不同處理方法對肺炎鏈球菌基因組提取的影響

黃 洋， 李 康， 楊 越， 陳 馳， 梁 麗， 葉 強(qiáng)， 陳翠萍

(中國食品藥品檢定研究院 衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

不同處理方法對肺炎鏈球菌基因組提取的影響

黃 洋， 李 康， 楊 越， 陳 馳， 梁 麗， 葉 強(qiáng)*， 陳翠萍

(中國食品藥品檢定研究院 衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

為了獲得簡便、高效的提取肺炎鏈球菌基因組DNA方法，分別采用不同處理方法(溶菌酶法和脫氧膽酸鈉(DOC)法)、不同處理時(shí)間對8株不同血清型的肺炎鏈球菌進(jìn)行破壁，同時(shí)菌株采用不同培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行基因組的提取，提取基因組后利用紫外分光光度計(jì)測定樣品中DNA 的濃度和純度以及瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA 的質(zhì)量。結(jié)果表明，菌株培養(yǎng)12～16 h、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%DOC處理2 h能提取出高質(zhì)量的肺炎鏈球菌基因組DNA。該方法提取的肺炎鏈球菌基因組DNA具有質(zhì)量高、完整性好的優(yōu)點(diǎn)，為肺炎鏈球菌全基因組序列的測定提供了前提條件。

肺炎鏈球菌；基因組提??；不同破壁方法；不同培養(yǎng)時(shí)間

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)又稱肺炎雙球菌或肺炎球菌，是一種革蘭陽性雙球菌，有莢膜結(jié)構(gòu)，莢膜是肺炎鏈球菌的主要毒力因子[1-2]。根據(jù)莢膜多糖結(jié)構(gòu)和成分的不同，肺炎鏈球菌目前可分成46個(gè)血清群和93個(gè)不同的血清型[2-3]。多數(shù)微生物物種的基因是一個(gè)動(dòng)態(tài)實(shí)體，基因的水平轉(zhuǎn)移會(huì)導(dǎo)致基因的變化，從而影響細(xì)菌的毒力和細(xì)菌相關(guān)疾病的病原學(xué)行為[4]。在以高通量測序?yàn)檠芯渴侄窝芯糠窝祖溓蚓蚪M序列和比較基因組學(xué)分析時(shí)，提取高質(zhì)量的基因組DNA 成為最基礎(chǔ)的工作?；蚪M的提取主要包括破壁和核酸抽提，由于肺炎鏈球菌細(xì)胞壁比較堅(jiān)韌，因此提取基因組DNA 的關(guān)鍵在于選擇一種合適的方法，使菌體內(nèi)核酸釋放出來。本研究分別比較不同處理方法(溶菌酶法和脫氧膽酸鈉(DOC)法)、不同處理時(shí)間進(jìn)行破壁、菌株培養(yǎng)不同時(shí)間對提取的全基因組質(zhì)量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 肺炎鏈球菌CMCC(B)31213、31214、31226、31540、31541、31546、31547、31601來自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，其中31213為9群9A型，31214為9群9L型，31540、31541為9群9N型，31546、31547為9群9V型，31601為14群。

1.1.2 試劑及儀器 THB培養(yǎng)基、酵母提取物購自美國BD公司，脫纖維羊血購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司，脫氧膽酸鈉(DOC)購自美國Sigma公司，DNA提取試劑盒購自美國Qiagen公司(貨號(hào)69506)，NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)購自美國Thermo公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 THBY培養(yǎng)基(即質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25% Yeast的THB)由中國食品藥品檢定研究院培養(yǎng)基室配制。

1.2 方法

1.2.1 不同破壁方法對肺炎鏈球菌全基因組的影響 取10 mL THBY培養(yǎng)基中的菌液于3500 r/min離心15 min，棄去上清，菌體用1mL TE buffer重懸，制備成菌懸液。用5 mg/mL溶菌酶、質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.25%、0.5%、1%、2%、4% DOC處理菌懸液相同的時(shí)間后，按照DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行全基因組DNA的提取。

1.2.2 DOC處理不同時(shí)間對肺炎鏈球菌全基因組的影響 在菌懸液中加入DOC，使DOC最終的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，將菌液置于37 ℃處理1、2、3、4、5、24 h，然后按照DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行全基因DNA的提取。

1.2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間對肺炎鏈球菌全基因組完整性的影響 肺炎鏈球菌于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別培養(yǎng)6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h后取出2 mL菌液，然后按照DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行提取。

1.2.4 基因組DNA質(zhì)量的檢測 提取基因組后采用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測定樣品中DNA的濃度和純度，同時(shí)取5 μL基因組在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳下檢測，GelRed染色，凝膠成像儀下觀察其條帶直觀檢測其DNA 質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同破壁方法對肺炎鏈球菌全基因組的影響

利用瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA 樣品，結(jié)果如圖1所示。溶菌酶破壁法提取的基因組條帶模糊，拖尾明顯，說明樣品中基因組可能出現(xiàn)降解現(xiàn)象，且有較多的RNA殘留；而DOC提取的肺炎鏈球菌基因組條帶清晰，降解較少。

圖1 不同處理方法對肺炎鏈球菌全基因組的影響Fig.1 The effects of different treatments on Streptococcus pneumoniae genome* “%”為質(zhì)量分?jǐn)?shù);Marker:λ-Hind Ⅲ digest* “%” means mass fraction;Marker:λ-Hind Ⅲ digest

對不同濃度DOC破壁提取的基因組DNA采用NanoDrop2000進(jìn)行定量比較，結(jié)果見圖2，有7株菌株(CMCC(B)31213、CMCC(B)31226、CMCC(B)31540、CMCC(B)31541、CMCC(B)31546、CMCC(B)31547、CMCC(B)31601)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%DOC破壁后提取的基因組DNA的量最大，1株菌株(CMCC(B)31214)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%DOC破壁后提取的基因組DNA量最大(114 ng/μL)，但與1%DOC破壁后提取的基因組DNA的量(103 ng/μL)相差不大。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%DOC破壁來比較DOC處理不同時(shí)間和菌株不同培養(yǎng)時(shí)間對肺炎鏈球菌全基因組DNA的影響。

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)DOC對肺炎鏈球菌基因組濃度的影響Fig.2 The effects of different mass fractions of DOC on Streptococcus pneumoniae genome

2.2 DOC處理不同時(shí)間對肺炎鏈球菌全基因組的影響

DOC處理不同時(shí)間提取的基因組結(jié)果見圖3。2株菌株(CMCC(B)31547、31601)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%DOC處理2 h后提取的基因組濃度到達(dá)峰值，6株菌株(CMCC(B)31213、CMCC(B)31214、CMCC(B)31226、CMCC(B)31540、CMCC(B)31541、CMCC(B)31546)在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%DOC處理3 h后提取的基因組濃度到達(dá)峰值，但與2 h后提取的基因組濃度相差不大。而后提取基因組的濃度隨著時(shí)間的延長而逐漸降低。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%DOC處理2 h來比較菌株不同培養(yǎng)時(shí)間對肺炎鏈球菌全基因組DNA的影響。

圖3 DOC處理不同時(shí)間對肺炎鏈球菌全基因組濃度的影響Fig.3 The effects of different treatment time of DOC on Streptococcus pneumoniae genome

2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間對肺炎鏈球菌全基因組的影響

不同培養(yǎng)時(shí)間肺炎鏈球菌提取的基因組DNA結(jié)果見圖4。在菌株培養(yǎng)18 h前，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，基因組的濃度逐漸增加，在12～16 h提取的基因組DNA條帶清晰，且濃度較好，在18 h時(shí)提取的基因組DNA發(fā)生了嚴(yán)重的降解；而后提取的基因組濃度降低，且存在明顯的降解。說明肺炎鏈球菌在培養(yǎng)12～16 h可以得到濃度高、質(zhì)量好的基因組DNA。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間對肺炎鏈球菌全基因組完整性的影響Fig.4 The effects of different cultural time on Streptococcus pneumoniae genome

3 討 論

隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)等的發(fā)展，國內(nèi)外已完成了多種微生物的全基因組測序，人們從基因水平上對這些微生物有了更深的認(rèn)識(shí)。肺炎鏈球菌是一種能夠引起所有年齡組高發(fā)病率和病死率的致病菌，尤其是兒童和老年人[5]；在發(fā)達(dá)國家仍然是能夠引起高病死率傳染性疾病的少數(shù)幾種細(xì)菌性病原之一[6-7]。深入研究肺炎鏈球菌全基因組序列，將有助于相關(guān)疾病的防治以及疫苗的研發(fā)與質(zhì)量控制。提取高質(zhì)量的基因組DNA已成為獲得準(zhǔn)確全基因組序列的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和首要條件。

革蘭陽性菌提取過程關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于破壁，微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和強(qiáng)度取決于細(xì)胞壁的組成以及它們之間相互交連的程度，破碎細(xì)胞的阻力來自于連接細(xì)胞壁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的共價(jià)鍵[8-9]。溶菌酶主要通過破壞細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1,4 糖苷鍵[10-11]。DOC可使自溶素LytA被激活，水解N-乙酰胞壁酸與丙氨酸之間的連接鍵，從而破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，引起細(xì)菌自溶；而0.1%或更高濃度的膽堿不會(huì)介導(dǎo)LytA活性形式的轉(zhuǎn)換，反而會(huì)以非競爭抑制形式抑制其活性[12]。通過不同處理方法對肺炎鏈球菌基因組DNA的研究表明，溶菌酶破壁法提取的基因組條帶模糊，拖尾明顯，樣品中基因組可能出現(xiàn)降解現(xiàn)象或者是有較多的RNA殘留；而DOC提取的肺炎鏈球菌基因組條帶清晰，降解較少，尤以DOC的終濃度為1%時(shí)，提取的基因組DNA濃度最高。通過DOC處理不同時(shí)間提取的基因組結(jié)果表明，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%DOC處理2～3 h后提取的基因組濃度到達(dá)峰值，而后提取基因組的濃度隨著時(shí)間的延長而逐漸降低；由于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%DOC處理3 h后提取的基因組濃度到達(dá)峰值的菌株與2 h后提取的基因組濃度相差不大，為了節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%DOC處理2 h進(jìn)行基因組DNA的提取。肺炎鏈球菌的培養(yǎng)時(shí)間與基因組的數(shù)量和質(zhì)量也存在密切關(guān)系。在菌株培養(yǎng)12～16 h提取的基因組DNA條帶清晰，且濃度較好，在18 h時(shí)提取的基因組DNA發(fā)生了嚴(yán)重的降解；說明肺炎鏈球菌在培養(yǎng)12～16 h可以得到濃度高、質(zhì)量好的基因組DNA。

綜上所述，菌株培養(yǎng)12～16 h、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%DOC處理2 h能提取出高質(zhì)量的肺炎鏈球菌基因組DNA。該方法是一種較為實(shí)用、經(jīng)濟(jì)、高效的提取肺炎鏈球菌基因組的方法，提取的基因組DNA含量高、純度大，獲得的基因組完整，非常適用于對基因組完整性要求較高的菌株全基因組序列的測定。

[1] Li G, Hu F Z, Yang X, et al. Complete genome sequence ofStreptococcuspneumoniaestrain ST556, a multidrug-resistant isolate from an otitis media patient[J]. J Bacteriol,2012,194(12):3294-3295.

[2] 周美靜，李娟娟，張磊，等. 保定市肺炎鏈球菌基因分型與耐藥性研究[J]. 醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制,2016,(8):854-859.

[3] 陳瓊，李康，徐瀟，等. 應(yīng)用whaF基因序列鑒定20型肺炎鏈球菌血清型[J]. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2016,44(2):16-21.

[4] Perez-Maya A A, Hinojosa-Robles R M, Barcenas-Walls J R, et al. Complete Genome Sequence ofStreptococcuspneumoniaeSerotype 19A, a Blood Clinical Isolate from Northeast Mexico[J]. Genome Announc,2016,4(2): e00195-16.

[5] 王穎童，王茜，張文超，等. 肺炎鏈球菌疫苗在不同年齡組兒童中應(yīng)用價(jià)值分析[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué),2016,23(5):545-547.

[6] Kim S H, Bae I K, Park D, et al. Serotype Distribution and Antimicrobial Resistance ofStreptococcuspneumoniaeIsolates Causing Invasive and Noninvasive Pneumococcal Diseases in Korea from 2008 to 2014[J]. Biomed Res Int,2016，2016(4):1-7.

[7] 楊越，葉強(qiáng). 肺炎鏈球菌分子分型方法研究進(jìn)展[J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2013,(10):789-792.

[8] Morales-Lopez R, Auclair E, Van Immerseel F, et al. Effects of different yeast cell wall supplements added to maize-or wheat-based diets for broiler chickens[J]. Br Poult Sci,2010,51(3):399-408.

[9] 趙宏宇，李珺，趙玥，等. 4種酵母基因組提取方法的比較[J]. 食品科學(xué),2011,32(9):170-173.

[10]謝紅偉. 溶菌酶活力測定方法的改進(jìn)[J]. 食品科學(xué),2003,24(9):119-121.

[11]陳艷，江明鋒，葉煜輝，等. 溶菌酶的研究進(jìn)展[J]. 生物學(xué)雜志,2009,26(2):64-66.

[12]鄒琴，羅紅. 肺炎鏈球菌自溶素LytA研究進(jìn)展[J]. 中國病原生物學(xué)雜志,2014,(1):88-91.

The Effects of Different Treatments on ExtractingStreptococcuspneumoniaeGenome

HUANG Yang, LI Kang, YANG Yue, CHEN Chi, LIANG Li, YE Qiang, CHEN Cui-ping

(ChinaInst.forFood&DrugCtrl.,KeyLab.ofMethod&Standardiz’nforQual.Ctrl.ofBiothech.Products,Minist.ofPublicHealth,Beijing100050)

In order to acquire a convenient and efficient method to extract genome DNA fromStreptococcuspneumoniae, different treatments (lysozyme and sodium deoxycholate, DOC for short) and different treatment time to break cell walls of eight strains of different serotypes, separately. Meanwhile, the effects of different culture time of these strains on extracted genome were investigated. After extracting genome, ultraviolet spectrophotometer was used to test the concentration and purity of genome DNA, and test the quality of genome DNA with agarose gel electrophoresis. The results showed that high-quality genomes ofS.pneumoniaeare extracted when the strains are cultured for 12-16 h and treated with 1% DOC for 2 h. The method is proven to be a practical, economic, efficient method to extractS.pneumoniaegenome. The extracted genome was high content, purity and intact and very suitable for complete genome sequencing.

Streptococcuspneumoniae; genome extraction; different cell wall-breaking methods; different culture time

國家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目(2013ZX09304101)

黃洋 女，博士研究生。主要從事菌種鑒定研究。E-mail：huangyang@nifdc.org.cn

* 通訊作者。男，碩士，主任技師。主要從事疫苗質(zhì)量控制和菌毒種鑒定研究。E-mail:qiangyee@nifdc.org.cn

2016-06-22；

2016-07-11

Q939.93

A

1005-7021(2017)03-0039-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.007