玉米ZmBRI1基因的克隆、表達(dá)及功能分析

郝 嶺 張鈺石 段留生 張明才李召虎

植物生長調(diào)節(jié)劑教育部工程研究中心 / 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)系, 北京 100193

玉米ZmBRI1基因的克隆、表達(dá)及功能分析

郝 嶺 張鈺石 段留生 張明才*李召虎

植物生長調(diào)節(jié)劑教育部工程研究中心 / 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)系, 北京 100193

油菜素內(nèi)酯(BRs)是一種重要的甾族類激素, 在植物的生長過程中起著重要的作用。本研究利用同源克隆的方法, 從玉米 B73自交系中獲得了一個新的油菜素內(nèi)酯受體蛋白編碼基因 ZmBRI1, 該基因全長為 3369 bp, 編碼1122個氨基酸。亞細(xì)胞定位分析表明, ZmBRI1蛋白定位于細(xì)胞膜上, 而且ZmBRI1在各個玉米的各個組織器官中都有表達(dá), 其中在幼嫩的組織中表達(dá)最高。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將ZmBRI1導(dǎo)入BR不敏感突變體bri1-5中, 獲得的轉(zhuǎn)基因植株修復(fù)了其表型, 特別是植株高度、葉片形態(tài)和果莢大小。與突變體bri1-5比較, 油菜素內(nèi)酯(brassinolide, BL)處理顯著抑制轉(zhuǎn)基因株系根系生長; 丙環(huán)唑(propiconazole, Pcz)處理顯著抑制了下胚軸生長; 同時轉(zhuǎn)基因株系DWF4和CPD基因的表達(dá)量下降。此外, 在野生型(Ws)中過表達(dá)ZmBRI1, 顯著提高了擬南芥在ABA抑制條件下的種子萌發(fā)率和植株生長, 下調(diào)了ABA響應(yīng)基因RD29A、RD29B、ABI5和RAB18的表達(dá)。因此, ZmBRI1不僅參與了植物的形態(tài)建成和BR的信號傳導(dǎo), 而且參與調(diào)控了植物對ABA信號的響應(yīng)。

玉米; ZmBRI1; 轉(zhuǎn)基因植株; 油菜素內(nèi)酯; ABA

油菜素內(nèi)酯(brassinosteroid, BR)屬于甾族化合物, 是一種天然的植物激素, 在植物根的發(fā)育、種子休眠和萌發(fā)、葉片的形態(tài)建成、種子的發(fā)育和成熟、花器官的分化、生物和非生物脅迫以及光形態(tài)建成和衰老等生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[1-3]。在BR信號傳導(dǎo)過程中, BR被膜受體BRI1識別, 通過BRI1的磷酸化和去磷酸化傳遞BR信號[4-5]。在單子葉作物水稻和小麥中, 通過對 BRI1基因表達(dá)的調(diào)控,使株型更加緊湊, 提高了作物對光的利用率, 促進(jìn)了灌漿, 使作物在高密度下有更大的生產(chǎn)潛力[6-9]; 在雙子葉植物豌豆、棉花、擬南芥、番茄中, BRI1基因的突變體表現(xiàn)出了與 BR合成突變體相似的表型,如植株矮化、雄穗育性降低、葉和花畸形等, 過量表達(dá)該基因可以使葉片變大, 開花提前等[10-12]。

在擬南芥中, 過量表達(dá)玉米的ZmDWF4基因可以恢復(fù)擬南芥dwf4突變體的表型[13]; 相反, 玉米的ZmDWF1基因被敲除后, 由于莖伸長受阻, 出現(xiàn)了嚴(yán)重的矮化[14]。在玉米中, 通過轉(zhuǎn)座子誘變和化學(xué)誘變, 獲得了編碼C-5α還原酶和C-6氧化酶基因的突變體na1和brd1。該突變體節(jié)間幾乎無伸長, 葉片和花畸形, 雄穗育性降低, 部分轉(zhuǎn)化成了雌穗[15]; Kir等[16]利用RNA干擾技術(shù)研究發(fā)現(xiàn), zmbri1-RNAi玉米突變體的株高降低, 葉片深綠、卷曲, 且向上直立,葉耳形成受阻。由此可知, BR在玉米生長發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用, 但 BR信號在玉米中的調(diào)控作用有待進(jìn)一步研究。因此, 本研究利用同源克隆的方法, 從玉米中獲得了ZmBRI1基因, 并轉(zhuǎn)化擬南芥的野生型Ws和BR不敏感突變體bri1-5驗證其功能。通過分析轉(zhuǎn)基因株系對油菜素內(nèi)酯(brassinolide, BL)、BR合成抑制劑丙環(huán)唑(propiconazole, Pcz)、ABA等的響應(yīng), 研究了ZmBRI1基因在響應(yīng)BR和ABA激素信號中的作用, 為揭示BR在玉米生長發(fā)育過程中調(diào)控機(jī)制以及與 ABA的互作機(jī)制提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

玉米自交系 B73, 由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)李建生教授實(shí)驗室提供; 野生型擬南芥Wassilewskija (Ws)及其Ws生態(tài)型EMS誘變突變體bri1-5, 擬南芥材料由愛荷華州立大學(xué)尹延海教授提供。大腸桿菌 DH5a菌株, 購于康為世紀(jì)生物科技有限公司; Agrobacterium tumefaciens GV3101菌株, 為本實(shí)驗室保存。農(nóng)桿菌 pMD-18T載體購于寶生物工程大連有限公司TaKaRa; 超表達(dá)載體pCAMBIA1300由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)鞏志忠教授實(shí)驗室在該載體上添加 Super啟動子后提供。

NEB限制性內(nèi)切酶和熒光定量試劑購于寶生物工程大連有限公司TaKaRa; M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4連接酶、Oligo(dT)18購于Promega; 質(zhì)粒DNA提取試劑盒和DNA回收試劑購于北京天根生化科技有限公司; RNA提取試劑購于華越洋生物科技有限公司; 普通dNTP mix、DNA marker購于康為世紀(jì)生物科技有限公司; 油菜素內(nèi)酯(brassinolide, BL)、丙環(huán)唑(propiconazole, Pcz)等購于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司 Sigma-Aldrich。其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 材料培養(yǎng)

將適量干燥的擬南芥種子分裝于1.5 mL的離心管中, 用 NaClO溶液消毒 10 min (0.5% NaClO + 0.01% Trion X-100), 滅菌蒸餾水沖洗5～7次, 點(diǎn)播于MS培養(yǎng)基上, 4℃低溫春化3 d, 于光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為16 h光照/8 h黑暗, 溫度為22℃,光照強(qiáng)度50 μmol m–2s–1, 空氣相對濕度70%～80%。

BL對根長的抑制試驗: 配置含0、0.05和1.00 μmol L–1BL的1/2MS培養(yǎng)基, 將要比較的株系播種于同一個培養(yǎng)皿。每個處理3個重復(fù), 春化3 d后,轉(zhuǎn)移到溫室中, 垂直光照培養(yǎng)。生長7 d, 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和照相。

BR的抑制劑丙環(huán)唑(Pcz)對下胚軸的抑制試驗:配置含0 μmol L–1Pcz和1.0 μmol L–1Pcz的1/2MS培養(yǎng)基, 將要比較的株系播種于同一個培養(yǎng)皿。每個處理設(shè)置3個重復(fù), 春化3 d后, 轉(zhuǎn)移到溫室中, 黑暗垂直培養(yǎng)。生長7 d, 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和照相。

ABA 抑制種子萌發(fā)和根長的試驗: 配置含 0 μmol L–1ABA和0.75 μmol L–1ABA的1/2MS培養(yǎng)基, 將要比較的株系播種于同一個培養(yǎng)皿。每個處理3個重復(fù), 春化3 d后, 轉(zhuǎn)移到溫室中, 光照培養(yǎng)。3 d時, 開始統(tǒng)計發(fā)芽率。6 d時, 照相; 擬南芥的種子在1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)3 d, 根長約為0.5～1.0 cm時, 移到含10 μmol L–1ABA的1/2MS培養(yǎng)基上垂直培養(yǎng)5 d, 測量根長。

ABA響應(yīng)基因的表達(dá)水平: 擬南芥在光下生長6 d, 挑選表型一致的幼苗, 轉(zhuǎn)移至含有 100 μmol L–1ABA 的液體1/2MS中, 處理3 h取樣, 提取總的RNA, 反轉(zhuǎn)錄, 測定相關(guān)基因 RD29A、RD29B、RAB18和ABA信號的轉(zhuǎn)錄因子ABI5的表達(dá)(表1)。

1.3 RNA的提取和Real-time PCR分析

采用華越洋生物公司的植物總 RNA提取試劑盒提取總RNA, 按照Promega的M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的要求合成 cDNA。使用 TaKaRa的Real-time PCR (SYBR)試劑盒, 熒光定量 PCR儀(ABI7500)進(jìn)行 Real-time PCR反應(yīng)。分別以基因ZmACTIN (J01238.1)和 AtACT2 (NM_001338358.1)為內(nèi)參(表1)。15 μL反應(yīng)體系含2×SYBR Premix Ex Taq 7.5 μL、50×ROX Reference Dye II 0.3 μL、正向引物和反向引物各(10 μmol L–1) 0.3 μL、cDNA模板(40 ng μL–1) 1.5 μL、ddH2O 5.1 μL。采用兩步法反應(yīng)程序, 95℃ 5 min; 95℃ 10 s, 60℃ 34 s, 40個循環(huán)。根據(jù)各樣品特定的熒光閾值下的 Ct值, 采用 2–ΔΔCt法計算基因在不同樣品中的相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.4 ZmBRI1基因的生物信息學(xué)分析

在 NCBI (National Center for Biotechnology Information)中, 下載擬南芥、水稻等作物中已知的BRI1基因的氨基酸序列。利用CLUSTALW和Rooted phylogenetic tree (http://www.genome.jp/tools/clustalw/)構(gòu)建生物進(jìn)化樹; 利用RasMol/PyMOL軟件進(jìn)行蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和三維結(jié)構(gòu)的分析。

1.5 ZmBRI1基因克隆和表達(dá)載體構(gòu)建

設(shè)計 ZmBRI1基因的引物 ZmBRI1-F (Kpn I): 5′-GGGGTACCATGGAATCTCCGGGGCTGGT-3′和ZmBRI1-R (Xba I): 5′-GCTCTAGAGTCCTTCTCCTC CTTGTCTTCTTTCAG-3′, 以玉米自交系 B73的cDNA為模板擴(kuò)增ZmBRI1基因的開放閱讀框。采用酶切重組技術(shù)將測序正確的目的基因構(gòu)建到帶有CaMV 35S啟動子的pCAMBIA1300載體上。

1.6 擬南芥轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因純合植株的獲得

采用農(nóng)桿菌浸花法進(jìn)行 ZmBRI1基因的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化[17], 分別轉(zhuǎn)入野生型 Ws和突變體 bri1-5中, 將收獲的T0擬南芥種子播種于含潮霉素(50 mg L–1)抗性的 MS培養(yǎng)板中進(jìn)行篩選, 選取陽性植株,收取 T1擬南芥的種子。對 T1擬南芥種子再次篩選,挑選符合3∶1比例的植株, 收取T2擬南芥的種子。對T2擬南芥種子進(jìn)行篩選, 挑選純合的T3種子進(jìn)行功能分析。本研究挑選了2個轉(zhuǎn)突變體bri1-5的轉(zhuǎn)基因株系ZmBRI1-4和ZmBRI1-6, 2個轉(zhuǎn)野生型Ws的轉(zhuǎn)基因株系OE1和OE2, 做后續(xù)實(shí)驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米ZmBRI1基因的序列鑒定和蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用同源克隆技術(shù), 獲得長度約 4.0 kb左右的片段, 經(jīng)測序拼接, 該基因含有一個長度為3369 bp,編碼 1122個氨基酸的完整的 ORF。該基因在玉米B73測序數(shù)據(jù)庫中, 位于第 8染色體, 基因號為GRMZM2G048294。另外, 在第5染色體上還有一個與之相似度可達(dá)到 95%的同源序列, 該基因的GenBank注冊號為KP099562。對擬南芥AtBRI1、水稻 OsBRI1、大麥 HvBRI1、豌豆 PsBRI1、番茄LeBRI1與玉米ZmBRI1氨基酸序列同源比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明, 玉米 ZmBRI1氨基酸序列和擬南芥 AtBRI1的氨基酸一致性和相似性分別為 54%和69%; 與水稻OsBRI1的氨基酸一致性和相似性分別為80%和88%, 有較近的親緣關(guān)系(圖1)。用RasMol 2.7.2.1軟件預(yù)測蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu), 由圖 3可以看出, ZmBRI1蛋白由α-螺旋、β-片層和不規(guī)則卷曲交替組成, 包括33.42%的α-螺旋和16.31% β-片層結(jié)構(gòu), 以及50.27%的不規(guī)則卷曲。N-端有一個α-螺旋, 屬于信號肽的一部分, 可能參與了蛋白的跨膜運(yùn)輸和定位。

圖1 ZmBRI1蛋白的同源比對分析(a)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(b)Fig. 1 Homology analysis (a) and phylogenetic tree (b) of ZmBRI1 protein

圖2 ZmBRI1蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 2 Predicted structure of ZmBRI1 protein

2.2 ZmBRI1蛋白的亞細(xì)胞定位和在玉米各組織中的表達(dá)

圖 3表明, 對照載體(空載體 35S::GFP)轉(zhuǎn)化的擬南芥, 其熒光遍布整個細(xì)胞區(qū)域; 重組載體(35S:: ZmBRI1-GFP)轉(zhuǎn)化的擬南芥, 其熒光主要分布在細(xì)胞膜上。因此, ZmBRI1蛋白是一個質(zhì)膜定位的蛋白。圖4表明, ZmBRI1基因在玉米的各個組織器官中都有表達(dá), 其中在幼嫩的組織中表達(dá)較高。

2.3 ZmBRI1基因的表達(dá)修復(fù)了突變體bri1-5的表型和BR信號通路

圖3 ZmBRI1蛋白的亞細(xì)胞定位示意圖Fig. 3 Subcellular localization of ZmBRI1 protein

圖4 ZmBRI1基因在玉米各個組織部位的表達(dá)Fig. 4 Expression of ZmBRI1 gene in maize從玉米各個部位中提取總RNA, 進(jìn)行RT-qPCR分析。表中所給數(shù)據(jù)為3個重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差, 對照為中部葉(*P ＜ 0.05)。Total RNA was extracted from those young seedlings, and RT-qPCR analysis was performed. Error bars show SD from three independent RNA extractions. Asterisks indicate significant differences compared to the middle leave (*P ＜ 0.05).

圖5 ZmBRI1轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型Fig. 5 Phenotype of ZmBRI1 transgenic lines(a)生長6周植株的表型, Bar=2 cm; (b)生長4周植株的葉片形態(tài), Bar=2 cm; (c)生長4周的果莢大小, Bar=1 cm; (d)對a植株高度的統(tǒng)計; (e)對b葉柄長度的統(tǒng)計; (f)對b葉片長寬比的統(tǒng)計(每組數(shù)據(jù)20株苗, 3次重復(fù), **P ＜ 0.01)。(a) Phenotype comparison of 6-week-old plants. Bar=2 cm; (b) Leaf phenotypes of 4-week-old plants. Bar=2 cm; (c) Silique morphology comparison among the wide-type (Ws), bri1-5 mutant and two transgenic lines (ZmBRI1-4 and ZmBRI1-6) from 4-week-old plants. Bar=1 cm. (d) Plant height statistics of transgenic lines; statistical analysis of leaf measurements: (e) the petiole length and (f) length-width ratio of the rosette leaves. Averages and standard deviations were calculated from 20 seedlings of three independent experiments. Asterisks indicate significant differences compared to the bri1-5 mutant (**P ＜ 0.01).

由圖5可知, ZmBRI1轉(zhuǎn)基因株系基本上修復(fù)了突變體 bri1-5的表型, 主要表現(xiàn)在以下幾個方面:突變體 bri1-5植株矮小, 轉(zhuǎn)基因株系 ZmBRI1-4和ZmBRI1-6的株高顯著高于突變體 bri1-5, 與野生型Ws的株高無顯著差異; ZmBRI1-4和ZmBRI1-6與突變體bri1-5相比, 葉片顯著變大, 葉柄顯著變長, 葉片形態(tài)和野生型Ws相似; ZmBRI1-4和ZmBRI1-6與突變體 bri1-5相比, 果莢和果柄顯著變長, 果莢大小和野生型Ws相似。由此可知, 過表達(dá)ZmBRI1基因, 可以在一定程度上修復(fù)突變體bri1-5的表型。

圖6 BL和Pcz對ZmBRI1轉(zhuǎn)基因擬南芥根長和下胚軸的影響Fig. 6 Effects of BL and Pcz on root and hypocotyl of ZmBRI1 transgenic lines(a) BL對根長和下胚軸的影響; (b) Pcz對下胚軸的影響; (c) BL處理下胚軸相對長度的統(tǒng)計; (d) BL處理根相對長度的統(tǒng)計; (e) Pcz處理下胚軸相對長度的統(tǒng)計(每組數(shù)據(jù)20株苗, 3次重復(fù), *P ＜ 0.05; **P ＜ 0.01)。(a) Effects of BL on root and hypocotyl; (b) Effects of Pcz on hypocotyl (c) Relative hypocotyl statistics under treatment with different concentrations of BL; (d) Relative root length statistics under treatment with different concentrations of BL; (e) Relative hypocotyl statistics under Pcz treatment. Averages and standard deviations were calculated from 20 seedlings of three independent experiments. Asterisks indicate significant differences compared to the bri1-5 mutant (*P ＜ 0.05; **P ＜ 0.01).

從圖6的a、c和d看出, 在1/2MS培養(yǎng)基上, 轉(zhuǎn)基因株系ZmBRI1-4和ZmBRI1-6的子葉、根長和下胚軸的長度顯著大于突變體 bri1-5, 且與野生型的表型基本一致, 即在突變體bri1-5中過表達(dá)ZmBRI1基因, 可以恢復(fù)突變體的表型; 在含有 0.05 μmol L–1BL的 1/2MS培養(yǎng)基上, 轉(zhuǎn)基因株系 ZmBRI1-4和ZmBRI1-6的根長分別為對照的83%和86%, 下胚軸分別為對照的136%和150%, 突變體bri1-5的根長和下胚軸分別為對照的 155%和 108%; 在含有 1 μmol L–1BL的 1/2MS培養(yǎng)基上, 轉(zhuǎn)基因株系ZmBRI1-4和ZmBRI1-6的根長分別為對照的48%和53%, 下胚軸分別為對照的 157%和 170%, 突變體bri1-5的根長和下胚軸分別為對照的180%和110%, BR對突變體bri1-5根的生長起促進(jìn)作用, 對下胚軸的生長無顯著影響, 但在突變體 bri1-5中超表達(dá)ZmBRI1基因, 轉(zhuǎn)基因株系 ZmBRI1-4和 ZmBRI1-6對BR的響應(yīng)和野生型Ws一致, 即ZmBRI1基因的表達(dá)恢復(fù)了突變體bri1-5對BR的響應(yīng); 從圖6的b和e可以看出, 無論在1/2MS培養(yǎng)基上, 還是在含有1 μmol L–1Pcz的 1/2MS培養(yǎng)基上, 轉(zhuǎn)基因株系ZmBRI1-4和ZmBRI1-6的下胚軸的長度顯著大于突變體bri1-5, 即在突變體bri1-5中超表達(dá)ZmBRI1基因, 可以恢復(fù)突變體的暗形態(tài)建成和對Pcz的抗性。

從圖 7可以看出, 轉(zhuǎn)基因株系 ZmBRI1-4和ZmBRI1-6與突變體bri1-5相比, DWF4和CPD基因的表達(dá)量下降, 即在突變體bri1-5中超表達(dá)ZmBRI1基因, 恢復(fù)了突變體bri1-5的BR信號傳導(dǎo)。

2.4 ZmBRI1基因的表達(dá)降低了擬南芥對 ABA的敏感性

圖7 ZmBRI1轉(zhuǎn)基因株系中CPD和DWF4的表達(dá)水平Fig. 7 Expression of the BR-related marker genes CPD and DWF4 in ZmBRI1 transgenic lines從擬南芥幼苗中提取總RNA, 進(jìn)行RT-qPCR分析。表中數(shù)據(jù)為3個重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差, 對照為突變體bri1-5 (*P ＜ 0.05)。Total RNA was extracted from those young seedlings, and RT-qPCR analysis was performed. Error bars show SD from three independent RNA extractions. Asterisks indicate significant differences compared to the bri1-5 mutant (*P ＜ 0.05).

圖8 ABA對ZmBRI1轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)和根長的影響Fig. 8 Effects of ABA on seed germination and root length in ZmBRI1 overexpression lines(a) ABA對ZmBRI1轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)的影響; (b)種子生長4 d的發(fā)芽率統(tǒng)計, 每組數(shù)據(jù)40粒種子; (c) ABA對ZmBRI1轉(zhuǎn)基因擬南芥根長的影響; (d)根相對長度的統(tǒng)計, 每組數(shù)據(jù)20株苗。表中數(shù)據(jù)為3組重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差, 對照為Ws (*P ＜ 0.05)。(a) Effects of ABA on seed germination in ZmBRI1 overexpression lines; (b) Effects of ABA on root length in ZmBRI1 overexpression lines; (c) Germination rate of transgenic lines at 4 d after stratification on 1/2MS medium supplemented with 0 or 0.75 μmol L–1ABA; (d) The relative root length statistics of 8-day-old light-grown seedlings with or without 10 μmol L–1ABA. Averages and standard deviations were calculated from 20 seedlings of three independent experiments. Asterisks indicate significant differences compared to Ws (*P ＜ 0.05).

從圖8a和c可以看出, 在1/2MS培養(yǎng)基上, 各個株系的發(fā)芽率都接近 100%, 但在含有 0.75 μmol L–1ABA的 1/2MS培養(yǎng)基上, 轉(zhuǎn)基因株系 OE1和OE2的發(fā)芽率分別為46%和54%, 野生型Ws的發(fā)芽率為 32%, 轉(zhuǎn)基因株系的發(fā)芽率顯著高于野生型,即在野生型Ws中超表達(dá)ZmBRI1基因, 可以在一定程度上降低擬南芥對ABA的敏感性, 提高種子的發(fā)芽率。從圖8b和d可以看出, 在含ABA的1/2MS培養(yǎng)基上, 野生型根受抑制的程度顯著高于轉(zhuǎn)基因株系OE1和OE2, 即在野生型Ws中過表達(dá)ZmBRI1基因, 可以在一定程度上降低擬南芥對ABA的敏感性, 促進(jìn)根系的生長。

從圖 9發(fā)現(xiàn), 在1/2MS培養(yǎng)基中, 轉(zhuǎn)基因株系OE1和 OE2與野生型 Ws相比, ABA響應(yīng)基因RD29A、RD29B、ABI5和RAB18的表達(dá)無顯著差異。但是, 在含有100 μmol L–1ABA的1/2MS培養(yǎng)基中, ABA響應(yīng)基因的表達(dá)水平在各個株系中顯著提高。然而, 轉(zhuǎn)基因株系OE1和OE2與野生型相比, ABA響應(yīng)基因的表達(dá)都有一定程度的下調(diào), 即在野生型Ws中超表達(dá)ZmBRI1基因, 可以在一定程度上抑制ABA下游基因的表達(dá)。

圖9 ABA對ZmBRI1轉(zhuǎn)基因擬南芥中RD29A、RD29B、ABI5和RAB18基因表達(dá)的影響Fig. 9 Effects of ABA on the expression of RD29A, RD29B, ABI5, and RAB18 in ZmBRI1 overexpression lines.

3 討論

油菜素內(nèi)酯作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑, 參與了植物的多種生物學(xué)過程, 在促進(jìn)作物生長和提高作物的抗逆性方面發(fā)揮了重要的作用。如種子的休眠和萌發(fā), 根的發(fā)育, 植物的形態(tài)建成, 生物和非生物脅迫等[1-3]。當(dāng)油菜素內(nèi)酯結(jié)合到受體蛋白 BRI1的胞外區(qū)時, 會使BRI1和BAK1形成二聚體, 發(fā)生磷酸化, 并激活下游側(cè)信號因子BSK1和CDG1, 磷酸化BSU1。BSU1會使BR的負(fù)調(diào)控因子BIN2發(fā)生磷酸化而失去活性, 使BZR2/ BES1被激活, 從而調(diào)控下游基因的表達(dá)[18]。

BR不僅能影響植物的營養(yǎng)生長和生殖生長, 對植物的形態(tài)建成也起著重要的作用。BR合成或信號傳到突變體會嚴(yán)重?fù)p害植株葉片的形態(tài)。BRI1是油菜素內(nèi)酯信號傳導(dǎo)過程中與 BR直接互作的受體蛋白, 該基因的突變會損害植株的正常生長。例如, 擬南芥的突變體bri1-5是一種油菜素內(nèi)酯不敏感的弱突變體, 植株矮小, 葉片變小, 葉色深綠, 葉緣呈鋸齒狀, 且花期延遲, 種子變小[19]。本研究利用同源克隆的技術(shù), 從玉米中克隆了一個油菜素內(nèi)酯受體基因 ZmBRI1, 該基因在幼嫩組織中表達(dá)較高, 表達(dá)的蛋白定位于細(xì)胞膜(圖3和圖4)。在突變體bri1-5中超表達(dá)ZmBRI1基因, 恢復(fù)了擬南芥的葉片形態(tài)、株高和果莢大小, 但互補(bǔ)株系的生育期仍晚于野生型Ws (圖5)。由此說明, ZmBRI1基因和AtBRI1基因在功能上有很大的相似性, 但還有一定的差異。

在光照條件下, 外源油菜素內(nèi)酯的濃度高于0.001 μmol L–1時, 抑制根的生長, 促進(jìn)下胚軸的生長[20]; 在黑暗條件下, 擬南芥幼苗的下胚軸會快速伸長, 但當(dāng)植物體內(nèi) BR的合成或信號傳導(dǎo)受阻時,就會抑制下胚軸的生長。丙環(huán)唑(Pcz)可以特異性抑制BR的合成, 使植物出現(xiàn)缺乏BR的特異表型[21]。在突變體bri1-5中過表達(dá)ZmBRI1基因, 恢復(fù)了突變體bri1-5對BL和Pcz的正常響應(yīng), 以及BR合成基因的表達(dá)水平(圖 6和圖 7)。由此可知, 過表達(dá)ZmBRI1對突變體bri1-5表型的恢復(fù), 是由于對突變體bri1-5信號通路的修復(fù), 該研究結(jié)果與Wang等[22]的研究結(jié)果一致。說明ZmBRI1基因與AtBRI1基因在感知BR信號時, 有著相同的功能。但要注意到, 互補(bǔ)株系對BL的敏感性仍舊低于野生型, 說明ZmBRI1基因和AtBRI1基因在功能上還存在一定的差異。

BR作為一種生長促進(jìn)類激素, 也參與了多種逆境脅迫過程。在種子萌發(fā)過程中, ABA促進(jìn)休眠, 抑制萌發(fā), 而BR可以通過信號分子BIN2磷酸化ABI5,對ABA產(chǎn)生拮抗作用[23]。本研究中, 在野生型Ws中過表達(dá)ZmBRI1基因, 抑制了ABA下游基因的表達(dá), 降低了擬南芥對ABA的敏感性(圖8和圖9)。由此說明, ZmBRI1基因可間接或直接參與ABA的信號傳導(dǎo), 調(diào)控擬南芥對逆境的適應(yīng)性, 該研究結(jié)果與Hu和Yu的研究結(jié)果一致[23]。

目前, 利用基因工程的手段改造 BR合成和信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因, 可以改善株型, 促進(jìn)灌漿, 提高作物產(chǎn)量。Wu等[24]發(fā)現(xiàn)在水稻中特異性表達(dá)玉米、擬南芥和水稻的 DWF4基因, 可以促進(jìn)種子灌漿, 提高產(chǎn)量; Morinaka等[6]通過對水稻BRI1基因相關(guān)突變體的篩選, 得到了一株 BKD1突變體。該突變體在株高和分蘗方面和野生型無顯著區(qū)別, 但葉夾角變小, 株型更緊湊, 使其在生產(chǎn)上具有更大的產(chǎn)量潛力。在玉米上, 利用RNA干擾技術(shù)研究了ZmBRI1和ZmDWF1在控制玉米株型方面的重要作用。RNA敲除突變體的玉米株高降低, 葉片深綠、卷曲, 且向上直立[14,16]。但在玉米上的研究, 僅限于對表型的調(diào)控。未來, 利用基因工程的手段, 改善玉米種質(zhì)資源, 獲得理想株型, 使提高玉米產(chǎn)量和對逆境脅迫的適應(yīng)性成為可能。

4 結(jié)論

從玉米中克隆了一個油菜素內(nèi)酯受體基因ZmBRI1, 該基因全長為3369 bp, 編碼1122個氨基酸, 是一個膜定位蛋白。該基因在玉米各個組織中都有表達(dá), 但在幼嫩的組織表達(dá)較高。過表達(dá)ZmBRI1基因修復(fù)了bri1-5突變體的表型, 特別是植株高度、葉片形態(tài)和果莢大小; 同時, 修復(fù)了BR的信號通路, 使DWF4和CPD基因的表達(dá)降低。此外,在野生型擬南芥中過表達(dá) ZmBRI1基因, 降低了擬南芥對ABA的敏感性: 提高了ABA處理下種子的萌發(fā)率和根系生長, 下調(diào)了ABA響應(yīng)基因RD29A、RD29B、ABI5和RAB18的表達(dá)。因此, ZmBRI1不僅參與了植物的形態(tài)建成和 BR的信號傳導(dǎo), 而且參與了植物對ABA的響應(yīng)。

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Cloning, Expression and Functional Analysis of Brassinosteroid Receptor Gene (ZmBRI1) from Zea mays L.

HAO Ling, ZHANG Yu-Shi, DUAN Liu-Sheng, ZHANG Ming-Cai*, and LI Zhao-Hu

Engineering Research Center of Plant Growth Regulator, Ministry of Education / Department of Agronomy, College of Agronomy and Biotechnology, China Agricultural University, Department of Agronomy, Beijing 100193, China

Brassinosteroids (BRs) is one of very important plant steroidal hormones that are essential in a wide variety of physiological processes. In this study, an encoding brassinosteroid receptor homologous gene was cloned by homology cloning from maize B73 inbred lines, and designated as ZmBRI1. Sequence analysis revealed that the full length of ZmBRI1 was 3369 bp, encoding 1122 amino acids. Moreover, ZmBRI1 protein was localized in cell membrane by the protein subcellular localization analysis and a ubiquitously expressed receptor kinase expressed highly in young tissues. The transformation of ZmBRI1 into the Arabidopsis dwarf mutant bri1-5 restored the phenotype, including plant height, leaf morphology and pod size. Compared with bri1-5, in the transgenic plants, brassinolide (BL) inhibited significantly the root growth, propiconazole (Pcz) inhibited the hypocotyl growth, and the expression levels of DWF4 and CPD were decreased. Furthermore, compared with the wild type, with ABA treatment, overexpression of ZmBRI1 in the wild type increased the germination rate and plant growth, and decreased the expression of ABA downstream genes RD29A, RD29B, ABI5, and RAB18. Therefore, ZmBRI1 is not only involved in plant morphogenesis and BR signal transduction, but also plays a pivotal role in response to ABA signal.

Maize; ZmBRI1; Transgenic plant; Brassinosteroid; ABA

(

): 2017-02-23; Accepted(接受日期): 2017-05-10; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-05-23.

10.3724/SP.J.1006.2017.01261

本研究由引進(jìn)國際先進(jìn)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)計劃(948計劃)項目(2011-G19)資助。

This study was supported by the Introduction of International Advanced Agricultural Science and Technology Program (948 Program, 2011-G19).

*通訊作者(Corresponding author): 張明才, E-mail: zmc1214@163.com, Tel: 010-62733049

聯(lián)系方式: E-mail: hao_ling2011@163.com

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170523.1856.010.html