HPLC法同時測定補骨脂藥材中補骨脂二氫黃酮和補骨脂酚的含量Δ

黃曉婧，周曉英，文永盛（成都市食品藥品檢驗研究院，成都 610045）

HPLC法同時測定補骨脂藥材中補骨脂二氫黃酮和補骨脂酚的含量Δ

黃曉婧＊，周曉英，文永盛#（成都市食品藥品檢驗研究院，成都 610045）

目的：建立同時測定補骨脂藥材中補骨脂二氫黃酮和補骨脂酚含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Shim-Pack VP-ODS，流動相為乙腈-水（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為246 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：補骨脂二氫黃酮、補骨脂酚檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為48.9～489 ng（r＝0.999 8）、784～7 840 ng（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為95.30%～99.63%（RSD＝1.45%，n＝9）、96.89%～100.82%（RSD＝1.36%，n＝9）。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于補骨脂藥材中補骨脂二氫黃酮和補骨脂酚含量的同時測定；不同輻照劑量下藥材樣品中待測成分的含量均無明顯變化。

補骨脂；補骨脂二氫黃酮；補骨脂酚；含量測定；高效液相色譜法

補骨脂為豆科植物補骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果實[1]，具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉的功能，臨床常用于治療腎陽不足、陽痿遺精、遺尿尿頻、腰膝冷痛、腎虛作喘、五更瀉泄等[2-3]?，F(xiàn)代藥理試驗證明，補骨脂藥材中2個重要的活性成分補骨脂二氫黃酮和補骨脂酚具有抗氧化活性、保護(hù)肝臟、性激素樣作用等，因此快速、準(zhǔn)確定量測定這兩個活性成分的含量對于補骨脂藥材的質(zhì)量評價具有重要的實際意義[4-10]。筆者以不同劑量鈷-60輻照補骨脂藥材[11-13]，建立高效液相色譜法（HPLC）同時測定該藥材中補骨脂二氫黃酮和補骨脂酚含量的方法，以期為補骨脂藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括光電二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；AUX-220型電子分析天平（日本Shimadzu公司）；AE-240型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；JY98型超聲波清洗儀（南京新辰生物科技有限公司）。

1.2 試劑

補骨脂二氫黃酮對照品（批號：2012032，純度：98.35%）、補骨脂酚對照品（批號：YM0316SB13，純度：98.00%）均購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材及處理

3批次（批號：G130605-1、G130605-2、G130605-3）補骨脂藥材樣品（每批次各10個輻照劑量，共計30批，No. S1～S30）由廣州市藥品檢驗所送至廣州輻銳高能技術(shù)有限公司輻照處理。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-Pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～30 min，30%→60%A；30～40 min，60%→70%A；40～50 min，70%→80%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：246 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取待測成分對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成補骨脂二氫黃酮、補骨脂酚質(zhì)量濃度分別為48.9、392μg/mL的單一對照品溶液。其中，補骨脂酚為油狀，難以準(zhǔn)確稱量，以整支裝量20 mg溶解，按含量98.00%計算，質(zhì)量濃度為392μg/mL。

2.2.2 供試品溶液 取藥材樣品0.12 g，精密稱定，置于25 mL棕色量瓶中，準(zhǔn)確加入甲醇25 mL，超聲（功率：250 W，頻率：53 kHz，下同）處理40 min，取出，冷卻至室溫，搖勻，靜置，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2.1”項下待測成分對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，理論板數(shù)以補骨脂酚峰計＞120 000；分離度＞1.5，各成分基線分離良好。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項下補骨脂二氫黃酮對照品溶液1、2、4、6、8、10μL和補骨脂酚對照品溶液2、3、4、5、10、20μL，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分進(jìn)樣量（x，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得補骨脂二氫黃酮、補骨脂酚回歸方程分別為y＝1.889 6x+7.087 0（r＝0.999 8）、y＝0.957 4x+8.625 4（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，補骨脂二氫黃酮、補骨脂酚檢測進(jìn)樣量線性范圍分別為48.9～489、784～7 840 ng。

2.5 精密度試驗

取“2.2.1”項下待測成分對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，補骨脂二氫黃酮和補骨脂酚峰面積的RSD分別為0.78%、0.94%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（No.S15）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、8、12 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，補骨脂二氫黃酮和補骨脂酚峰面積的RSD分別為1.4%、1.6%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批樣品（No.S15）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結(jié)果，補骨脂二氫黃酮和補骨脂酚含量的平均值分別為0.272、12.870 mg/g，RSD分別為1.5%、1.7%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量樣品（No.S15）0.1 g，共6份，分別加入低、中、高質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1 Recovery of recovery tests（n＝9）

2.9 樣品含量測定

取不同輻照劑量的3批次樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表2。由表2可知，補骨脂藥材樣品中補骨脂二氫黃酮和補骨脂酚的含量在不同劑量輻照后無明顯變化。

表2 藥材樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of contents determination of samples（n＝3）

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

為了能使補骨脂藥材中各主要成分達(dá)到完全分離，筆者先后選用了甲醇-水、乙腈-水在不同梯度下進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)乙腈-水分離效果最好，可作為補骨脂二氫黃酮和補骨脂酚含量測定的流動相。通過二級管陣列檢測器檢測，發(fā)現(xiàn)補骨脂二氫黃酮在235 nm波長處有最大吸收，補骨脂酚在260 nm有最大吸收波長，結(jié)合2015年版《中國藥典》（一部）補骨脂測定方法，最終將本試驗的檢測波長定為246 nm。

3.2 提取溶劑與提取方法的考察

預(yù)試驗中，筆者分別加入甲醇、50%甲醇溶液、70%乙醇溶液各20 mL進(jìn)行超聲處理。結(jié)果，提取溶劑為50%甲醇溶液時，藥材樣品中補骨脂酚含量較低，其他溶液作為提取溶劑時，待測成分含量相差不大，因此最簡便的甲醇作為提取溶劑。同時考察了不同提取方法，加熱回流30、60 min或超聲處理30、40、60 min，發(fā)現(xiàn)超聲處理40、60 min時，待測成分提取率相差不大，均高于加熱回流，為節(jié)約試驗時間即以超聲處理40 min作為提取方法。

綜上所述，本研究建立了補骨脂藥材中補骨脂二氫黃酮和補骨脂酚的含量測定方法，簡便可行，可為補骨脂藥材質(zhì)量控制提供更多依據(jù)。同時可以看出，不同劑量輻照后的藥材樣品中，補骨脂二氫黃酮、補骨脂酚的含量均無明顯變化。

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[13] 黃曉婧，周曉英.鈷-60輻照對補骨脂藥材指紋圖譜的影響[J].中國藥物評價，2015，32（6）：159-161.

Simultaneous Determination of Bavachin and Bakuchiol in Psorslea corylifolia by HPLC

HUANG Xiaojing，ZHOU Xiaoying，WEN Yongsheng（Chengdu Institute for Food and Drug Control，Chengdu 610045，China）

OBJECTIVE：To establish a method for content determination of bavachin and bakuchiol in Psoralea corylifolia. METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Shim-Pack VP-ODS column with mobile phase consisted of acetonitrile-water（gradient elution）at the flow rate of l.0 mL/min.The detection wavelength was set at 246 nm，the column temperature was 30℃，and the sample size was 10 μL.RESULTS：The linear ranges of bavachin and bakuchiol were 48.9-489 ng（r＝0.999 8），784-7 840 ng（r＝0.999 9）.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 2.0%. Average recoveries ranged 95.30%-99.63%（RSD＝1.45%，n＝9），96.89%-100.82%（RSD＝1.36%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，stable and reproducible，and can be used for the simultaneous determination of bavachin and bakuchiol in P.corylifolia.

Psoralea corylifolia；Bavachin；Bakuchiol；Content determination；HPLC

R927.2

A

1001-0408（2017）24-3400-03

2016-09-25

2017-03-24）

（編輯：張 靜）

國家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高暨2015年版藥典科研項目；廣東省科技計劃項目（No.2010B030700002）

＊主管藥師。研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：35944961@qq. com

#通信作者：副主任藥師。研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。E-mail：cdwyscd@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.24.25