黔產(chǎn)喜樹(shù)葉的HPLC指紋圖譜研究及聚類分析Δ

劉志海，范紅梅，鄒 蘭，隆 林，金 昭，余 蘭（貴州省黔西南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州興義562400）

黔產(chǎn)喜樹(shù)葉的HPLC指紋圖譜研究及聚類分析Δ

劉志海＊，范紅梅，鄒 蘭，隆 林，金 昭，余 蘭（貴州省黔西南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州興義562400）

目的：建立黔產(chǎn)喜樹(shù)葉的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：采用HPLC法。色譜柱為Gemini-NX C18，流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為370 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。以山柰素為參照物，測(cè)定14批喜樹(shù)葉藥材的HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A）進(jìn)行共有峰指認(rèn)、相似度評(píng)價(jià)，并進(jìn)行聚類分析。結(jié)果：14批喜樹(shù)葉藥材的HPLC圖譜共有10個(gè)共有峰，13批喜樹(shù)葉藥材與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度＞0.90，1批與對(duì)照?qǐng)D譜相似度＜0.90。喜樹(shù)葉藥材樣品可歸為3大類。結(jié)論：該研究所建指紋圖譜可為黔產(chǎn)喜樹(shù)葉的鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

喜樹(shù)葉；指紋圖譜；聚類分析；高效液相色譜法

喜樹(shù)葉為藍(lán)果樹(shù)科喜樹(shù)屬植物喜樹(shù)Camptotheca acuminata Decne的葉，喜樹(shù)是我國(guó)特有樹(shù)種，主要分布在長(zhǎng)江流域及西南各省[1]，多選其果實(shí)、根、根皮、樹(shù)皮、葉入藥。喜樹(shù)葉具有清熱解毒、祛風(fēng)止癢之功效，主治癰瘡癤腫、牛皮癬。據(jù)文獻(xiàn)研究報(bào)道，喜樹(shù)葉中含喜樹(shù)堿、10-羥基喜樹(shù)堿、槲皮素和山柰酚等有效成分[2]。喜樹(shù)在貴州各地分布較為廣泛，2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載了喜樹(shù)果的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但未收載喜樹(shù)葉[3]。為全面提升我省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)開(kāi)展對(duì)喜樹(shù)葉藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。本研究參考文獻(xiàn)[4]，結(jié)合我省資源情況，收集了貴州8個(gè)地州市共計(jì)14批喜樹(shù)葉藥材樣本，對(duì)其進(jìn)行指紋圖譜及聚類分析研究，以期為喜樹(shù)葉的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜（HPLC）儀，包括2998 DAD檢測(cè)器、Empower色譜數(shù)據(jù)工作站（美國(guó)Waters公司）；CPA225D型十萬(wàn)分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；AY220型萬(wàn)分之一電子分析天平（日本Shimadzu公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑

槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：100081-201509，純度：98.6%）、山柰素對(duì)照品（批號(hào)：110861-201310，純度：93.2%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

喜樹(shù)葉藥材樣品均采于貴州省，共14批（見(jiàn)表1），經(jīng)貴州省食品藥品檢驗(yàn)所李陽(yáng)教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Gemini-NX C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，22%A；20～40 min，22%→35%A；40～60 min，35%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：370 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 喜樹(shù)葉藥材來(lái)源Tab 1 Source of C.acuminate

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取槲皮素對(duì)照品14.01 mg，加甲醇定容至100 mL，量取5 mL，置于25 mL量瓶中，制成槲皮素對(duì)照品溶液；精密稱取山柰素對(duì)照品適量，置于上述裝有槲皮素對(duì)照品溶液的25 mL量瓶中，搖勻，制成槲皮素、山柰素質(zhì)量濃度分別為27.63、19.96 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 將藥材樣品置于干燥的室內(nèi)自然風(fēng)干，粉碎后過(guò)4號(hào)篩，備用。取藥材樣品粉末約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入5%鹽酸甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，水浴回流1 h，取出，放冷；再次稱定質(zhì)量，用5%鹽酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，以山柰素的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，10個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.3%，相對(duì)峰面積的RSD＜1.2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（No.5）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，以山柰素的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，10個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.4%，相對(duì)峰面積的RSD＜1.1%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（No.5）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以山柰素的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，10個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.7%，相對(duì)峰面積的RSD＜0.6%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相關(guān)數(shù)據(jù)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取14批藥材樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A）對(duì)14批藥材樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 14批藥材樣品HPLC疊加指紋圖譜Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 14 batches of samples

圖2 藥材樣品HPLC對(duì)照指紋圖譜Fig 2 HPLC control fingerprint of samples

2.4.2 相似度與各共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2004 A）對(duì)14批藥材樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。14批藥材樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2；各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見(jiàn)表3、表4。

2.5 聚類分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件與歐氏距離分層聚類法中的Ward法對(duì)14批藥材樣品指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積進(jìn)行聚類分析[4]，詳見(jiàn)圖3。結(jié)果，14批藥材樣品分為3大類，其中3、4、6、7、9、11、12、13批藥材樣品為一類，8、10批藥材樣品為一類，1、2、5、14批藥材樣品為一類，但1和2、5、14批藥材樣品歐氏距離稍大，也可以將1批藥材樣品再細(xì)分為一類。在指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)中，1批藥材樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均＜0.90；其余13批藥材樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度＞0.90。由此可知，聚類分析結(jié)果和相似度評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致，兩種方法相互印證。

3 討論

3.1 樣品提取條件的優(yōu)化

筆者以61%乙醇溶液超聲處理30 min制成供試品溶液，得到的色譜圖峰較少。后改以5%鹽酸甲醇溶液水浴回流1 h提取得到的色譜圖中色譜峰較多，且分離度均較好，因此本試驗(yàn)以上述方法進(jìn)行樣品提取。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

筆者參考文獻(xiàn)[5]，分別以甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50，V/V）和乙腈-0.3%磷酸溶液（24∶76，V/V）為流動(dòng)相，進(jìn)行等度洗脫。結(jié)果，色譜峰部分重疊，且特征峰少，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，最終確定以乙腈-0.2%磷酸溶液作為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，藥材樣品所得特征峰多，且峰形較好。

表2 14批藥材樣品相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Similarity evaluation of 14 batches of samples

表3 14批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間Tab 3 The relative retention time for common peaks in HPLC fingerprints of 14 batches of samples

表4 14批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的的相對(duì)峰面積Tab 4 The relative peak areas for common peaks in HPLC fingerprints of 14 batches of samples

3.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

圖3 14批藥材樣品聚類分析樹(shù)狀圖Fig 3 The cluster analysis dendrogram for 14 batches of samples

試驗(yàn)中，筆者應(yīng)用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)藥材樣品進(jìn)行了全波段檢測(cè)，結(jié)果在370 nm波長(zhǎng)處，相對(duì)吸收峰比較多，基本能反映出藥材樣品的整體效果，在線性梯度洗脫時(shí)，基線基本平穩(wěn)，所以確定檢測(cè)波長(zhǎng)為370 nm。

筆者通過(guò)建立喜樹(shù)葉藥材的指紋圖譜，采用相似度評(píng)價(jià)軟件對(duì)來(lái)自貴州不同產(chǎn)地的喜樹(shù)葉藥材進(jìn)行比較分析，可知貴州不同產(chǎn)地14批喜樹(shù)葉藥材指紋圖譜總體差異較小，但可能由于喜樹(shù)葉采集的季節(jié)不同，使得個(gè)別樣品（No.1）的指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜相似度較低，質(zhì)量較為一般。本研究所建鑒別方法可為完善喜樹(shù)葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供借鑒，進(jìn)一步為喜樹(shù)葉藥材收入《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》提供參考。

[1] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1983：144.

[2] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編輯委員會(huì).中華本草：第5冊(cè)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：733.

[3] 閻秀峰，王洋，于濤，等.喜樹(shù)葉中喜樹(shù)堿含量的高效液相色譜分析[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2002，21（2）：15-18.

[4] 黃瑋，周云慶，楊洪元，等.膽黃潤(rùn)腸丸指紋圖譜的聚類分析[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2016，36（9）：719-723.

[5] 秦慶芳，粟本超.廣西不同地區(qū)喜樹(shù)嫩葉中喜樹(shù)堿含量測(cè)定[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，34（3）：388-391.

Study on HPLC Fingerprint and Cluster Analysis of the Leaves of Camptotheca acuminate in Guizhou

LIU Zhihai，F(xiàn)AN Hongmei，ZOU Lan，LONG Lin，JIN Zhao，YU Lan（Guizhou Qianxinan Prefecture Center for Food and Drug Inspection，Guizhou Xingyi 562400，China）

OBJECTIVE：To establish HPLC fingerprint for the leaves of Camptotheca acuminante in Guizhou.METHODS：HPLC method was performed.The determination was performed on Gemini-NX C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 370 nm，and the column temperature maintained at 30℃.The sample size was 10 μL.Using sorbitol as a reference，HPLC fingerprints of 14 batches of the leaves of C.acuminante were determined.The chromatographic fingerprint was analyzed with Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM（2004 A）in terms of common peak indentification，similarity evaluation and cluster analysis.RESULTS：There were 10 common peaks in HPLC fingerprints for 14 batches of the leaves of C.acuminate.And the similarity of 13 batches of the leaves of C.acuminate was greater than 0.90，and that of another one was less than 0.90.The leaves of C. acuminate were classified into 3 groups.CONCLUSIONS：The established fingerprint can provide reference for identification and quality evaluation of the leaves of C.acuminate.

The leaves of Camptotheca acuminante；Fingerprint；Cluster analysis；HPLC

R917

A

1001-0408（2017）24-3412-03

2017-01-18

2017-04-26）

（編輯：張 靜）

貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究課題（No. DBXZYC52032）

＊主管中藥師。研究方向：中藥、中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：19889504@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.24.29