頂空氣相色譜法同時測定法匹拉韋原料藥中5種有機溶劑的殘留量Δ

劉葵葵，鄧玉曉，邢學敏，王 伶（山東省藥學科學院化學藥物重點實驗室，濟南 250101）

頂空氣相色譜法同時測定法匹拉韋原料藥中5種有機溶劑的殘留量Δ

劉葵葵＊，鄧玉曉，邢學敏，王 伶#（山東省藥學科學院化學藥物重點實驗室，濟南 250101）

目的：建立同時測定法匹拉韋原料藥中乙醇、丙酮、乙酸乙酯、N，N-二異丙基乙胺、甲苯5種有機溶劑殘留量的方法。方法：采用頂空氣相色譜法。色譜柱為DB-624毛細管柱，程序升溫，進樣口溫度為220℃，檢測器為氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度為250℃，載氣為氮氣，載氣流速為2.0 mL/min，分流比為10∶1，頂空平衡溫度為80℃，平衡時間為20 min，頂空進樣量為1 mL。結果：乙醇、丙酮、乙酸乙酯、N，N-二異丙基乙胺和甲苯檢測質量濃度線性范圍分別為10.0～501.4 μg/mL（r＝0.999 9）、10.0～501.4 μg/mL（r＝0.999 9）、10.1～502.6 μg/mL（r＝0.999 9）、0.2～11.4 μg/mL（r＝0.999 9）、1.8～89.4 μg/mL（r＝0.999 7）；定量限分別為5.3、3.4、5.2、6.1、20.4 μg/mL，檢測限分別為1.4、1.1、1.3、1.6、5.9 μg/mL；精密度試驗的RSD＜4.0%，穩(wěn)定性、重復性試驗中只檢出丙酮，其RSD＜4.0%；加樣回收率分別為96.61%～99.70%（RSD＝1.01%，n＝9）、95.81%～99.50%（RSD＝1.29%，n＝9）、96.42%～99.76%（RSD＝1.24%，n＝9）、96.36%～99.30%（RSD＝1.19%，n＝9）、97.00%～99.51%（RSD＝0.82%，n＝9）。結論：該方法簡單、準確、重復性好，可用于法匹拉韋原料藥中5種有機溶劑殘留量的同時測定。

氣相色譜法；法匹拉韋；有機溶劑；殘留量；乙醇；丙酮；乙酸乙酯；N，N-二異丙基乙胺；甲苯

法匹拉韋（Favipiravir）為日本富士膠片公司旗下富山化學工業(yè)公司研發(fā)的流感治療藥物，2011年3月在日本完成Ⅲ期臨床試驗，2014年3月在日本批準上市[1]。法匹拉韋是一種病毒RNA聚合酶抑制劑，能夠阻斷病毒RNA的合成，從而起到抗病毒的作用，同時法匹拉韋對哺乳動物細胞內的RNA合成不會產(chǎn)生任何抑制作用，因此是一種安全有效的抗病毒藥物。由于其特定的作用機制，除流感病毒外，法匹拉韋還可以對抗其他多種RNA病毒，如黃熱病、埃博拉等[2-4]。

目前已有相關文獻報道了法匹拉韋制劑中相關含量的測定[5]，但尚未見有關法匹拉韋原料藥中有機溶劑殘留量測定的報道；且根據(jù)法匹拉韋的合成工藝，生產(chǎn)中分別使用了N，N-二異丙基乙胺、乙酸乙酯、甲苯、丙酮和乙醇等有機溶劑。為確保藥品的安全、有效和質量可控，筆者采用頂空氣相色譜法建立了同時測定法匹拉韋原料藥中上述5種有機溶劑殘留量的方法[6-8]。

1 材料

1.1 儀器

6890N型氣相色譜儀，包含氫火焰離子化檢測器（FID）和7697A頂空自動進樣器（美國Agilent公司）；BS 210S型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；ZUPT-I-20T型超純水機（臺灣艾柯公司）。

1.2 藥品與試劑

法匹拉韋原料藥（山東省藥學科學院化學藥物重點實驗室自制，批號：20151001、20151002、20151003）；乙醇對照品（批號：20150611：純度：99.8%）、丙酮對照品（批號：20140116：純度：99.7%）、乙酸乙酯對照品（批號：20150813：純度：99.6%）、N，N-二異丙基乙胺對照品（批號：20150507：純度：99.5%）、甲苯對照品（批號：20150106：純度：99.8%）均購自國藥集團化學試劑有限公司；N，N-二甲基甲酰胺為色譜純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：DB-624毛細管柱（30 m×0.53 mm，3.0 μm）；升溫程序：初始溫度為50℃，保持3 min，以10℃/min升溫至180℃，保持2 min；進樣口溫度：220℃；檢測器：FID；檢測器溫度：250℃；載氣：氮氣；載氣流速：2.0 mL/min；分流比：10∶1；頂空平衡溫度：80℃；平衡時間：20 min；頂空進樣量：1 mL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別稱取乙醇、丙酮、乙酸乙酯、N，N-二異丙基乙胺、甲苯對照品適量，置于同一100 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺溶解并定容，搖勻，制成每1 mL含乙醇500 μg、丙酮500 μg、乙酸乙酯500 μg、N，N-二異丙基乙胺11.4 μg、甲苯89 μg的混合對照品貯備液。精密量取上述混合對照品貯備液5 mL，置于50 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取樣品0.5 g，置于10 mL頂空瓶中，精密加入N，N-二甲基甲酰胺5 mL，密封，振搖使溶解，即得。

2.2.3 空白對照溶液 精密量取N，N-二甲基甲酰胺5 mL作為空白對照溶液，置于頂空瓶中，密封。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞6；理論板數(shù)以乙醇峰計為58 688，保留時間為6.862 min。結果表明，其他成分對測定無干擾。

2.4 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品貯備液1、2、5、10、25 mL，分別置于50 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各5 mL，分別置于頂空瓶中，密封，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

圖1 氣相色譜圖Fig 1 GC chromatograms

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ；當信噪比為3∶1時，得LOD。結果，乙醇、丙酮、乙酸乙酯、N，N-二異丙基乙胺、甲苯的LOQ分別為5.3、3.4、5.2、6.1、20.4 μg/mL，LOD分別為1.4、1.1、1.3、1.6、5.9 μg/mL。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結果，乙醇、丙酮、乙酸乙酯、N，N-二異丙基乙胺、甲苯峰面積的RSD分別為3.5%、2.6%、1.9%、3.4%、2.8%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20151001）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，只檢出丙酮，其峰面積的RSD＝2.4%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置8 h內穩(wěn)定性良好。

2.8 重復性試驗

取樣品（批號：20151001）適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算待測有機溶液殘留量。結果，只檢出丙酮，其殘留量平均值為0.04%，RSD＝1.86%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取樣品（批號：20151001）適量，共9份，各置于10 mL量瓶中，分別加入低、中、高質量的待測有機溶劑對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表2。

2.10 樣品有機溶劑殘留量測定

取3批樣品（批號：20151001、20151002、20151003）各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并以外標法計算待測有機溶劑的殘留量。結果，3批樣品中均只檢出丙酮，殘留量分別為0.04%、0.03%、0.05%（n＝3）。

3 討論

3.1 進樣方式的選擇

雖然直接進樣相比頂空進樣操作簡單，但是本研究的待測有機溶劑在高溫條件下可分解出揮發(fā)性產(chǎn)物，干擾溶劑的測定，故本研究采用頂空進樣[9-10]。

3.2 色譜柱的選擇

筆者考察了不同極性的毛細管柱（DB-1、DB-wax、HP-5、DB-624），結果采用HP-5毛細管柱進行測定時，乙醇和丙酮不能完全分離；采用DB-1、DB-wax毛細管柱進行測定時，N，N-二異丙基乙胺峰對稱性差；采用DB-624毛細管柱進行測定時，待測有機溶劑峰之間的分離度符合要求，峰對稱性良好[10]。因此，選擇DB-624毛細管柱為本試驗的色譜柱。

3.3 溶劑的選擇

法匹拉韋的水溶性較差，待測有機溶劑甲苯也不溶于水。頂空氣相色譜法常用溶劑為水、N，N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜，經(jīng)考察法匹拉韋在N，N-二甲基甲酰胺中溶解性比在二甲基亞砜中好，且N，N-二甲基甲酰胺在待測有機溶劑之后出峰，對待測有機溶劑無干擾，故選用N，N-二甲基甲酰胺作為本試驗的溶劑。

3.4 頂空平衡溫度的考察

本研究比較了不同頂空平衡溫度（70、80、90℃），結果發(fā)現(xiàn)頂空平衡溫度為80℃時待測有機溶劑峰的靈敏度與重復性最佳，且樣品完全溶解，故選擇80℃作為本試驗的頂空平衡溫度。

3.5 LOD的確定

根據(jù)2015年版《中國藥典》（四部）“通則0861”的要求，乙醇、丙酮、乙酸乙酯和甲苯的檢測限分別為0.5%、0.5%、0.5%、0.089%，未規(guī)定N，N-二異丙基乙胺的LOD?！稓W洲藥品質量管理局（EDQM）關于化學純度和微生物質量方面的文檔要求》規(guī)定了N，N-二異丙基乙胺的最大日用量為38.8 mg，且其LOD為0.388%，因此可將該原料藥中的N，N-二異丙基乙胺的LOD暫定為0.388%[11]。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

綜上所述，本方法簡單、準確、重復性好，可用于法匹拉韋原料藥中5種有機溶劑殘留量的同時測定。

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Simultaneous Determination of 5 Organic Solvents in Favipiravir by Headspace GC

LIU Kuikui，DENG Yuxiao，XING Xuemin，WANG Ling（Key Laboratory for Chemical Drug Research，Shandong Academy of Pharmaceutical Science，Jinan 250101，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of 5 kinds residual ethanol，acetone，ethylacetate，N，N-diisopropylethylamine and toluene in favipiravir.METHODS：Headspace GC was adopted.The determination was performed on DB-624 capillary column，temperature programmed.The inlet temperature was 220℃，and detector was flame ionization detector with temperature of 250℃.Nitrogen was used as carrier gas at flow rate of2.0 mL/min，split ratio was 10∶1，headspace equilibrium temperature was 80℃，equilibrium time was 20 min and headspace sample size was 1 mL.RESULTS：The linear range was 10.0-501.4 μg/mL for ethanol（r＝0.999 9），10.0-501.4 μg/mL for acetone（r＝0.999 9），10.1-502.6 μg/mL for ethylacetate（r＝0.999 9），0.2-11.4 μg/mL for N，N-diisopropylethylamine（r＝0.999 9）and 1.8-89.4 μg/mL for acetone（r＝0.999 7）. The limits of quantification were 5.3，3.4，5.2，6.1 and 20.4μg/mL，and the limits of detection were 1.4，1.1，1.3，1.6，5.9μg/ mL.RSD of precision test was lower than 4.0%，and RSDs of acetone in stability and reproducibility tests were both lower than 4.0%.The recoveries were 96.61%-99.70%（RSD＝1.01%，n＝9），95.81%-99.50%（RSD＝1.29%，n＝9），96.42%-99.76%（RSD＝1.24%，n＝9），96.36%-99.30%（RSD＝1.19%，n＝9），97.00%-99.51%（RSD＝0.82%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，reproducible and can be used for simultaneous determination of 5 organic solvents in favipiravir.

Gas chromatography；Favipiravir；Organic solvents；Residual；Ethanol；Acetone；Ethylacetate；N，N-diisopropylethylamine；Toluene

R927.2

A

1001-0408（2017）24-3415-04

2017-02-06

2017-04-29）

（編輯：劉 柳）

山東省自然科學基金資助項目（No.ZR2013HQ043）

＊工程師。研究方向：新藥研發(fā)。電話：0531-88562280。E-mail：Srhlksdu2008@sina.com

#通信作者：高級工程師，碩士。研究方向：新藥研發(fā)。電話：0531-88562280。E-mail：lw6624@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.24.30