羚羊感冒片的GC指紋圖譜研究Δ

林 林，郭東曉，汪 冰，劉廣楨（山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101）

·藥物分析與檢定·

羚羊感冒片的GC指紋圖譜研究Δ

林 林＊，郭東曉，汪 冰，劉廣楨#（山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101）

目的：建立羚羊感冒片的氣相色譜（GC）指紋圖譜。方法：毛細管柱為DB-5 ms毛細管柱，檢測器為氫火焰離子化檢測器，進樣口溫度為240℃，檢測器溫度為250℃，程序升溫，載氣為氮氣，流速為1.0 mL/min，進樣量為1 μL，進樣方式為分流進樣，分流比為20∶1。以薄荷酮為參照物，測定10批羚羊感冒片的GC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）進行共有峰指認和相似度評價。結(jié)果：10批羚羊感冒片的GC圖譜有14個共有峰，相似度均＞0.98。經(jīng)驗證，10批樣品GC圖譜與對照指紋圖譜具有較好的一致性。結(jié)論：該研究所建指紋圖譜可為羚羊感冒片的鑒別和質(zhì)量評價提供參考。

羚羊感冒片；氣相色譜法；揮發(fā)油；特征圖譜

羚羊感冒片作為臨床常用中成藥，具有清熱解表的功效，用于治療流行性感冒，癥見發(fā)熱惡風(fēng)、頭痛頭暈、咳嗽、胸悶、咽喉腫痛[1]；處方由羚羊角、金銀花、連翹、荊芥等中藥組合而成[2]。結(jié)合生產(chǎn)工藝，荊芥、連翹揮發(fā)油以及薄荷素油為該制劑發(fā)揮藥效的主要成分，而2015年版《中國藥典》（一部）未對處方中的揮發(fā)油進行質(zhì)量控制。筆者參考相關(guān)文獻[3-8]，建立了羚羊感冒片揮發(fā)油的氣相色譜（GC）指紋圖譜，可用于羚羊感冒片的質(zhì)量控制和評價。

1 材料

1.1 儀器

7890A型GC儀，包括氫火焰離子化檢測器（美國Agilent公司）；CP225D型電子分析天平（德國Satorius公司）。

1.2 藥品與試劑

羚羊感冒片[委托山東宏濟堂制藥集團有限公司代加工，批號：ZZY001～ZZY010（S1～S10），規(guī)格：0.32 g/片]；薄荷酮對照品（批號：111705-201105）、檸檬烯對照品（批號：100470-201302）、胡薄荷酮對照品（批號：111706-201205）、薄荷腦對照品（批號：110728-200506）均購自中國食品藥品檢定研究院，α-蒎烯對照品（批號：80605）、乙酸薄荷酯對照品（批號：45987）、β-蒎烯對照品（批號：80609）均購自美國Sigma公司，以上對照品純度均＞98.0%；乙酸乙酯為色譜純，其余試劑均為分析純，水為去離子水。

1.3 藥材及揮發(fā)油

羚羊角、牛蒡子、淡豆豉、金銀花、荊芥、連翹、淡竹葉、桔梗、甘草藥材和薄荷素油均由北京同仁堂科技股份有限公司提供，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)周鳳勤教授鑒定均為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

毛細管柱：DB-5 ms毛細管柱（30 m×250 mm，0.10 μm）；檢測器：氫火焰離子化檢測器；進樣口溫度：240℃；檢測器溫度：250℃；升溫程序：初始溫度50℃，保持2 min，以12℃/min升溫至90℃，再以6℃/min升溫至220℃；載氣：氮氣；流速：1.0 mL/min；進樣量：1 μL；進樣方式：分流進樣；分流比：20∶1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取待測成分對照品各適量，加乙酸乙酯制成α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮、乙酸薄荷酯質(zhì)量濃度分別為0.100 8、0.117 3、0.189 4、0.219 3、0.514 2、0.299 8、0.173 6 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品12片，研細，精密稱定，置于圓底燒瓶中，自揮發(fā)油提取器上端加入乙酸乙酯1 mL，加熱提取4 h，分取乙酸乙酯液，用無水硫酸鈉脫水后，加乙酸乙酯稀釋至2 mL，混勻，即得。

2.2.3 藥材揮發(fā)油對照溶液 按羚羊感冒片比例取荊芥、連翹各適量，按“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制成荊芥揮發(fā)油對照溶液、連翹揮發(fā)油對照溶液；薄荷素油直接按處方量折算，制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的對照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，以薄荷酮的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，14個共有峰相對保留時間的RSD＜0.01%，相對峰面積的RSD＜1.2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：ZZY001）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以薄荷酮的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，14個共有峰相對保留時間的RSD＜0.02%，相對峰面積的RSD＜1.5%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品（批號：ZZY001）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以薄荷酮的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，14個共有峰相對保留時間的RSD＜0.02%，相對峰面積的RSD＜1.8%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 GC指紋圖譜的生成、指認及相似度分析

2.4.1 GC指紋圖譜的生成 取10批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）對10批樣品的GC圖譜進行分析，得GC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

圖110 批樣品GC疊加指紋圖譜Fig 1 GC overlay fingerprints chromatograms of 10 batches of samples

圖2 樣品GC對照指紋圖譜Fig 2 GC fingerprint chromatograms of sample

2.4.2 共有峰的歸屬和指認 分別取“2.2.1”項下混合對照品溶液和“2.2.3”項下連翹揮發(fā)油對照溶液、荊芥揮發(fā)油對照溶液、薄荷素油對照溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，通過比較色譜圖并查找相關(guān)文獻[3-12]，對圖2中主要色譜峰進行歸屬。結(jié)果顯示，1、2、3、4、7、8、9、10、11、12、13、14號色譜峰來源于薄荷素油；5、6、7、12號色譜峰來源于荊芥揮發(fā)油；1、2、3、4、10號色譜峰來源于連翹揮發(fā)油。共有峰中，2、3、4、5、7、10、12號色譜峰分別被指認為α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬烯、薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮、乙酸薄荷酯。經(jīng)統(tǒng)計，上述7個色譜峰面積之和約占共有峰總面積的85%以上。

2.4.3 相似度與各共有峰相關(guān)數(shù)據(jù)分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）對10批樣品的圖譜進行比較分析。結(jié)果，10批樣品的GC圖譜相似度均＞0.98，詳見表1；各共有峰的相對保留時間和相對峰面積見表2、表3。

表1 10批樣品相似度評價結(jié)果Tab 1 Results of similarity evaluation of 10 batches of samples

2.5 部分市售樣品相似度評價

本品種為我院承擔(dān)的2014年國家評價性抽驗品種，來自全國范圍內(nèi)17家企業(yè)的多批次樣品。取17批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并與樣品對照指紋圖譜比較，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）進行相似度分析，結(jié)果見表4。結(jié)果，不同企業(yè)產(chǎn)品相似度測定結(jié)果差異較大，多數(shù)企業(yè)產(chǎn)品結(jié)果較好，部分企業(yè)產(chǎn)品相似度結(jié)果較低。

表2 10批樣品GC圖譜共有峰的相對保留時間Tab 2 Relative retention time of the common peaks of 10 batches of samples in GC chromatograms

表3 10批樣品GC圖譜共有峰的相對峰面積Tab 3 Relative peak areas of the common peaks of 10 batches of samples in GC chromatograms

表4 部分市售樣品的相似度評價結(jié)果Tab 4 Results of similarity evalualition of part of the commercially available samples

3 討論

揮發(fā)性成分的提取方式一般包括揮發(fā)油提取法和脂溶性溶劑直接提取法，本品為片劑，輔料較多，若采用脂溶性溶劑如乙酸乙酯等直接提取，提取效果較差，故選擇用揮發(fā)油提取法對待測成分進行提取，而且該方法取樣量較大，可以達到富集待測成分的目的。筆者曾考察過乙酸乙酯、環(huán)己烷、正己烷、石油醚等溶劑，結(jié)果提取效果相當，故選擇以毒性較低的乙酸乙酯作為溶劑。由于待測成分較多，且包括部分未知成分，筆者曾經(jīng)嘗試過不同極性的色譜柱進行試驗，結(jié)果以DB-5 ms毛細管柱的色譜結(jié)果最為理想。

本研究中，不同企業(yè)樣品相似度的測定結(jié)果差異很大，其原因可能是在投料和工藝制備過程中存在問題，或是藥材來源不同所致。本品中揮發(fā)油未進行包合[9-11]，直接噴入，可能導(dǎo)致?lián)p失較大，而且揮發(fā)油易受外界溫度的影響，這兩方面的原因可能導(dǎo)致樣品中揮發(fā)性成分含量較低。另外，處方中的連翹藥材存在青翹與老翹的區(qū)別，兩者揮發(fā)油差異也較大[12]。

本試驗建立的指紋圖譜可從整體上對羚羊感冒片中的揮發(fā)油進行控制，14個特征峰基本可以定性反映出荊芥、連翹、薄荷素油的投料情況，可為羚羊感冒片的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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Study on GC Fingerprint of Lingyang Ganmao Tablets

LIN Lin，GUO Dongxiao，WANG Bing，LIU Guangzhen（Shandong Provincial Institute for Food and Drug Control，Jinan 250101，China）

OBJECTIVE：To establish the GC fingerpriont for Lingyang ganmao tablets.METHODS：The determination was performed on DB-5 ms capillary column.Flame ionization detector was adopted with temperature of 250℃（temperature programming）.The temperature of injector was 240℃.Carrier gas was nitrogen with flow rate of 1.0 mL/min；the sample size was 1 μL by split sampling with split ratio of 20∶1.Using peppermint ketone as reference，Similarity Evaluation Software for Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine（2012 edition）was used for the similarity analysis of 10 batches of Lingyang ganmao tablets.RESULTS：There were 14 common peaks in the batches of Lingyang ganmao tablets，similarity degrees were higher than 0.98.It was proved that the GC profiles and control fingerprint of 10 batches of samples had good consistency.CONCLUSIONS：The established fingerprint can provide reference for the identification and quality evaluation of Lingyang ganmao tablets.

Lingyang ganmao tablet；GC；Volatile oil；Characteristic chromatogram

R917

A

1001-0408（2017）24-3397-03

2016-09-13

2017-04-26）

（編輯：張 靜）

國家科技重大專項課題（No.2014ZX09304307）；山東省自然科學(xué)基金資助項目（No.ZR2013HM074）

＊副主任藥師。研究方向：藥物分析。電話：0531-81216523。E-mail：linlinsfda@163.com。

#通信作者：副主任藥師。研究方向：藥物分析。電話：0531-81216552。E-mail：l_guangzhen@sina.com。

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.24.24