肉食品中β2—受體激動(dòng)劑殘留的常用篩選和確證方法

涂毅　陳敏　孫炎木

【摘 要】本文首先介紹了β2-受體激動(dòng)劑的藥理作用和對(duì)食品安全的影響，然后介紹了以酶聯(lián)免疫吸附法為代表的常用篩選方法，和以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用為代表的確證方法，最后對(duì)肉食品中β2-受體激動(dòng)劑的檢測進(jìn)行了展望。

【關(guān)鍵詞】β2-受體激動(dòng)劑；酶聯(lián)免疫吸附法；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

1.引言

β2 -受體激動(dòng)劑是一類能選擇性與β腎上腺素受體結(jié)合，產(chǎn)生受體激動(dòng)樣作用藥物的總稱，是一系列以苯乙醇胺為母核，芳環(huán)和末端氨基多取代的衍生物（圖1），藥理作用主要為松弛支氣管平滑肌、提高骨骼肌收縮力、增加肺通氣量、增強(qiáng)支氣管纖毛運(yùn)動(dòng)[1]，常用來治療哮喘、慢性阻塞性肺病等呼吸系統(tǒng)疾病。近年研究發(fā)現(xiàn)，β2-受體激動(dòng)劑能通過腎上腺受體刺激腺苷酸環(huán)化酶的合成，從而升高環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的濃度以增加激素敏感脂酶活性，加快脂肪分解；另外它還可降低血液中鎂離子濃度，間接促進(jìn)肌肉興奮，抑制蛋白質(zhì)分解和脂肪合成，進(jìn)而增加肌肉蛋白合成[2]。在禽畜飼養(yǎng)中添加β2-受體激動(dòng)劑能夠使動(dòng)物生長速度加快，瘦肉相對(duì)增加。一般來說，飼料中添加適量，可使飼料轉(zhuǎn)化率、生長速率和酮體瘦肉率提高超過10%，所以也稱它為瘦肉精。然而，β2-受體激動(dòng)劑的化學(xué)性質(zhì)極穩(wěn)定，日常烹飪過程如煮沸、燒烤和微波加熱均不能使其分解。長期食用高劑量β2-受體激動(dòng)劑殘留的肉食品，會(huì)引起血壓升高，血液中鉀離子濃度降低，提高內(nèi)臟平滑肌和橫紋肌興奮性，造成頭疼、肌肉酸痛、上吐下瀉等癥狀，對(duì)食用者的健康埋下隱患。鑒于其對(duì)食品安全的嚴(yán)重威脅，目前多數(shù)國家已經(jīng)禁止在畜牧養(yǎng)殖中使用β2-受體激動(dòng)劑作為獸藥飼料添加劑。我國農(nóng)業(yè)部也多次發(fā)布公告禁止將克侖特羅、沙丁胺醇等β2-受體激動(dòng)劑及鹽、酯等結(jié)合物用于所有食用動(dòng)物中[3，4]。然而β2-受體激動(dòng)劑的非法使用現(xiàn)象仍然嚴(yán)重。如2007年9月，上海市336人因食用了殘留有克侖特羅的豬肉發(fā)生集體中毒事件。北京奧運(yùn)會(huì)前夕，當(dāng)時(shí)中國男子游泳隊(duì)里最優(yōu)秀也是最有望奪得獎(jiǎng)牌的選手歐陽鯤鵬就是因?yàn)榛丶倚菁贂r(shí)與朋友吃了含有瘦肉精的烤串導(dǎo)致尿檢呈陽性，進(jìn)而被終身禁賽。

2.β2-受體激動(dòng)劑殘留的常用篩選方法

β2-受體激動(dòng)劑的衍生物較多（表1），而且通常殘留量較低，因此對(duì)其檢測的方法提出了較高的挑戰(zhàn)。最初，很多國家采用放射免疫分析法和酶聯(lián)免疫分析法作為β2-受體激動(dòng)劑的控制方法[5，6]，很快，免疫分析法因其高選擇性和快速性得到了越來越多的應(yīng)用，其中酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immuno-sorbent assay，ELISA）成為實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用最廣泛的篩選方法。該方法利用抗原與抗體間的特異性反應(yīng)，將待測物與中間酶連接，酶再催化底物產(chǎn)生有顏色的產(chǎn)物，通過酶標(biāo)儀在特定波長下檢測產(chǎn)物的顏色來判斷待測物的含量。操作中一般用稀酸溶液提取，離心，調(diào)pH，用樣品稀釋液稀釋并在450nm波長處測定吸光值。檢測時(shí)注意提取液的pH，一般要求在6.5～7.5，在所有恒溫孵育過程中避免光線照射。目前，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測肉制品中的β2-受體激動(dòng)劑主要有克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇。我國農(nóng)業(yè)部在2008年的1025號(hào)公告中首次發(fā)布了動(dòng)物性食品中多種β-受體激動(dòng)劑殘留檢測的酶聯(lián)免疫吸附法國家標(biāo)準(zhǔn)[7]。

目前常用的酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒品牌有“北京望爾”“美國柏爾”和“英國朗道”等，靈敏度可達(dá)ng/g（μg/kg）水平，可以滿足篩選分析的要求。陳穗等[8]使用克侖特羅試劑盒（德國r-Biopharm公司），從方法的檢出限、校正曲線的線性范圍、精密度、加標(biāo)回收率測定等方面對(duì)酶聯(lián)免疫法檢測豬尿中克侖特羅殘留量的質(zhì)量控制方法進(jìn)行了探討。結(jié)果表明.該試劑盒的樣品檢測下限為0.03 μg/kg，定量下限為0.1 μg/kg。當(dāng)克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)添加水平為0.5 μg/kg、1.0 μg/kg時(shí)，平均回收率分別約為84%和90%，均符合殘留分析質(zhì)量控制要求。

經(jīng)方法篩選結(jié)果為陽性的樣品，需要用確證方法確證。然而，由于不同生產(chǎn)廠家研發(fā)的試劑盒存在抗體提取及反應(yīng)活性不穩(wěn)定等因素，不同品牌甚至同一品牌不同批次之間都存在差異，因此免疫分析法始終不能成為法定的確證方法。

3.β2-受體激動(dòng)劑殘留的常用確證方法

3.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

官方檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)無論是篩查還是確證都傾向于選擇靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的質(zhì)譜方法。20世紀(jì)80年代以前，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）是日常檢驗(yàn)唯一的選擇。該方法具有較高靈敏度和較強(qiáng)專屬性，同時(shí)由于β2-受體激動(dòng)劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)中有不易氣化的羥基和氨基，因此需要對(duì)處理后的樣品進(jìn)行衍生化。常用的衍生化試劑有N-甲基-N-三甲基硅基-三氟乙酰胺（MSTFA）和N，O-雙（三甲基硅基）-三氟乙酰胺（BSTFA）。此外，由于其具有良好重現(xiàn)性，也更易于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。Clare等[9]在1979年將GC-MS應(yīng)用于特布他林檢驗(yàn)中。朱堅(jiān)等[10]在2005年使用GC-MS同時(shí)測定肝、腎和肉中11種β-受體激動(dòng)劑殘留的方法進(jìn)行研究。樣品經(jīng)pH 5.2的乙酸鈉緩沖溶液提取，提取液經(jīng)β-鹽酸葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶水解，用高氯酸沉淀蛋白質(zhì)，經(jīng)異丙醇-乙酸乙酯（6：4，體積比）液-液分配，再經(jīng)陽離子交換樹酯（SCX）小柱凈化后，用N，O-雙（三甲基硅基）-三氟乙酰胺衍生化。用美托洛爾為內(nèi)標(biāo)，同時(shí)測定11種β-受體激動(dòng)劑。對(duì)肝、腎和肉樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，平均回收率為71%～94%，變異系數(shù)為4.6%～18.7%，最低檢測限為0.002～0.000 5mg/kg。

3.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

與氣相色譜相比，液相色譜在β2-受體激動(dòng)劑分離方面更有優(yōu)勢，不需要衍生化，色譜系統(tǒng)使用的溶劑相容性也更好。但單獨(dú)使用液相色譜的效果并不理想，因?yàn)樽贤鈾z測器的基質(zhì)影響較大，限制了方法的靈敏度和專屬性，目前已較少作為確證分析方法。目前常用的是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS），該方法多次被應(yīng)用于尿液、血漿、肝臟以及動(dòng)物雞肉等樣品中β-受體激動(dòng)劑的檢測。

LC-MS首次用于β2-受體激動(dòng)劑的生物分析是在1989年，Blanchnower和Kennedy[11]應(yīng)用該方法檢測牛尿中的克倫特羅殘留量。Kootstra等[12]在2004年利用LC-MS在牛肉中檢測出西馬特羅等8種β2-受體激動(dòng)劑，且經(jīng)過驗(yàn)證該方法適用基質(zhì)還包括兔肉、鴨肉、火雞肉以及各種各樣的魚肉。隨著離子阱-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀的誕生，LC-MS的應(yīng)用范圍更被進(jìn)一步擴(kuò)大，檢測數(shù)量和靈敏度亦是逐步提高。Sai等[13]在2012年應(yīng)用高效液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜（HPLC-LIT-MS）法在豬肉、雞肉、肝臟等動(dòng)物源食品中檢測出25種β2-受體激動(dòng)劑和23種β2-受體激動(dòng)劑，結(jié)果所有藥物的回收率均在46.6～118.9%之間，相對(duì)偏差在1.9～28.2%之間；方法的檢出限在0.05～0.49μg/kg之間，可以滿足同時(shí)檢測復(fù)雜基質(zhì)中多種藥物殘留的要求。劉佳等[14]在2014年建立了一種豬肝中26種β2-受體激動(dòng)劑藥物殘留的反相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）檢測方法。樣品經(jīng)β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶酶解12 h 后，加入 HClO4調(diào)至 pH 1，去除蛋白，殘?jiān)?jīng)過0.1 mol/L HClO4再次提取后合并提取液，調(diào)節(jié)混合提取液至pH 4，過混合陽離子（MCX）固相萃取柱凈化。采用0.1%甲酸和0.1%甲酸-乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，質(zhì)譜（ESI+）采用多離子檢測模式對(duì)β2-受體激動(dòng)劑的定量離子和定性離子進(jìn)行監(jiān)測，本方法在15 min內(nèi)完成26種目標(biāo)化合物的分離分析。26種β2-受體激動(dòng)劑在5、10和20μg/L添加水平的回收率為64.0%～112.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15.2%，方法檢出限為0.15～1.35μg/kg。

LC-MS法具有樣品用量少、靈敏度高、分離能力強(qiáng)、選擇性高以及定性、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，是目前確證β2-受體激動(dòng)劑殘留的最佳首選方法。但LC-MS價(jià)格很貴，儀器結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，檢測時(shí)間長，樣品前處理復(fù)雜，易受污染，因而只作為實(shí)驗(yàn)室的確證方法。

我國在2008年發(fā)布了用LC-MS測定動(dòng)物源性食品中多種β2-受體激動(dòng)劑殘留量的國家標(biāo)準(zhǔn)[15]，對(duì)克侖特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、馬布特羅等9種β2-受體激動(dòng)劑在豬肉、豬肝、雞蛋和牛奶中的檢出限均達(dá)到0.25μg/kg。

4.結(jié)論與展望

隨著檢測儀器的發(fā)展，越來越多的技術(shù)將會(huì)被應(yīng)用于β2-受體激動(dòng)劑的檢測。免疫分析方法不僅有較好的靈敏度，且具有高通量、操作簡單、檢測成本低，能夠較好滿足基層實(shí)驗(yàn)室、現(xiàn)場監(jiān)控檢測、臨時(shí)快速抽樣檢測的要求，但是由于提供的分子結(jié)構(gòu)信息較少，尚不能作為確證方法。色譜質(zhì)譜技術(shù)作為主要的確證分析和精確定量方法，其應(yīng)用日趨完善，并被采納為國家標(biāo)準(zhǔn)的儀器方法。此外，隨著冷凍過濾法、液相色譜分離法、加速溶劑萃取法、液液萃取法、固相微萃取法、固液萃取法、固相萃取法以及超臨界流體萃取等新型除脂凈化的報(bào)道與發(fā)展，樣品的分析步驟亦會(huì)得到進(jìn)一步的簡化。

β2-受體激動(dòng)劑殘留檢測技術(shù)的發(fā)展方向主要可概括為：（1）更高的靈敏度、更低的檢出限和定量限；（2）高通量，即單位時(shí)間內(nèi)分析更多樣品；（3）更高的選擇性、特異性和抗干擾能力；（4）分析儀器更高的穩(wěn)定性，更多聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展；（5）減少污染和消耗，降低分析成本。由此可見，β2-受體激動(dòng)劑的分析技術(shù)仍有待進(jìn)一步改進(jìn)和完善.需建立更有效和實(shí)用的檢測體系.從而更好地保證食品安全。

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基金項(xiàng)目：

湖北省普通高等學(xué)?！皯?zhàn)略性新興（支柱）產(chǎn)業(yè)人才培養(yǎng)計(jì)劃本科”資助項(xiàng)目[湖北省教育廳鄂教高[2013]11號(hào)]，省教育廳、省財(cái)政廳“生物技術(shù)專業(yè)綜合改革”試點(diǎn)資助項(xiàng)目[鄂教高辦[2014]6號(hào)]，湖北省教育科學(xué)“十二五”規(guī)劃2014年度課題“普通民辦高校創(chuàng)新人才培養(yǎng)模式研究”資助項(xiàng)目（201413272）。

作者簡介：

涂毅，男，講師，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)、藥物檢測。

陳敏，女，現(xiàn)從事藥物殘留檢測方向的研究。

孫炎木，女，現(xiàn)從事藥物殘留檢測方向的研究。