HPLC法同時(shí)測(cè)定六味能消丸中8種成分的含量

康 慧，劉亞蓉（1.青海省人民醫(yī)院藥房，西寧 810008；2.青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，西寧 810016）

HPLC法同時(shí)測(cè)定六味能消丸中8種成分的含量

康 慧1＊，劉亞蓉2#（1.青海省人民醫(yī)院藥房，西寧 810008；2.青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，西寧 810016）

目的：建立同時(shí)測(cè)定六味能消丸中土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、沒食子酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Diamonsil C18，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm（土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚）、270 nm（沒食子酸），柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、沒食子酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍分別為0.121～3.63 μg（r＝0.999 9）、0.122～3.66 μg（r＝0.999 9）、0.219～6.57 μg（r＝0.999 9）、0.016 4～0.492 μg（r＝0.999 7）、0.017 3～0.519 μg（r＝0.999 9）、0.015 3～0.459 μg（r＝0.999 9）、0.007 2～0.216 μg（r＝0.999 9）、0.016 2～0.486 μg（r＝0.999 9）；定量限分別為0.41、0.26、0.35、0.13、0.17、0.14、0.15、0.13 ng，檢測(cè)限分別為0.12、0.08、0.11、0.04、0.05、0.04、0.05、0.04 ng；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為98.05%～102.46%（RSD＝1.75%，n＝6）、98.55%～102.89%（RSD＝1.91%，n＝6）、98.53%～102.34%（RSD＝1.66%，n＝6）、101.71%～103.41%（RSD＝0.57%，n＝6）、101.04%～103.01%（RSD＝0.69%，n＝6）、101.63%～102.75%（RSD＝0.39%，n＝6）、96.94%～101.11%（RSD＝1.61%，n＝6）、98.06%～99.10%（RSD＝0.40%，n＝6）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，可用于六味能消丸中8種成分含量的同時(shí)測(cè)定。

六味能消丸；土木香內(nèi)酯；異土木香內(nèi)酯；沒食子酸；大黃素；蘆薈大黃素；大黃酸；大黃素甲醚；大黃酚；高效液相色譜法；含量

藏藥是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分，尤其在治療心血管、消化系統(tǒng)等慢性病方面獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。藏成藥六味能消丸由藏木香、干姜、訶子、大黃、寒水石、堿花6味中藥組成，具有助消化、消腫、理風(fēng)和胃的功效[1]。六味能消丸現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部頒藏藥標(biāo)準(zhǔn)》（第一冊(cè)）[2]，藏文名稱西切周巴日布；現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅有1個(gè)理化鑒別反應(yīng)，無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)，無(wú)法全面控制該制劑的質(zhì)量。鑒于此，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時(shí)測(cè)定六味能消丸中藏木香主要成分（土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯）[3]、訶子主要成分（沒食子酸）[4-5]、大黃主要成分（大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚）[6]含量的方法[7]，以期為完善該制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀，包括2998型光電二極管陣列檢測(cè)器、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower工作站（美國(guó)Waters公司）；XS105DU型十萬(wàn)分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；CPA225D型萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；B2500S-MT型超聲波清洗器（上海必能信超聲清洗有限公司）；Milli-QAdvantageA10型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

六味能消丸（青海省格拉丹東藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20140401、20140702、20150106，規(guī)格：0.3 g/丸；西藏藏醫(yī)學(xué)院藏藥有限公司，批號(hào)：20141211、20150306，規(guī)格：0.6 g/丸）；土木香內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：110760-200507）、異土木香內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)：110761-200203）、沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)：110831-201204）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-200110）、蘆薈大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110795-9803）、大黃酸對(duì)照品（批號(hào)：110757-200206）、大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)：110758-201013）、大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：110796-201017%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均＞98%；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-乙腈（B）-0.1%冰醋酸溶液（C），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm（土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚）、270 nm（沒食子酸）；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution process

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、沒食子酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含上述成分0.231、0.256、1.190、0.173、0.153、0.164、0.162、0.072 mg的單一對(duì)照品貯備液。分別精密吸取上述單一對(duì)照品貯備液各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成每1 mL分別含上述成分0.023 1、0.025 6、0.119 0、0.017 3、0.015 3、0.016 4、0.016 2、0.007 2 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品粉末（過(guò)40目篩）約0.5 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：110 W，頻率：42 kHz，下同）處理30 min，放至室溫，再次稱定質(zhì)量，加甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的制備工藝和處方比例制備缺藏木香、訶子、大黃的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)均＞4 000。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、5、10、15、20、25、30μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x，μg）、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

2.5 定量限（LOQ）與檢測(cè)限（LOD）考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得LOD，結(jié)果見表3。

表2 回歸方程與線性范圍Tab 2 Regression equations and linear ranges

表3 LOQ與LOD測(cè)定結(jié)果（ng）Tab 3 Determination results of LOQ and LOD（ng）

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、沒食子酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚峰面積的RSD分別為0.87%、1.12%、0.96%、0.97%、1.27%、1.33%、1.82%、1.64%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20140401）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、沒食子酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚峰面積的RSD分別為1.22%、1.29%、1.71%、1.47%、1.62%、1.55%、1.39%、1.66%（n＝8），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品粉末（批號(hào)：20140401）約0.5 g，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、沒食子酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚的含量平均值分別為1.02、1.11、4.76、0.33、0.34、0.65、0.15、0.52 mg/g，RSD分別為1.27%、1.36%、1.51%、1.44%、1.72%、1.98%、1.02%、0.96%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：20140401）適量，共6份，分別置于100 mL量瓶中，各加入一定質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 4 Results of recovery tests（n＝6）

2.10 樣品含量測(cè)定結(jié)果

取5批樣品粉末各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 5 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

本試驗(yàn)曾考察了甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.1%冰醋酸溶液和乙腈-0.1%冰醋酸溶液等二相流動(dòng)相在系統(tǒng)不同梯度條件下進(jìn)行洗脫時(shí)的色譜分離情況[8-11]，結(jié)果均未獲得滿意的分離效果；后采用甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸溶液三相流動(dòng)相系統(tǒng)在文中所示梯度洗脫程序下進(jìn)行洗脫，色譜分離均較好，因此選擇上述流動(dòng)相為本試驗(yàn)的最終流動(dòng)相。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本試驗(yàn)采用光電二級(jí)檢測(cè)器在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)“2.2.1”項(xiàng)下的單一對(duì)照品貯備液進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描，由紫外掃描結(jié)果可知，土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚在254 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，沒食子酸在270 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，因此選擇本試驗(yàn)的測(cè)定波長(zhǎng)為254 nm和270 nm。

3.3 提取溶劑和提取方式的選擇

本試驗(yàn)曾考察了不同的提取溶劑（50%甲醇溶液、75%甲醇溶液、甲醇、95%乙醇溶液）[12-13]，不同的提取方式（超聲處理20、30、40 min，回流30 min、冷浸4 h后提取）。結(jié)果，甲醇超聲處理30 min的提取率最高，且操作簡(jiǎn)單，因此選擇上述提取溶劑和提取方式處理樣品。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，可用于六味能消丸中8種成分含量的同時(shí)測(cè)定。

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（編輯：劉 柳）

Simultaneous Determination of 8 Components in Liuwei Nengxiao Pills by HPLC

KANG Hui1，LIU Yarong2（1.Dept.of Pharmacy，Qinghai Provincial People’s Hospital，Xining 810008，China；2. Qinghai Institute for Drug Control，Xining 810016，China）

OBJECTIVE：To establish the method for simultaneous determination of alantolactone，isoalantolactone，gallic acid，emodin，aloe-emodine，rhein，physcion and chrysophanol in Liuwei nengxiao pills.METHODS：HPLC method was adopted. The determination was performed on Diamonsil C18with mobile phase consisted of methanol-acetonitrile-0.1%glacial acetic acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelengths were set at 254 nm（alantolactone，isoalantolactone，emodin，aloe-emodine，rhein，physcion and chrysophanol），270 nm（gallic acid）.The column temperature was 25℃，and sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of alantolactone，isoalantolactone，gallic acid，emodin，aloe-emodine，rhein，physcion，chrysosphanol were 0.121-3.63 μg（r＝0.999 9），0.122-3.66 μg（r＝0.999 9），0.219-6.57 μg（r＝0.999 9），0.016 4-0.492 μg（r＝0.999 7），0.017 3-0.519 μg（r＝0.999 9），0.015 3-0.459 μg（r＝0.999 9），0.007 2-0.216 μg（r＝0.999 9），0.016 2-0.486（r＝0.999 9）.The limits of quantification were 0.41，0.26，0.35，0.13，0.17，0.14，0.15，0.13 ng；limits of detection were 0.12，0.08，0.11，0.04，0.05，0.04，0.05，0.04 ng.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%.The recoveries were 98.05%-102.46%（RSD＝1.75%，n＝6），98.55%-102.89%（RSD＝1.91%，n＝6），98.53%-102.34%（RSD＝1.66%，n＝6），101.71%-103.41%（RSD＝0.57%，n＝6），101.04%-103.01%（RSD＝0.69%，n＝6），101.63%-102.75%（RSD＝0.39%，n＝6），96.94%-101.11%（RSD＝1.61%，n＝6），98.06%-99.10%（RSD＝0.40%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is accurate，simple and suitable for simultaneous determination of 8 components in Liuwei nengxiao pills.

Liuwei nengxiao pill；Alantolactone；Isoalantolactone；Gallic acid；Emodin；Aloe-emodine；Rhein；Physcion；Chrysophanol；HPLC；Content

R927.2

A

1001-0408（2017）24-3433-04

2017-03-15

2017-05-03）

＊主管藥師。研究方向：中藏藥質(zhì)量控制。電話：0971-8066232。E-mail：736211102@qq.com

#通信作者：主任藥師。研究方向：中藏藥檢驗(yàn)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：0971-8232182

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.24.35