, 說明穗柄中GS1全酶也存在兩種不同的聚合方式。

圖2 玉米GS同工酶全酶大小鑒定Fig. 2 Identification of the molecular weight of GS holoenzymes

利用BNE計算GS同工酶的全酶大小(圖2), 利用BNE與SDS-PAGE結(jié)合進(jìn)行兩相電泳分離GS同工酶亞基, 利用Western blot檢測鑒定GS同工酶亞基組成(圖3)。利用 GS同工酶分子量除以相應(yīng)亞基的分子量, 在此基礎(chǔ)上計算 GS同工酶聚合狀態(tài), GS2為十聚體, 胞液型GS1有2種聚合方式, 一種為十聚體, 和前人結(jié)果一致[15]; 此外, GS1同工酶還存在另外一種聚合狀態(tài),即五聚體。

圖3 玉米GS同工酶亞基組成的鑒定Fig. 3 Identification of the subunit composition of GS isoenzymes in maize

3 討論

高等植物2種GS同工酶分別定位于細(xì)胞液(GS1)和質(zhì)體(GS2)[2,23]。GS2缺失在正常條件下是致死性突變; 但通過抑制光呼吸, GS2突變體能夠正常生長發(fā)育, 證明GS2參與光呼吸過程中的氨同化[2]。C3植物和 C4植物光呼吸強(qiáng)度差異巨大[24], 小麥、水稻等 C3植物光呼吸強(qiáng)度很高, GS2表達(dá)量更豐富[25], 而玉米等C4植物光呼吸強(qiáng)度要小得多, 本研究結(jié)果顯示僅在玉米葉片中檢測到 GS2少量表達(dá), 遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于GS1表達(dá)量, 與 C4植物光呼吸弱的生理現(xiàn)象一致。

玉米GS1基因由5個核基因編碼, 其表達(dá)因組織、葉齡及氮量而異, Gln1-3和 Gln1-4在葉片表達(dá)量高[26], Gln1-3決定穗粒數(shù), Gln1-4調(diào)控粒重[13]。本研究發(fā)現(xiàn)玉米的穗位節(jié)、節(jié)間和穗柄組織中有2種高表達(dá)GS1亞基, 其中39 kD的GS1亞基是組織特異表達(dá)。推測39 kD的GS1可能在玉米灌漿期氮素營養(yǎng)轉(zhuǎn)運方面起著重要作用。

由于從植物組織分離純化足量蛋白的難度非常大, 因而,通常采用異源重組植物 GS研究其結(jié)構(gòu)和聚合方式[10,15-17]。BNE/CNE電泳技術(shù)用于分離膜蛋白等蛋白質(zhì)復(fù)合物、測定天然蛋白復(fù)合體的相對分子質(zhì)量, 且具有極高的分辨率[18-19]。近年來廣泛運用于植物可溶性蛋白的分離鑒定[20-22]。本研究通過改良BNE電泳技術(shù)分離玉米可溶性蛋白, 結(jié)合膠內(nèi)活性測定、2-D膠和Western blot技術(shù), 首次發(fā)現(xiàn)玉米葉片有3種分子量不同的GS同工酶, GS2為十聚體, GS1主要是十聚體, 與Unno等[15]利用晶體學(xué)X-ray分析的玉米GS1a是由2個五聚環(huán)組成的十聚體的結(jié)果一致;此外, GS1還存在少量的五聚體, 推測玉米 GS1的聚合狀態(tài)也是一種在氮素代謝中廣泛存在的 GS同工酶調(diào)控方式。

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Differential Expression and Assembly Mode of Glutamine Synthetase Isoenzymes in Different Tissues and Organs of Maize

WANG Xiao-Chun1,2,3, ZHANG Hao-Ran3, WEI Yi-Hao1, JIA Xi-Ting3, GU Ming-Xin3, and MA Xin-Ming1,*

1Collaborative Innovation Center of Henan Grain Crops / Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;2State Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science in China / Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China;3Department of Biochemistry, College of Life Science / Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China

Glutamine synthetase (GS) is a key enzyme in nitrogen assimilation and recycling in cereals. In this study, the expression characteristics of GS isoenzymes in different tissues and organs of maize in grain-filling period were analyzed, and the assembly of GS isoenzymes were indentified. The GS isoforms expressed differentially in different organs were shown by Western-blot obviously; GS1 with a molecular weight of about 40 kD expressed highly in all tissues, and GS1 with a molecular weight of about 39 kD was merely expressed in the node of ear position and pedical, and GS2 with a molecular weight of about 44 kD was weakly expressed in the photosynthtic tissue such as leaf. With a modified blue naive PAGE (BNE) technique and in-gel activity analysis, the size of GS holoenzyme was calibrated; combined the 2-D gel with western-blot analysis, the subunits composition of GS isoenzymes were identified. Three GS isoenzymes with different sizes were identified in maize. GS2 holoenzyme was about 460 kD and likely a decamer, GS1 holoenzyme existed two kinds of assembly state, one was about 410 kD and likely a decamer, another was about 240 kD and more likely a pentamer; therefore, the expression of GS isoenzymes exists diversity in maize.

Maize; Glutamine synthetase (GS); Expression; Blue native PAGE (BNE); Assembly

(

): 2016-12-21; Accepted(接受日期): 2017-04-20; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-05-08.

10.3724/SP.J.1006.2017.01410

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0300205)和小麥玉米作物學(xué)國家重點實驗室(39990047)資助。

The study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0300205) and State Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science (39990047).

*通訊作者(Corresponding author): 馬新明, E-mail: xinmingma@126.com, Tel: 13937100780

聯(lián)系方式: E-mail: xiaochun.w@163.com, Tel: 13783586761

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170508.1007.010.html