HPLC法同時測定小兒化毒散中3種成分的含量Δ

曾 楨，艾光麗，李婷婷，文永盛，周世玉#（.成都市食品藥品檢驗研究院，成都 60045；.成都中醫(yī)藥大學藥學院，成都 630）

HPLC法同時測定小兒化毒散中3種成分的含量Δ

曾 楨1＊，艾光麗2，李婷婷1，文永盛1，周世玉1#（1.成都市食品藥品檢驗研究院，成都 610045；2.成都中醫(yī)藥大學藥學院，成都 611130）

目的：建立同時測定小兒化毒散中芍藥苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Waters SunFireTM-C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為238 nm，柱溫為25℃，進樣量為10μL。結(jié)果：芍藥苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為8.808～88.08 μg/mL（r＝0.999 8）、1.778～17.78 μg/ mL（r＝0.999 6）、2.533～25.33 μg/mL（r＝0.999 9）；定量限分別為4.404、0.889、2.533 μg/mL，檢測限分別為1.101、0.445、1.267 μg/ mL；精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗的RSD＜2%；加樣回收率分別為95.08%～99.61%（RSD＝1.77%，n＝9）、96.93%～99.94%（RSD＝0.92%，n＝9）、98.33%～102.05%（RSD＝1.27%，n＝9）。結(jié)論：該方法簡單、準確、重復性好，可用于小兒化毒散中芍藥苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨含量的同時測定。

小兒化毒散；高效液相色譜法；芍藥苷；鹽酸小檗堿；甘草酸銨

小兒化毒散是中醫(yī)兒科經(jīng)典方劑，由人工牛黃、珍珠、天花粉、雄黃、大黃、黃連、赤芍、甘草等中藥材組成，具有清熱解毒、活血消腫的功效，主要用于熱毒內(nèi)蘊、毒邪未盡所致的口瘡腫痛、瘡瘍潰爛、煩躁口渴、大便秘結(jié)等的治療[1-3]。其現(xiàn)行質(zhì)量標準收載于2015年版《中國藥典》（一部）[4]，僅對黃連、甘草、天花粉、雄黃、大黃、珍珠進行了顯微鑒別，對黃連、大黃、人工牛黃進行了薄層鑒別，無含量測定項?，F(xiàn)有文獻表明，該方劑中的赤芍、黃連、甘草為主要用于治療癰腫瘡瘍的藥味，且其主要成分分別為芍藥苷[5-6]、鹽酸小檗堿[7-8]、甘草酸銨[9-11]。為完善該制劑的質(zhì)量控制，在現(xiàn)有文獻報道基礎(chǔ)上[12-13]，本課題組采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定小兒化毒散中芍藥苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨含量的方法。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，配置有自動進樣器、光電二極管陣列檢測器、四元泵、在線真空脫氣機、LC1260色譜工作站（美國Agilent公司）；AE-240型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；AUX-220型萬分之一電子分析天平（日本Shimadzu公司）；SK250H型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；Milli-Q AdvantageA10型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑

小兒化毒散（A廠，批號：140707、160905、160904、160603、150401、160906，規(guī)格：6 g/袋）；芍藥苷對照品（批號：110736-201539，純度：96.4%）、鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-200911，純度：86.8%）、甘草酸銨對照品（批號：110731-201619，純度：93.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters SunFireTM-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，20%A；5～20 min，20%→50%A；20～25 min，50%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：238 nm；柱溫：25℃；進樣量：10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取芍藥苷對照品22.842 4 mg、鹽酸小檗堿對照品9.559 4 mg、甘草酸銨對照品7.295 5 mg，分別置于25、50、50 mL棕色量瓶中，加50%乙醇溶液溶解并定容，搖勻，作為單一對照品貯備液。分別精密吸取上述單一對照品貯備液各適量，置于同一10 mL棕色量瓶中，加50%乙醇溶液定容，搖勻，即得芍藥苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨質(zhì)量濃度分別為88.08、17.78、25.33 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品10袋，研細，取約0.6 g，精密稱定，置于150 mL錐形瓶中，精密加入50%乙醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 w，頻率：53 kHz，下同）處理30 min，放冷至室溫，加50%乙醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的處方比例和制備工藝，制備缺赤芍、黃連、甘草的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以芍藥苷峰計≥7 000，保留時間約6.25 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0 mL，分別置于5 mL棕色量瓶中，加50%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為系列混合對照品溶液。精密吸取上述系列混合對照溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以芍藥苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab 1 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ；當信噪比為3∶1時，得LOD。結(jié)果，芍藥苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨的LOQ分別為4.404、0.889、2.533 μg/mL；LOD分別為1.101、0.445、1.267 μg/mL。

2.6 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液10μL，按“2.1”項下色譜條件重復進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.09%、0.32%、0.25%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密吸取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：140707）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.69%、1.88%、1.01%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

取同一批樣品（批號：140707）約0.6 g，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果，芍藥苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨含量的平均值分別為8.20、3.10、1.01 mg/g，RSD分別為1.84%、1.58%、1.43%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的同一批樣品（批號：140707）適量，共6份，每份約0.3 g，精密稱定，各置于100 mL棕色量瓶中，分別加入低、中、高質(zhì)量的芍藥苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.10 樣品含量測定

取6批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 供試品溶液提取條件的選擇

本試驗考察了不同的提取溶劑（不同體積分數(shù)的甲醇、乙醇）、提取方法（冷浸法、回流法、超聲法）、提取時間（20、30、40、60 min）對小兒化毒散中芍藥苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨提取率的影響。最終，優(yōu)選處理方法為50%乙醇溶液超聲提取30 min。

3.2 流動相的考察

本課題組分別以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.5%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.0）、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液為流動相，考察色譜情況。結(jié)果，乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相時較其他溶液基線平穩(wěn)，色譜峰分離度較好，故最終優(yōu)選乙腈-0.1%磷酸溶液為本試驗的流動相。

3.3 檢測波長的考察

在預試驗中，把芍藥苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨的單一對照品貯備液在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描。結(jié)果顯示，芍藥苷在230 nm波長處有最大吸收，鹽酸小檗堿在228、265、345 nm波長處有最大吸收，甘草酸銨在250 nm波長處有最大吸收；而在238 nm波長處，3種成分均有較大吸收，且均能達到較好的分離效果，綜合考慮，最終選擇238 nm作為本試驗的檢測波長。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

表3 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 3 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3.4 方法耐用性考察

本試驗還考察了不同品牌及不同型號的色譜柱[Agilent1200型Diamond C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters 1260型SunFireTM-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent 1200型 Diamond C18（200 mm×4.6mm，5 μm）]。結(jié)果，其峰面積的RSD均＜2.0%，表明本試驗的耐用性良好。

綜上所述，本方法簡單、準確、靈敏、重復性好、精密度高，可用于小兒化毒散中芍藥苷、鹽酸小檗堿、甘草酸銨含量的同時測定。

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Simultaneous Determination of 3 Components in Xiaoer Huadu Powder by HPLC

ZENG Zhen1，AI Guangli2，LI Tingting1，WEN Yongsheng1，ZHOU Shiyu1（1.Chengdu Institute for Food and Drug Control，Chengdu 610045，China；2.College of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611130，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of paeoniflorin，berberine hydrochloride and ammonium glycyrrhizinate in Xiaoer huadu powder.METHODS：HPLC method was adopted.The separation was performed on Waters SunFireTM-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 238 nm，and column temperature was 25℃.The sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of paeoniflorin，berberine hydrochloride and ammonium glycyrrhizinate were 8.808-88.08 μg/mL（r＝0.999 8），1.778-17.78 μg/mL（r＝0.999 6），2.533-25.33 μg/mL（r＝0.999 9），respectively.LOQ were 4.404，0.889，2.533 μg/ mL；LOD were 1.101，0.445，1.267 μg/mL.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2%.The recoveries were 95.08%-99.61%（RSD＝1.77%，n＝9），96.93%-99.94%（RSD＝0.92%，n＝9），98.33%-102.05%（RSD＝1.27%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate and reproducible，and can be used for simultaneous determination of paeoniflorin，berberine hydrochloride and ammonium glycyrrhizinate in Xiaoer huadu powder.

Xiaoer huadu powder；HPLC；Paeoniflorin；Berberine hydrochloride；Ammonium glycyrrhizinate

R927.2

A

1001-0408（2017）24-3405-04

2017-02-28

2017-04-28）

（編輯：劉 柳）

國家藥品標準提高暨2015年版藥典科研項目；成都市食品藥品監(jiān)督管理局項目（No.201703）

＊主管中藥師。研究方向：中藥質(zhì)量標準。電話：028-85362592。E-mail：zengzhen125@163.com

#通信作者：主任中藥師。研究方向：中藥質(zhì)量標準。電話：028-85362592。E-mail：zsyu9@sohu.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.24.27