自噬下降對β1受體自身抗體誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞凋亡的作用

李楊 喬愛秀 徐云云 王曉暉 王麗 劉慧榮

基礎(chǔ)研究

自噬下降對β1受體自身抗體誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞凋亡的作用

李楊 喬愛秀 徐云云 王曉暉 王麗 劉慧榮

目的 探討自噬下降對β1腎上腺素受體自身抗體（β1-AA）誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞凋亡的作用。方法 使用1 μM的β1-AA對H9c2心肌細胞進行處理，Real time-PCR檢測自噬相關(guān)基因LC3 mRNA表達的改變，Western blot檢測LC3、Beclin 1以及P62蛋白表達水平的變化；使用流式細胞術(shù)、Caspase-3活性檢測及Hoechst 33258染色反映細胞凋亡情況；使用經(jīng)典的自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）預(yù)處理30 min，以及mTOR通路抑制劑雷帕霉素（RAPA）預(yù)處理1 h后，再給予細胞β1-AA處理，檢測此時細胞凋亡的變化情況。結(jié)果 與對照組相比，1 μM的β1-AA干預(yù)H9c2心肌細胞6 h可以明顯降低細胞存活率［（83.46±12.87）%比（96.45±6.99）%］。與對照組（1.01±0.14）相比，β1-AA 干預(yù)細胞 6 h、12 h、24 h，LC3 mRNA水平依次降低［6 h（0.85±0.11），12 h（0.71±0.10），24 h（0.62±0.07）］，LC3Ⅱ和 Beclin 1 蛋白水平依次降低，P62蛋白水平逐漸增加，表明β1-AA可以引起心肌細胞自噬水平逐漸下降。同時發(fā)現(xiàn)，與對照組（1.13±0.24）相比，β1-AA干預(yù)細胞6 h、12 h，細胞凋亡水平明顯升高，分別達到3.21±0.89和2.14±0.24。使用經(jīng)典自噬抑制劑3-MA預(yù)處理心肌細胞30 min抑制自噬后，H9c2心肌細胞凋亡水平較β1-AA單獨處理組顯著增加［（41.45±6.37）%比（29.55±4.32）%］；而使用經(jīng)典mTOR通路抑制劑RAPA預(yù)處理心肌細胞1 h上調(diào)自噬后，心肌細胞凋亡水平較β1-AA單獨處理組明顯下降［（17.36±2.98）%比（29.55±4.32）%］，說明自噬水平改變可以影響心肌細胞凋亡水平。結(jié)論 自噬下調(diào)能夠增加β1-AA誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞凋亡。

自噬； β1腎上腺素受體自身抗體； H9c2； 凋亡

心功能不全是大多心血管疾病最主要的死亡原因之一[1]，其發(fā)病機制尚未完全闡明。大量動物實驗和人體研究均發(fā)現(xiàn)，在心功能不全的過程中存在心肌細胞凋亡，而且心肌細胞凋亡在心功能不全的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用；相反，如果抑制細胞凋亡則可有效地防止或減弱心功能不全[2]。因此，有效調(diào)控心肌細胞凋亡對于心功能不全的防治有著十分重要的意義。

近年來發(fā)現(xiàn)，在40%～60%心功能不全患者血清中可檢測到β1腎上腺素受體自身抗體（β1-adrenoceptor autoantibody，β1-AA）[3]。且有研究表明，β1-AA可以通過激活β1腎上腺素受體誘導(dǎo)心肌細胞凋亡[4]，進而參與心功能不全的發(fā)生發(fā)展。然而，β1-AA如何引起心肌細胞凋亡目前仍不十分清楚。

自噬通過降解老化或受損的細胞器及錯誤折疊或功能異常的蛋白質(zhì)，促進細胞的自我更新及物質(zhì)循環(huán)，并為細胞提供能量，維持細胞穩(wěn)態(tài)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，β1-AA可以引起心肌細胞自噬水平下降[5]。同時有研究表明，自噬參與了細胞凋亡的調(diào)控[6]。在某些特定環(huán)境下，自噬是一種應(yīng)激反應(yīng)，通過抑制凋亡避免細胞死亡[7]。由此可知，自噬在細胞凋亡的發(fā)生過程中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。然而自噬是否會對β1-AA誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞凋亡產(chǎn)生影響目前尚不清楚。本研究將進一步觀察自噬變化對β1-AA誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響，為心功能不全患者的防治提供新的理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 P62（Cell Signaling Technology），Beclin 1 （Cell Signaling Technology），LC3B（Sigma），辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗（中杉金橋），0.45 μm PVDF 膜（Whatman），RNAiso plus（Takara），Prime Script RT Master Mix（TaKaRa），SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa），3-Methyladenine（Sigma），Rapamyein（Gene Operation），Hoechst 33258（Beyotime Biotechnology），Caspase-3活性分光光度法檢測試劑盒（Nanjing Biobox Biotech.Co.，Ltd），Mini port垂直電泳儀（BIO-RAD），熱循環(huán)儀（MJ Research），實時熒光定量 PCR 儀（Stratagene），酶標(biāo)儀（Molecular Devices）。

1.2 實驗分組 實驗分為4組：對照組（Control組）；β1-AA 組（β1-AA 1 μM 處理細胞 6、12、24 h）；3-MA+β1-AA組（3-MA 10 mM預(yù)處理細胞30 min后加入 β1-AA 1 μM 處理細胞 6 h）；RAPA+β1-AA組（RAPA 100 nM預(yù)處理細胞1 h后加入β1-AA 1 μM處理細胞6 h）。

1.3 細胞活性檢測 本實驗采用CCK-8法檢測各組細胞存活率。具體方法是：以大約2×106個細胞/ml的密度將細胞接種在96孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁后使用1 μM的β1-AA處理細胞，6 h后更換新鮮培養(yǎng)液 100 μl，加入 5 μl CCK-8，混勻繼續(xù)培養(yǎng)90 min。觀察到溶液顏色變?yōu)樽攸S色時，用酶標(biāo)儀在405 nm處檢測各組吸光度值。根據(jù)各組的吸光度值計算各實驗組相對于對照組的細胞存活率。細胞存活率=（實驗組OD值-陰性對照組OD值）/（對照組OD值-陰性對照組OD值）。

1.4 Real time-PCR 本實驗用Real-time PCR方法檢測LC3的mRNA表達水平。具體方法是：6孔板中每孔H9c2心肌細胞用500 μl Trisol試劑裂解，并提取總RNA。0.5 μg總RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，選用SYBR Green試劑盒擴增cDNA產(chǎn)物，確認Real-time PCR的擴增曲線和溶解曲線。引物序列如下：LC3（Gen-Bank ID NM_022867.2），上游引物為 5′-AGCTCTGAAGGCAACAGCAACA-3′，下游引 物 為 5′-GCTCCATGCAGGTAGCAGGAA-3′。GAPDH（Gen-Bank ID NM_017008.3），上游引物為5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。 選 用GAPDH作為內(nèi)參。結(jié)果采用相對定量進行計算（2-ΔΔCt法）。

1.5 Western blot 本實驗用Western blot方法檢測P62、LC3和Beclin 1的蛋白表達水平。具體方法是：加入1 μM β1-AA后在不同時間點收集細胞，加入Western及IP細胞裂解液裂解，冰上靜置1 h，細胞刮收集細胞，將細胞懸液收集到1.5 ml的EP管中，12 000 r/min離心15 min，提取上清，用BCA試劑盒進行蛋白定量。選擇上樣量為30 μg上樣并進行SDS-PAGE電泳以及用PVDF膜轉(zhuǎn)膜。再與P62、Beclin 1、LC3B及 β-actin的單克隆抗體進行反應(yīng)，4℃過夜；選用相應(yīng)的二抗進行反應(yīng)。SuperECL Plus（北京普利萊，P1030）超敏發(fā)光液發(fā)光；將膜置于全自動曝光儀（Bio-Rad，Universal HoodⅢ）內(nèi)，利用Image Lab軟件曝光拍攝條帶。Image J軟件分析條帶的灰度值，將β-actin作為參照，計算不同蛋白的相對表達量。

1.6 Hochest 33258染色 本實驗采用Hoechst 33258染色法來檢測細胞凋亡情況。正常細胞經(jīng)Hoechst 33258染色后細胞核呈彌散均勻熒光；細胞出現(xiàn)凋亡時，細胞核可見濃染致密的顆粒塊狀熒光。具體方法如下：將H9c2心肌細胞接種至六孔板中，細胞貼壁達50%～60%后進行分組加藥處理；用PBS清洗2次，每孔加入1 ml Hoechst 33258染色液，置于37℃、5%CO2恒溫箱中孵育30 min；取出后棄掉染料，用PBS洗滌2次后每孔加入1 ml PBS，熒光倒置顯微鏡（Olympus，IX51）觀察并拍照。1.7 Caspase-3活性檢測 本實驗使用Caspase-3活性分光光度法（南京碧波，BA30100）檢測Caspase-3的活性來反映凋亡情況。具體方法是：收集細胞時，每孔加入100 μl Lysis Buffer，吹打均勻，冰上裂解，用BCA試劑盒進行蛋白定量。給藥組吸取 100 μg 蛋白/50 μl體積（對照組吸取 50 μl裂解液）后，依次加入50 μl 2×反應(yīng)液（使用前加入0.5 μl DTT/50 μl）、5 μl Ac-DEVD-pNA，37 ℃孵育過夜。在酶標(biāo)儀405 nm處測定各組吸光度值。Caspase-3活性計算：校正熒光度值=OD誘導(dǎo)組/OD陰性對照；以對照組的活性為1，計算其余各組Caspase-3相對活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。結(jié)果以±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差異法（LSD）法。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 β1-AA對H9c2心肌細胞存活率的影響 β1-AA能夠顯著降低H9c2心肌細胞存活率。采用CCK-8法檢測細胞存活率，結(jié)果顯示，與對照組H9c2 心肌細胞存活率（96.45±6.99）%相比，1 μM[8]β1-AA作用H9c2心肌細胞6 h細胞存活率出現(xiàn)明顯下降，為（83.46±12.87）%。見圖 1。

2.2 β1-AA對H9c2心肌細胞自噬水平的影響

LC3Ⅱ是自噬形成的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，Beclin 1是參與自噬調(diào)控的重要基因，而P62是自噬重要的底物蛋白。本研究采用Real time-PCR法及western blot法檢測β1-AA干預(yù)H9c2心肌細胞6 h、12 h、24 h時LC3 mRNA水平及LC3、Beclin 1和P62蛋白表達情況。結(jié)果顯示，與對照組（1.01±0.14）相比，心肌細胞LC3 mRNA水平在β1-AA干預(yù)H9c2心肌細胞 6 h 開始下降，6 h（0.85±0.11），12 h（0.71±0.10），24 h（0.62±0.07）。β1-AA 干預(yù) H9c2 心肌細胞 6 h、12 h、24 h以后，LC3Ⅱ與 Beclin 1 蛋白水平依次降低，P62蛋白水平逐漸增加。以上結(jié)果提示，β1-AA可以引起心肌細胞自噬水平明顯下降。見圖2（A、B）。

2.3 β1-AA對H9c2心肌細胞凋亡增加的作用β1-AA在不同時間點刺激H9c2心肌細胞，通過Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)、Caspase-3活性檢測及Hochest 33258染色來反映心肌細胞凋亡情況。流式細胞分析結(jié)果顯示，與對照組相比，β1-AA刺激6 h時，處于右上象限與右下象限細胞百分比增加，提示細胞凋亡顯著增加（3.21±0.89比1.13±0.24），12 h（2.14±0.24）仍然高于對照組，24 h（1.29±0.19）基本恢復(fù)正常。Caspase-3活性檢測及Hochest 33258染色均發(fā)現(xiàn)，β1-AA可以引起H9c2心肌細胞凋亡增加，并且這種增加在β1-AA作用6 h時最為顯著。見圖 3（A、B、C）。

2.4 上調(diào)或抑制心肌細胞自噬水平對β1-AA誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡的影響 本研究采用經(jīng)典自噬抑制劑3-MA抑制自噬以及mTOR通路抑制劑RAPA上調(diào)自噬水平，Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)對H9c2心肌細胞凋亡進行檢測，結(jié)果顯示，β1-AA干預(yù)心肌細胞6 h后，與對照組相比，處于右上象限與右下象限細胞百分比增加［（29.55±4.32）%比（10.02±3.29）%］，表明 β1-AA 作用 6 h能夠增加H9c2心肌細胞凋亡；使用經(jīng)典自噬抑制劑3-MA抑制自噬水平以后發(fā)現(xiàn)，處于右上象限和右下象限的細胞百分比進一步增加［（41.45±6.37）%比（29.55±4.32）%］，提示凋亡水平進一步增加；而使用mTOR通路抑制劑RAPA上調(diào)自噬后則發(fā)現(xiàn)，心肌細胞凋亡水平降低［（17.36±2.98）%比（29.55±4.32）%］。以上結(jié)果均說明，自噬變化參與了β1-AA誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。見圖4。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，β1-AA可以降低H9c2心肌細胞存活率，增加凋亡水平。利用Real time-PCR和Western blot方法檢測自噬相關(guān)基因和蛋白，結(jié)果表明，β1-AA誘導(dǎo)H9c2心肌細胞自噬水平明顯下降。進一步分析β1-AA引起的H9c2心肌細胞自噬變化與細胞凋亡的關(guān)系，結(jié)果提示，β1-AA可能通過降低H9c2心肌細胞自噬水平誘導(dǎo)細胞出現(xiàn)凋亡。

β1-AA是針對β1腎上腺素受體細胞外第二環(huán)的自身抗體，存在于原發(fā)性擴張型心肌病、Chagas心臟病、原發(fā)性心電紊亂等多種心血管疾病患者血液中，發(fā)揮類β1-AR受體激動劑樣的作用進而導(dǎo)致心功能不全。有研究發(fā)現(xiàn)，β1-AA可對分離的心肌細胞產(chǎn)生正性肌力效應(yīng)，導(dǎo)致細胞內(nèi)cAMP升高，從而使心肌細胞死亡[9]。也有研究報道，β1-AA具有類激動劑樣的正性變時效應(yīng)，使乳鼠心肌細胞跳動頻率增加，并且持續(xù)6 h不衰減[10]。這都提示β1-AA的存在可能是心功能不全發(fā)生發(fā)展的危險因素之一。我們之前的研究[11]也發(fā)現(xiàn)，β1-AA的長期存在導(dǎo)致大鼠心肌重構(gòu)和心臟功能受損。本次試驗發(fā)現(xiàn)，1 μM β1-AA作用H9c2心肌細胞6 h可明顯降低細胞存活率，表明β1-AA的存在與心功能不全的發(fā)生發(fā)展密不可分。

心肌細胞凋亡是心肌細胞死亡的一種重要方式。有研究表明，β1-AA引起的心肌細胞凋亡是導(dǎo)致心功能不全的主要因素之一[12]。β1-AA通過與β1-AR結(jié)合，可以發(fā)揮類激動劑樣作用激活β1-AR，而β1-AR持續(xù)過度激活可以引發(fā)心肌細胞凋亡[13]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，β1-AA可以激活心肌細胞cAMP依賴的蛋白激酶信號通路，引起Caspase-3的活化，從而導(dǎo)致心肌細胞的凋亡[14]。本實驗研究也發(fā)現(xiàn)，1 μM β1-AA作用6 h時可以引起H9c2心肌細胞凋亡顯著增加。但是β1-AA到底如何誘發(fā)凋亡目前并不十分清楚。

自噬是溶酶體吞食和降解細胞漿內(nèi)物質(zhì)的過程，是細胞依賴溶酶體途徑來反復(fù)和再回收利用細胞漿內(nèi)成分的過程[15]，這種生物學(xué)過程對于細胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及能量平衡是十分重要的。研究發(fā)現(xiàn)β1-AA與β1-AR細胞外第二環(huán)結(jié)合發(fā)揮類激動劑樣作用[16]，而β1-AR的激活可以明顯影響自噬水平。我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，隨著β1-AA刺激時間的延長，心肌細胞自噬水平明顯降低，并且參與心功能不全的發(fā)生發(fā)展[5,17]。本實驗研究結(jié)果也與前期研究結(jié)果一致。β1-AA干預(yù)H9c2心肌細胞6 h、12 h、24 h后，LC3 mRNA水平以及LC3和Beclin 1蛋白水平逐漸降低，P62蛋白水平逐漸增加，提示自噬水平逐漸降低。

自噬和凋亡很有可能是被許多因子同時激活的兩個基本生物學(xué)過程[18]。目前關(guān)于自噬與凋亡的關(guān)系仍存在爭議，但普遍認為二者受共同調(diào)節(jié)因子的影響，存在交互作用。有研究表明，自噬和凋亡均可引起細胞死亡，且自噬處于凋亡上游信號通路，可通過降解受損的蛋白、減弱DNA損傷等途徑抑制凋亡的發(fā)生[19]。最新研究發(fā)現(xiàn)，在HeLa細胞中Caspase-3引起的Beclin 1裂解會降低自噬，進而引起細胞凋亡[20]。因此，自噬作為維持細胞穩(wěn)態(tài)的機制，可以在某種程度上影響凋亡的發(fā)生。由以上實驗結(jié)果可知，在β1-AA存在的條件下，H9c2心肌細胞凋亡發(fā)生增加，而自噬水平下降。那么自噬下降是否與β1-AA誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡有關(guān)呢？為了進一步證明這一問題，本研究選用RAPA上調(diào)自噬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β1-AA引起的H9c2心肌細胞凋亡水平明顯降低；而當(dāng)使用3-MA抑制自噬后，β1-AA引起的H9c2心肌細胞凋亡水平進一步升高，提示自噬的下調(diào)參與了β1-AA誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞的凋亡。由此設(shè)想，如果我們可以早期合理調(diào)控自噬進而適度調(diào)控凋亡，則極有可能減少心肌細胞的凋亡，改善心功能，從而為治療β1-AA陽性心功能不全提供新的方法。

圖1 對照組和β1-AA組細胞存活率檢測結(jié)果分析

圖2 β1-AA誘導(dǎo)H9c2心肌細胞自噬水平下降

A 通過Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)結(jié)果顯示β1-AA作用6 h時明顯促進H9c2心肌細胞凋亡

圖3 β1-AA引起H9c2心肌細胞凋亡增加

圖4 自噬水平的改變能夠影響H9c2心肌細胞凋亡的發(fā)生

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Decreased autophagy participate in the apoptosis induced by β1adrenergic receptor autoantibodies in H9c2 cells

LI Yang＊，QIAO Ai-xiu，XU Yun-yun，et al.＊Department of Physiology，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

WANG Li，E-mail：mirror0117@126.com；LIU Hui-rong，E-mail：liuhr2000@126.com

ObjectiveTo investigate the role of autophagy in the regulation of apoptosis induced by β1adrenergic receptor autoantibodies（β1-AA）in H9c2 cells.MethodsH9c2 myocardial cells treated with 1 μM β1-AA were processed to detect the changes of autophagy related gene LC3 mRNA expression by Real time-PCR；using western blot to test the varieties of Beclin 1，P62 and LC3 protein expression level；flow cytometry，Caspase-3 activity detection and Hoechst 33258 staining were used to assess cell apoptosis；using classical autophagy inhibitor 3-Methyladenine（3-MA）pretreated cells for 30 min or pretreated with mTOR signaling pathway inhibitor rapamyein（RAPA）for 1 h，then used β1-AA，detecting the changes of apoptosis.ResultsCompared with the control group（96.45±6.99）%，after 1 μM β1-AA acting on H9c2 myocardial cells 6 h，the survival rate of cells significantly reduced to（83.46±12.87）%；as compared to control（1.01±0.14），β1-AA intervened cells for 6 h，12 h and 24 h，LC3 mRNA level was fallen to 0.85±0.11，0.71±0.10，and 0.62±0.07，respectively；also，LC3Ⅱ and Beclin 1 protein level was descended，nevertheless P62 protein level increased gradually，showed that the level of autophagy decreased gradually；at the same time，compared to controls（1.13±0.24），β1-AA acting to cardiomyocytes for 6 h and 12 h，the level of cardiomyocytes apoptosis severally increased to 3.21±0.89 and 2.14±0.24；after preusing classical autophagy inhibitor 3-MA for 30 min to inhibit autophagy，apoptosis of H9c2 myocardial cells increased significantly than only β1-AA treatment group［（41.45±6.37）%vs （29.55±4.32）%］，in contrast，after using mTOR signaling pathway inhibitor RAPA for 1 h to upregulate autophagy,apoptosis of H9c2 cardiomyocytes decreased［（17.36±2.98）%vs（29.55±4.32）%］，indicated that changes in autophagy can affect H9c2 cells apoptosis.ConclusionReduced autophagy could increase apoptosis induced by β1-AA in H9c2 cells.

Autophagy； β1-adrenergic receptor autoantibodies； H9c2 cell； Apoptosis

國家自然科學(xué)基金（項目編號：31401006）；山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目（項目編號：201601D021146）；

030001 山西省太原市，山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，細胞生理學(xué)山西省重點實驗室（李楊、劉慧榮），病理教研室（喬愛秀、徐云云、王曉暉、王麗）；首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室（劉慧榮）

王麗，E-mail：mirror0117@126.com；劉慧榮，E-mail：liuhr2000@126.com

,ebook=93

10．3969/j．issn．1672－5301．2017．03．023

R542.2

A

1672-5301（2017）03-0279-05

2016-11-06）

山西醫(yī)科大學(xué)博士啟動基金（項目編號：B03201202）